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Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 13798 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Leukapherese, die extrakorporale Trennung weißer Blutkörperchen (WBCs) von roten Blutkörperchen (RBCs) und Blutplättchen (PLTs), ist ein lebensrettendes Verfahren zur Behandlung von Patienten mit Krebs und anderen Erkrankungen sowie als erster Schritt bei der Herstellung von Zell- und genbasierte Therapien. Die Leukapherese wird von Erwachsenen gut vertragen und stellt ein erhebliches Risiko für Neugeborene und Säuglinge mit geringem Körpergewicht dar, da das extrakorporale Volumen (ECV) standardmäßiger zentrifugationsbasierter Geräte einen besonders großen Anteil des gesamten Blutvolumens dieser Patienten ausmacht. Hier beschreiben wir ein neuartiges Mikrofluidikgerät mit hohem Durchsatz (mit einem Hohlraumvolumen von 0,4 ml), das auf der Technologie der kontrollierten inkrementellen Filtration (CIF) basiert und die Zentrifugation zur Durchführung der Leukapherese ersetzen könnte. Das CIF-Gerät wurde ausführlich mit Vollblut von gesunden Freiwilligen bei mehreren Hämatokritwerten (5–30 %) und Flussraten (10–30 ml/min) getestet. Im Durchflussregime trennte das CIF-Gerät Leukozyten mit einer Effizienz von > 85 % und einem Verlust von 10–15 % an Erythrozyten und PLTs, während es mit Kochsalzlösung auf 10 % Hämatokrit verdünntes Vollblut mit einer Durchflussrate von 10 ml/min verarbeitete. Im Rezirkulationsregime zeigte das CIF-Gerät eine ähnliche Trennleistung und reduzierte die Leukozyten im rezirkulierenden Blut praktisch am Ende eines 3,5-stündigen simulierten Leukaphereseverfahrens (ca. 98 % Reduzierung). Wichtig ist, dass das Gerät ohne Verstopfung oder Verschlechterung der Trennleistung funktionierte, mit minimaler Aktivierung von WBCs und PLTs und ohne messbare Schädigung der Erythrozyten. Im Vergleich zu den typischen Parametern der zentrifugationsbasierten Leukapherese hatte das CIF-Gerät ein mindestens 100-fach kleineres Hohlraumvolumen, entfernte WBCs etwa doppelt so schnell und verlor etwa 2–3-fach weniger PLTs, während es mit einer kompatiblen Flussrate betrieben wurde mit der aktuellen Praxis. Der Hämatokritwert und die Durchflussrate, mit denen das CIF-Gerät arbeitete, waren deutlich höher als zuvor für andere mikrofluidische Zellseparationsmethoden veröffentlicht. Schließlich ist diese Studie die erste, die eine hocheffiziente Trennung von Zellen aus rezirkulierendem Blut mithilfe eines Mikrofluidikgeräts demonstriert. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass der Einsatz mikrofluidischer Zelltrennungstechnologie mit hohem Durchsatz machbar ist, um letztendlich eine zentrifugationsfreie Leukapherese mit niedrigem ECV zu ermöglichen. Eine solche Möglichkeit wäre besonders bei kleinen Kindern nützlich, einer gefährdeten Patientengruppe, die derzeit unterversorgt ist.

Leukapherese ist ein komplexes medizinisches Verfahren, bei dem das Blut eines Patienten durch ein Apheresegerät geleitet wird, um weiße Blutkörperchen (WBCs) zu sammeln und rote Blutkörperchen (RBCs) und Blutplättchen (PLTs) an den Patienten zurückzugeben1,2. Die Leukapherese ermöglicht zwei potenziell lebensrettende Anwendungen: Leukodepletion und Leukozytensammlung. Leukodepletion kann zur Reduzierung einer gefährlich hohen Leukozytenzahl bei Patienten mit Leukämie3,4 oder zur Entfernung aktivierter Leukozyten als medikamentenfreie Behandlung entzündlicher Darmerkrankungen5,6,7 und anderer Erkrankungen8,9 eingesetzt werden. Die Sammlung von Leukozyten mittels Leukapherese ist der erste Schritt bei der Herstellung einer breiten Palette von Zelltherapien2, darunter Granulozyteninfusionen10,11, adoptive Immuntherapien12,13,14,15, hämatopoetische Stammzelltransplantation16,17,18 und neuartige genbasierte Behandlungen19,20 .

Obwohl die Durchführung der Leukapherese bei Neugeborenen und Säuglingen mit geringem Körpergewicht im Allgemeinen von Erwachsenen und älteren Kindern gut vertragen wird, ist sie technisch anspruchsvoll und klinisch riskant. Derzeit wird die Leukapherese mit zentrifugationsbasierten Apheresegeräten durchgeführt, die ein erhebliches extrakorporales Volumen (ECV) aufweisen, das typischerweise zwischen 150 und 250 ml liegt (ohne zusätzliche Schläuche zum Anschluss an den Patienten)2,21, während das Gesamtblutvolumen (TBV) bei 150–250 ml liegt Ein 10 kg schwerer Säugling wiegt nur etwa 750 ml22,23. Da das ECV einen so großen Teil ihres TBV ausmacht, kommt es bei pädiatrischen Patienten deutlich häufiger zu schwerwiegenden Komplikationen im Zusammenhang mit dem Leukaphereseverfahren, darunter Hypotonie, symptomatische Hypokalzämie, allergische Reaktionen, katheterbedingte Thrombose, Infektionen, schwere Anämie und sogar Tod21 ,24,25,26,27,28. Im Prinzip können WBCs auch mit einem normalen Leukoreduktionsfilter29,30 oder einer mit Celluloseacetatkügelchen gefüllten Säule abgetrennt werden, die aktivierte Granulozyten und Monozyten selektiv adsorbiert6. Allerdings ist die Trennkapazität dieser Geräte durch ihre physikalische Größe begrenzt, die von den Geräten eingefangenen Leukozyten geben weiterhin proinflammatorische Zytokine in den Blutkreislauf ab und die Rückgewinnung der eingefangenen Leukozyten durch Rückspülung ist eher bescheiden6,29,30.

Der früheste Versuch, die Leukapherese mithilfe von Mikrofluidik zu miniaturisieren, nutzte einen Diffusionsfilter mit kontinuierlichem Durchfluss, um Leukozyten mit hoher Effizienz (~ 97 %) aus einer Blutprobe zu entfernen, allerdings mit einem erheblichen Erythrozytenverlust (~ 50 %) und einer Durchflussrate von nur 5 µL/min31. Seitdem hat der Einsatz mikrofluidischer Technologien zur Blutzelltrennung (wenn auch nicht speziell für die Leukapherese) stetig zugenommen32. Geräte, die auf „Trägheitsfokussierung“33,34 basieren, können die Zelltrennung bei relativ hohen Flussraten (1–20 ml/min) durchführen, erfordern jedoch eine erhebliche Verdünnung der Blutprobe (< 1 % Hämatokrit, HCT)35,36,37. Geräte, die auf der „deterministischen lateralen Verschiebung“ (DLD)38 basieren, erfordern eine deutlich geringere Verdünnung, haben aber äußerst kleine minimale Strukturgrößen (< 5 µm), erfordern mehrere Pumpen und extrem hohe Antriebsdrücke, um bei angemessenen Flussraten zu arbeiten (< 7 ml/min). ) und setzen Zellen häufig einer Scherbelastung aus, die ausreichend hoch ist, um PLT und den von Willebrand-Faktor zu aktivieren39,40,41,42. Die „kontrollierte inkrementelle Filtration“ (CIF) überwand diese Einschränkungen durch eine wesentlich größere minimale Strukturgröße (~ 20 µm) und reduzierte so den Flüssigkeitswiderstand und die Scherung im gesamten Gerät43,44. Infolgedessen war ein CIF-basiertes Gerät in der Lage, > 85 % der Leukozyten (mit < 30 % Verlust an Erythrozyten und PLTs) aus den mononukleären Zellkonzentraten (MNC) (~ 5 % HCT) bei Durchflussraten von bis zu 30 zu trennen ml/min46 und mit CIF konzentrierte und leukoreduzierte PLTs wurden minimal aktiviert43,44. Ungeachtet dieser bedeutenden Fortschritte wurde keines der oben genannten Geräte über einen längeren Zeitraum im Rezirkulationsregime getestet, und die Auswirkungen einer solchen Verarbeitung auf Blutzellen und die Geräteleistung sind nach wie vor weitgehend unbekannt.

In dieser Studie beschreiben wir ein neues CIF-basiertes Gerät mit einem Hohlraumvolumen von nur 0,4 ml, das für die Hochdurchsatz-Trennung von Leukozyten aus minimal verdünntem, rezirkulierendem Vollblut konzipiert ist. Wir haben zunächst die Trennleistung des Geräts im Durchflussmodus getestet und dabei mehrere Variablen unabhängig voneinander angepasst: HCT (5–30 %), Filtrat:Retentat-Durchflussverhältnis (2–13:1) und Durchflussrate (10–30 ml). /Mindest). Das Gerät zeigte bei der Verarbeitung von verdünntem Vollblut mit 10 % HCT bei einer Flussrate von 10 ml/min eine Effizienz von > 85 % bei der Leukozytenentfernung (mit nur 10–15 % Verlust an Erythrozyten und PLTs). Beim Test im Rezirkulationsregime funktionierte das Gerät ohne Verstopfung oder Verschlechterung der Trennleistung, mit minimaler Aktivierung von Leukozyten und PLTs und ohne messbare Schädigung der Erythrozyten über die gesamte Dauer eines 3,5-stündigen simulierten Leukaphereseverfahrens. Die WBC-Konzentration im rezirkulierenden Blut sank exponentiell und sank bis zum Ende des Eingriffs um etwa 98 %.

Das Funktionsprinzip der kontrollierten inkrementellen Filterung (CIF) und der Rechenrahmen, der zur Generierung von CIF-basierten Geräteentwürfen verwendet wird, wurden bereits ausführlich beschrieben43,44. Ein typisches CIF-Design besteht aus drei kollinearen Strömungskanälen, die durch eine Reihe „pillenförmiger“ Pfosten getrennt sind, die die Filterspalte definieren, die den zentralen und die seitlichen Kanäle strömungstechnisch verbinden (Abb. 1). Während die Blutprobe durch den zentralen Kanal fließt, wird ein kleiner Teil dieses Flusses durch jeden Filterspalt in die Seitenkanäle abgesaugt. Die Breite der Seitenkanäle nimmt allmählich zu, um den Filtratzufluss aufzunehmen. Die Geschwindigkeit dieses Anstiegs wird wie zuvor beschrieben43 berechnet, um den durch jeden Spalt entnommenen Durchflussanteil genau zu steuern. Es ist die Größe dieses Flussanteils – nicht die Breite der Lücken –, die den Größengrenzwert für die Zellen bestimmt, die zu groß sind, um vom Filtrat in die Seitenkanäle gezogen zu werden („kritischer Durchmesser“). Der kritische Durchmesser des in dieser Studie verwendeten CIF-Designs betrug 6 µm, um die meisten Leukozyten im zentralen Kanal zurückzuhalten und gleichzeitig den ungehinderten Abfluss von Erythrozyten und PLTs in die Seitenkanäle zu ermöglichen (Abb. 1). Da der durch jeden Spalt extrahierte Durchflussanteil relativ gering ist, muss jedes CIF-Design Tausende von Lücken umfassen, um das gewünschte Filtrat-Retentat-Durchflussverhältnis zu erreichen43,44. In der Praxis ist die Anzahl der Filterspalten (und damit das Durchflussverhältnis) durch die maximale Kanallänge begrenzt, die die Herstellungstechnik zulässt44,46.

Die Trennung von Leukozyten von Erythrozyten und PLTs mittels kontrollierter inkrementeller Filtration (CIF). Die meisten weißen Blutkörperchen sind zu groß, um vom Filtrat in die Seitenkanäle gezogen zu werden, und werden daher im zentralen Kanal zurückgehalten und konzentriert. Erythrozyten und PLTs sind kleiner als der kritische Durchmesser des Geräts und werden daher entsprechend dem Durchflussverhältnis des Geräts zwischen dem Filtrat und dem Retentat verteilt.

Das CIF-Gerät bestand aus einem Array von 48 einzelnen CIF-Elementen, die parallel gemultiplext waren (Abb. 2). Jedes CIF-Element hatte eine Gesamtfläche von 1,4 mm × 73 mm und bestand aus (Abb. 2a): (i) einem eingebauten Filter zum Zurückhalten von Mikroaggregaten und anderen Ablagerungen, die möglicherweise in der Blutprobe vorhanden sind, (ii) einem Übergang Region, in der jeder Seitenkanal aus einer Reihe zunehmend kürzerer Serpentinensegmente bestand, um sicherzustellen, dass der entsprechende Strömungsanteil extrahiert wurde, während die minimale Strukturgröße bei ~ 20 µm44 beibehalten wurde, und (iii) ein linearer Trennbereich (~ 61 mm lang), in dem die Breite Die Breite der Seitenkanäle nahm zunehmend zu und die Breite des Mittelkanals nahm über seine gesamte Länge ab. Eine Reihe von Durchgangslöchern in der Geräteschicht ermöglichten den Fluidzugang zum gemeinsamen Einlass und den Auslässen aller CIF-Elemente. Die Ausgänge der zentralen Kanäle wurden über ein Netzwerk großer Kanäle in der separaten oberen Schicht gesammelt (Abb. 2b). Ein vollständig zusammengebautes CIF-Gerät hatte einen Einlass, durch den die Blutprobe an jedes CIF-Element des Geräts verteilt wurde, und zwei Auslässe zum Sammeln der Ausgänge der zentralen Kanäle (Retentat) und Seitenkanäle (Filtrat) aller CIF-Elemente (Abb. 2c). Das Hohlraumvolumen des Multiplex-CIF-Geräts betrug 0,4 ml, ohne den Schlauch (Abb. 2c).

CIF-basiertes Mikrofluidikgerät. (a) Design des CIF-Elements. Breite des Seitenkanals in der Nähe des Einlasses ws(in) = 21 µm und in der Nähe des Auslasses ws(out) = 154 µm. Breite des zentralen Kanals in der Nähe des Einlasses wc(in) = 120 µm und in der Nähe des Auslasses wc(out) = 70 µm. Filterspaltbreite g = 19 µm. Die Tiefe aller Kanäle beträgt durchgehend 140 µm. (b) Komponenten des gemultiplexten CIF-Geräts: (i) eine „obere Schicht“, die ein System größerer Kanäle zum Sammeln des zentralen Kanalausgangs (Retentat) von jedem CIF-Element des Geräts enthält, (ii) eine „Geräteschicht“, bestehend aus aus einzelnen CIF-Elementen, die parallel angeordnet sind, und (iii) ein flaches Substrat zum Abdichten der Kanäle des Geräts. (c) Ein zusammengebautes Mikrofluidikgerät, bestehend aus 48 gemultiplexten CIF-Elementen, gefüllt mit einer 10 %igen HCT-Blutprobe. Der Maßstabsbalken beträgt 1 cm.

Wir haben zunächst die Auswirkung von HCT-Proben auf die Leistung des CIF-Geräts getestet. Die Effizienz der WBC-Entfernung war bei der Probe mit 10 % HCT am höchsten (88,4 ± 1,3 %) und nahm mit steigendem HCT der Probe ab (Abb. 3a). Bei Proben mit 20 % HCT war das CIF-Gerät in der Lage, 57 ± 7 % der Leukozyten zu entfernen, die ursprünglich im durch das Gerät fließenden Blut vorhanden waren. Die prozentuale Entfernung (Verlust) von Erythrozyten und PLTs nahm mit steigendem HCT geringfügig zu, von 10,6 ± 0,9 % für Erythrozyten und 9,1 ± 0,5 % für PLTs bei 5 % HCT auf 14,8 ± 0,1 % für Erythrozyten und 14,1 ± 0,5 % für PLTs bei 30 % HCT (Abb. 3a). Wie für Zellen zu erwarten, die kleiner als der kritische Durchmesser des Geräts sind, entsprachen die prozentualen RBC- und PLT-Verluste weitgehend den Werten, die auf der Grundlage des Durchflussverhältnisses des Geräts vorhergesagt wurden, d. h. 100/(1 + Durchflussverhältnis) (Abb. 3a, gestrichelte Linie).

Leistung des CIF-Geräts im Durchflussregime. Abhängigkeit der Zellentfernung von (a) Proben-HCT (10 ml/min Flussrate, n = 3), (b) Geräteflussverhältnis (10 % HCT, 10 ml/min Flussrate, n = 5) und (c) Durchflussrate (10 % HCT, n = 3). In den Feldern (a) und (c) wurde das Durchflussverhältnis auf 8,70 ± 0,39 bzw. 8,21 ± 0,13 eingestellt und dann je nach Parameter des Experiments geändert. In jedem Feld zeigt eine gestrichelte Linie die erwartete prozentuale Entfernung für Zellen an, die kleiner als der kritische Durchmesser des Geräts sind, der auf der Grundlage des in jedem Experiment gemessenen Durchflussverhältnisses berechnet wurde. Die angezeigten Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung.

Ein CIF-Gerät ist für ein bestimmtes Durchflussverhältnis ausgelegt, vorausgesetzt, dass an den Geräteausgängen der gleiche Druck herrscht. Um das Durchflussverhältnis in Echtzeit zu steuern, haben wir einen Druckunterschied zwischen den Auslässen erzeugt, indem wir die relativen Höhen der Behälter variierten, in denen Retentat und Filtrat gesammelt wurden. Das tatsächliche Durchflussverhältnis, mit dem das Gerät betrieben wurde, wurde dann berechnet, indem einfach das Volumen des Filtrats durch das Volumen des vom Gerät pro Zeiteinheit gesammelten Retentats dividiert wurde. Diese einfache Manipulation ermöglichte es uns, das Durchflussverhältnis in einem weiten Bereich anzupassen (~ sechsfach, Abb. 3b). Niedrigere Flussverhältnisse waren mit einer höheren WBC-Entfernung verbunden, die bei allen Flussverhältnissen bis zu ~ 9 konstant über 80 % blieb (84 ± 3 % bei einem Flussverhältnis von 8,9 ± 1,5). Die Entfernung (der Verlust) von Erythrozyten und PLTs folgte der erwarteten reziproken Abhängigkeit vom Flussverhältnis (Abb. 3b, gestrichelte Linie) und nahm bei einem Flussverhältnis von 1,9 ± 0,1 schnell von 37,5 ± 0,8 % für Erythrozyten und 36,1 ± 2,4 % für PLTs ab (34 % erwarteter Verlust) auf 10,9 ± 1,4 % für Erythrozyten und 11,4 ± 1,1 % für PLTs bei einem Durchflussverhältnis von 8,9 ± 1,5 (10 % erwarteter Verlust) und weiter auf 8,2 ± 0,9 % für Erythrozyten und 7,9 ± 1,4 % für PLTs bei einem Durchflussverhältnis von 12,6 ± 2,1 (7 % erwarteter Verlust) (Abb. 3b). Angesichts der starken Abhängigkeit des RBC- und PLT-Verlusts vom Durchflussverhältnis des Geräts könnte die Möglichkeit, das Durchflussverhältnis in Echtzeit anzupassen, nützlich sein, um Schlüsselparameter des Leukaphereseverfahrens (z. B. WBC-Entfernung, RBC- und PLT-Verlust) an die anzupassen individuelle Bedürfnisse einzelner Patienten.

Wir haben außerdem die Trenneffizienz des CIF-Geräts bei Flussraten im Bereich von 10 bis 30 ml/min bewertet (Abb. 3c). Die Leukozytenentfernung nahm mit zunehmender Flussrate allmählich ab, von 88,0 ± 2,5 % bei 10 ml/min auf 81,0 ± 1,4 % bei 30 ml/min. Das Flussverhältnis des Geräts sank ebenfalls von 8,21 ± 0,13 bei 10 ml/min auf 4,00 ± 0,03 bei 30 ml/min (Abb. 3c). Dieser Rückgang wurde durch die Verzerrung der CIF-Kanalgeometrie (Ausbeulung) aufgrund der elastischen Verformung von PDMS bei höheren Antriebsdrücken/Durchflussraten verursacht, wie wir zuvor bei ähnlichen Geräten beobachtet haben46. Folglich stieg der Erythrozyten- und PLT-Verlust von 12,0 ± 1,1 % für Erythrozyten und 13,1 ± 1,5 % für PLTs bei 10 ml/min auf 19,4 ± 0,6 % für Erythrozyten und 18,0 ± 2,0 % für PLTs bei 30 ml/min und folgte damit dem Trend aufgrund des Strömungsverhältnisses zu erwarten (Abb. 3c, gestrichelte Linie).

Als nächstes testeten wir das CIF-Gerät im Rezirkulationsregime unter Verwendung der Betriebsparameter (Durchflussrate, Durchflussverhältnis, Proben-HCT), die die Geräteleistung in den Durchflussexperimenten maximierten. In unserem Rezirkulationsaufbau (Abb. 4a) wurde ein mit 179,7 ± 0,8 ml verdünntem WB (10 % HCT) gefüllter Blutbeutel verwendet, um den TBV eines Probanden zu emulieren. Während jeder Rezirkulationsrunde wurden 56,5 ± 0,8 ml der Blutprobe aus dem Beutel entnommen (über ein Schlauchstück, das bis zum Boden des Beutels durch eine seiner Probenöffnungen eingeführt wurde) und dann bei a durch das CIF-Gerät geleitet Flussrate von 10 ml/min. Das Retentat (5,6 ± 0,5 ml pro Runde) wurde in einem konischen Rohr gesammelt, das über das CIF-Gerät angehoben wurde, um das gewünschte Durchflussverhältnis von 8,8 ± 0,3 zu erzeugen (Abb. 4a). Um das Durchflussverhältnis für ein im Rezirkulationsmodus arbeitendes Gerät zu berechnen, wurde das Filtratvolumen als Differenz zwischen dem durch das Gerät gedrückten Volumen und dem pro Rezirkulationsdurchgang im Abfallreservoir gesammelten Retentatvolumen geschätzt. Das Filtrat wurde durch die andere Probenahmeöffnung an der Oberseite des Beutels in den Beutel zurückgeführt, um den „Einlass“ und „Auslass“ des Blutes effektiv auf den gegenüberliegenden Seiten des Beutels zu platzieren und so die Vermischung zu fördern. Darüber hinaus wurde der Blutbeutel während und nach jeder Rezirkulationsrunde gemischt, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen im Beutel sicherzustellen. Dieser „Entzug-Infusion“-Zyklus wurde 12 Mal über einen Zeitraum von ca. 3,5 Stunden wiederholt. Nach Abschluss jeder Runde wurde eine 0,2-ml-Probe aus dem Beutel (über das Probenahmeventil) und dem Retentat für Messungen entnommen. Die Volumina des Retentats und jeder entnommenen Probe wurden aufgezeichnet, um die Volumenänderung des Blutbeutels nach jedem Umlauf zu verfolgen.

Entfernung von Leukozyten aus dem Blut während der Rezirkulation. (a) Versuchsaufbau für die Rezirkulationsexperimente. Der Blutbeutel wurde mit 179,7 ± 0,8 ml WB gefüllt, verdünnt auf 10 % HCT mit normaler Kochsalzlösung. Der Abfallbehälter, der das Retentat (konzentrierte WBCs) auffängt, wurde 55 cm über dem Gerät platziert; Das resultierende Gerätedurchflussverhältnis betrug 8,8 ± 0,3. Bei jeder Rezirkulationsrunde wurden 56,5 ± 0,8 ml der Probe aus dem Beutel entnommen und dann mit einer Flussrate von 10 ml/min durch das CIF-Gerät infundiert, wobei 5,6 ± 0,5 ml Retentat (Abfall) erzeugt wurden. Mit einer 1-ml-Spritze wurde eine Blutprobe aus dem Beutel entnommen. Pfeile geben die Richtung des Blutflusses im Kreislauf an. (b) Änderungen der Zellkonzentrationen nach jeder Runde der CIF-basierten Zelltrennung im Rezirkulationsregime. Die angezeigten Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung (n = 9, unter Verwendung von Blut von 6 einzelnen Probanden). Durchgezogene Linien sind lineare Anpassungen für Volumen (y = − 0,0608x + 1,7975, R2 = 0,9997), Erythrozyten (y = − 0,0044x + 1,1037, R2 = 0,8218) und PLTs (y = − 0,0059x + 0,6072, R2 = 0,8485). und ein Modell, das für Leukozyten geeignet ist (mit einer Leukozytenentfernung von 81 %, was den quadratischen Mittelwertfehler minimiert).

Die Konzentration der Leukozyten im Blutbeutel nahm während des Rezirkulationsversuchs exponentiell ab (Abb. 4b). Nach 3 Rezirkulationsrunden (~ 170 ml verarbeitetes Volumen) sank die WBC-Konzentration um 55 %, von 1,59 ± 0,41 × 103/µL in der ursprünglichen Probe auf 0,72 ± 0,26 × 103/µL. In Runde 6 (~ 340 ml verarbeitetes Volumen) sank die WBC-Konzentration weiter auf 0,28 ± 0,15 × 103/µL (82 % Rückgang gegenüber dem Ausgangswert). Am Ende des Rezirkulationsexperiments (Runde 12, ca. 680 ml verarbeitetes Volumen) waren die WBCs im Beutel praktisch aufgebraucht (ca. 98 % Rückgang gegenüber dem Ausgangswert). Die Konzentration von Erythrozyten und PLTs nahm über die gesamte Dauer des Rezirkulationsversuchs linear ab (Abb. 4b): um ~ 4,5 % für Erythrozyten (von 1,09 ± 0,03 × 106/µL auf 1,04 ± 0,05 × 106/µL; y = − 0,0044). x + 1,1037, R2 = 0,8218) und um ~ 14,5 % für PLTs (von 0,62 ± 0,07 × 105/µL auf 0,53 ± 0,06 × 105/µL; y = − 0,0059x + 0,6072, R2 = 0,8485). Zellen, die kleiner als der kritische Durchmesser des CIF-Geräts sind, verteilen sich entsprechend dem Durchflussverhältnis und daher sollte ihre Konzentration sowohl im Filtrat als auch im Retentat gleich sein. Daher untersuchten wir die Auswirkung der Blutzirkulation durch das CIF-Gerät auf die Eigenschaften von Blutzellen.

Wir verwendeten bildgebende Durchflusszytometrie (FC), um die Aktivierung von Leukozyten (CD11b) und PLTs (CD62P) sowie die Bildung von PLT-WBC-Aggregaten für Proben zu messen, die vor (Runde 0), während (Runde 6) und unmittelbar nach (Runde 6) aus dem Beutel entnommen wurden ( Runde 12) die Rezirkulationsversuche (Abb. 5). Die Aktivierung der abgetrennten WBCs (Retentatausstoß) wurde während (Runde 6) und nach (Runde 12) des Experiments gemessen. Darüber hinaus wurde in vier von fünf Rezirkulationsexperimenten eine Blutprobe der Probanden für die Dauer des Experiments auf der Tischplatte (BT) aufbewahrt, um zu verhindern, dass die Aktivierung von WBCs und PLTs einfach über längere Zeit bei Raumtemperatur gelagert wurde Zeitraum. Alle Proben wurden im Ruhezustand (wie gesammelt) und nach Inkubation entweder mit Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA; für WBCs, Abb. 5a, b) oder Thrombinrezeptor-Agonist Peptid-6 (TRAP; für PLTs und PLT-WBC) getestet Aggregate, Abb. 5c, d), um zu bewerten, wie sich die CIF-Rezirkulation auf die Fähigkeit von WBCs und PLTs auswirkt, als Reaktion auf relevante Reize aktiviert zu werden.

Auswirkung der CIF-Verarbeitung im Rezirkulationsregime auf den Aktivierungszustand von WBCs und PLTs. (a) Aktivierung der im rezirkulierenden Blut verbleibenden Leukozyten (CD11b). (b) Aktivierung von WBCs (CD11b), die mit dem Retentat (Abfall) entfernt wurden. (c) Aktivierung rezirkulierender PLTs (CD62P). (c) Bildung von PLT-WBC-Aggregaten im rezirkulierenden Blut. Die Messungen wurden mittels Durchflusszytometrie für Proben durchgeführt, die vor (Runde 0), während (Runde 6) und nach (Runde 12) des Rezirkulationsexperiments gesammelt wurden, sowohl im Ruhezustand als auch nach zusätzlicher Aktivierung mit PMA (Panels a und b) oder TRAP (Panels). CD). BT (rote Symbole) stellen Blutproben dar, die für die Dauer jedes Rezirkulationsexperiments reserviert wurden, um den Einfluss der Zeit allein auf die Zellaktivierung zu beurteilen. Die statistische Signifikanz wird für p < 0,05 mit * bezeichnet. Jedes Symbol stellt ein anderes Rezirkulationsexperiment dar (n = 5, mit Blut von 4 einzelnen Probanden).

WBCs im rezirkulierenden Blut werden zunehmend stärker aktiviert, aber am Ende des Rezirkulationsexperiments (nach Runde 12) waren sie nicht stärker aktiviert als die BT-Kontrolle (Abb. 5a). Mit dem Retentat entfernte Leukozyten waren etwa so aktiviert wie die im rezirkulierenden Blut verbliebenen Leukozyten, und es gab keinen signifikanten Unterschied in der Aktivierung zwischen den in den Runden 6 und 12 extrahierten Zellen (Abb. 5b). Sowohl rezirkulierende als auch entfernte WBCs konnten nach der Inkubation mit PMA (Positivkontrolle) deutlich stärker aktiviert werden, unabhängig davon, wann während des Rezirkulationsexperiments Proben entnommen wurden, was darauf hindeutet, dass die Zellen nach der Verarbeitung nicht refraktär wurden (Abb. 5a, b).

Trotz der potenziellen Wirkung der Scherung auf PLTs nahm die Aktivierung von PLTs im rezirkulierenden Blut über die gesamte Dauer des Experiments nicht signifikant zu. Nach 12 Runden der Rezirkulation durch das CIF-Gerät war der Grad der PLT-Aktivierung ähnlich dem der BT-Kontrolle (Abb. 5c). Eine geringe Aktivierung könnte durch die Feuerfestigkeit des PLT verursacht werden, was nicht der Fall war, da rezirkulierende PLTs bei Exposition gegenüber TRAP (Positivkontrolle) eine signifikante Aktivierung auslösen konnten (Abb. 5c). Angesichts der hohen Empfindlichkeit von PLTs gegenüber Scherkräften und unserer zuvor veröffentlichten Ergebnisse mit ähnlichen CIF-Geräten43,44,45 erwarteten wir, zumindest einen gewissen Anstieg der Aktivierung rezirkulierender PLTs zu beobachten. Eine mögliche Erklärung ist, dass die meisten der aktivierten PLTs sofort an die verfügbaren WBCs gebunden wurden, um PLT-WBC-Aggregate zu bilden. Tatsächlich stieg die Anzahl der PLT-WBC-Aggregate im Laufe der Zeit bei jedem Rezirkulationsexperiment stetig und signifikant an (Abb. 5d). An den PLT-WBC-Aggregaten beteiligte PLTs werden bei der Messung der PLT-Aktivierung und -Anzahl ausgeschlossen, was erklären kann, dass die Aktivierung rezirkulierender PLTs relativ niedrig bleibt (Abb. 5c) und ihre Konzentration im Laufe der Zeit allmählich abnimmt (Abb. 4b). Insgesamt war die Anzahl der PLT-WBC-Aggregate im rezirkulierenden Blut nach 12 Rezirkulationsrunden dieselbe wie in der BT-Kontrolle (Abb. 5d), was darauf hindeutet, dass der Anstieg wahrscheinlich auf die Verarbeitungsdauer und den Beitrag des CIF-Geräts zurückzuführen war relativ gering. Daraus folgt weiter, dass eine mögliche Lösung zur Minimierung der Zellaktivierung und der Bildung von PLT-WBC-Aggregaten darin bestünde, die Verarbeitungsdauer zu verkürzen, indem entweder der volumetrische Durchsatz (z. B. durch zusätzliches Multiplexing) oder die Trenneffizienz (z. B. durch zusätzliche Designverbesserungen) erhöht wird das Gerät.

Schließlich testeten wir, ob die Rezirkulation durch das CIF-Gerät die Erythrozyten schädigte, indem wir vor (Runde 0), während (Runde 6) und unmittelbar nach (Runde 12) jedes Experiments den Gehalt an freiem Hämoglobin (Hb) und Kalium maßen. Wir haben zuvor dieselben Tests eingesetzt, um subletale Schäden, die durch Zentrifugation an gelagerten Erythrozyten während des Waschens verursacht wurden, empfindlich zu identifizieren47,48. Während des CIF-Rezirkulationsverfahrens beobachteten wir keine signifikanten Veränderungen der freien Hb-Werte und die Kaliumwerte blieben in allen Proben unter dem nachweisbaren Wert (< 0,2 mM) (Tabelle S1). Da keine Anzeichen einer Hämolyse vorliegen, ist die wahrscheinlichste Erklärung für den beobachteten Rückgang der Erythrozytenkonzentration im rezirkulierenden Blut (Abb. 4b), dass mit dem Retentat eine übermäßige Anzahl an Erythrozyten entfernt wurde. Tatsächlich war die RBC-Konzentration im Retentat (Abfall) durchweg höher als im rezirkulierenden Blut (Abb. 4b), im Durchschnitt um etwa 0,1 × 106/µL (Tabelle S2). Wie in unserer früheren Studie besprochen, in der wir bei der Verarbeitung von Leukaphereseproben eine ähnliche Ansammlung von Erythrozyten im Retentat beobachteten46, handelt es sich bei Erythrozyten um stark verformbare bikonkave Scheiben (ca. 8 µm Durchmesser und nur ca. 2 µm Dicke), weshalb ihr effektiver Durchmesser stark variieren kann Abhängig von den spezifischen Bedingungen in der Nähe jedes Filterspalts. Die meisten Erythrozyten haben einen effektiven Durchmesser, der klein genug ist, um dem Filtrat zu folgen, einige jedoch nicht und neigen daher dazu, im zentralen Kanal zu bleiben, was zu der charakteristischen Ansammlung führt46.

Herkömmliche Apheresegeräte nutzen die Zentrifugation, um Leukozyten von Erythrozyten und PLTs zu trennen, was den Grad begrenzt, in dem der ECV des Leukapheresekreislaufs reduziert werden könnte, um den Bedürfnissen pädiatrischer Patienten gerecht zu werden. Das Hohlraumvolumen des in dieser Studie beschriebenen CIF-Geräts (0,4 ml) war mindestens 100-fach kleiner als das eines typischen zentrifugationsbasierten Apheresegeräts (150–250 ml)49. Diese dramatische Reduzierung des ECV stellt den Hauptvorteil der mikrofluidischen Zelltrennung dar, um letztendlich ein sicheres und wirksames Leukaphereseverfahren bei kleinen Kindern zu ermöglichen. Diese Studie baut auf unseren früheren CIF-Entwürfen46 auf, um eine völlig neue, viel anspruchsvollere Anwendung in Angriff zu nehmen als die, die wir zuvor untersucht haben. Zum ersten Mal wird gezeigt, dass ein CIF-Mikrofluidikgerät in der Lage ist, WBCs aus verdünntem Vollblut mit einer Effizienz von > 80 % zu trennen, während es im Rezirkulationsregime für > 3 Stunden betrieben wird, ohne dass die Trennleistung merklich nachlässt und die Zelleigenschaften nur minimal beeinträchtigt werden. Darüber hinaus funktionierte das aktuelle Gerät optimal bei einem HCT, der zwei Mal höher war, und einem RBC- und PLT-Verlust, der zwei bis drei Mal niedriger war als in allen unseren vorherigen Berichten46.

Pädiatrische Patienten, die sich einer Leukapherese zur Leukodepletion oder Zellansammlung unterziehen, sind typischerweise anämisch, mit einem durchschnittlichen HCT von 20–30 %49,50. Bei 20 % HCT hatte das CIF-Gerät eine WBC-Entfernungseffizienz von etwa 60 %, was für einige Patienten ein akzeptables Leistungsniveau sein kann. Um den aktuellen CIF-Geräteprototyp mit maximaler Trenneffizienz (WBC-Entfernung > 80 %) zu betreiben, müsste das Blut vor dem Eintritt in das Gerät auf 10 % HCT verdünnt und dann wieder auf seinen nativen HCT konzentriert werden, bevor es zum Patienten zurückgeführt wird. Eine solche Hämokonzentration wird routinemäßig während des kardiopulmonalen Bypasses bei Kindern und der extrakorporalen Membranoxygenierung durchgeführt, um überschüssige Flüssigkeiten zu entfernen. Dabei werden Geräte mit ausgezeichneter Biokompatibilität und minimalem Hohlraumvolumen (z. B. 8 ml, Hemocor HPH Junior, Minntech Corp., Minneapolis, MN) bei kompatiblen Flussraten verwendet Leukapherese (bis zu 100 ml/min)51. Der Rückgang der Trennleistung des Geräts bei höheren HCTs könnte durch die zunehmende Anzahl stochastischer Zell-Zell-Wechselwirkungen und die Abweichung der scheinbaren Viskosität des Bluts in den Kanälen von dem Modell, das wir bei der Entwicklung des Geräts verwendet haben, erklärt werden stärker ausgeprägt mit steigendem HCT46,52,53. Um die Effizienz der CIF-Trennung bei höheren HCTs weiter zu steigern, sind weitere Forschungsarbeiten zur Bewältigung dieser Faktoren erforderlich.

Die Flussrate, bei der das CIF-Gerät in unserer Studie mit maximaler Trennleistung arbeitete (10 ml/min), ist ähnlich wie bei klinischen Leukaphereseverfahren, die typischerweise bei 10–50 ml/min durchgeführt werden1,17,54. Der beobachtete Rückgang der Trenneffizienz bei höheren Durchflussraten war wahrscheinlich auf die Verformung (Ausbeulung) der Gerätekanäle bei höheren Antriebsdrücken zurückzuführen, wie wir zuvor bei ähnlichen Geräten beobachtet haben46. Dieser Effekt könnte minimiert werden, indem CIF-Geräte letztendlich aus harten Thermoplasten anstelle des in dieser Studie verwendeten PDMS-Elastomers hergestellt würden39,40,55.

Der HCT (10 %) und die Flussrate (10 ml/min), bei denen das CIF-Gerät mit optimaler Leistung arbeitete, waren deutlich höher als zuvor für andere mikrofluidische Geräte berichtet, die zur Trennung von WBCs aus minimal verdünntem Vollblut entwickelt wurden39,40,42,56 ,57,58,59,61. Wichtig ist, dass diese Studie die erste war, die ein mikrofluidisches Gerät demonstrierte, das in der Lage ist, Zellen hocheffizient vom Blut zu trennen, während es im Rezirkulationsregime arbeitet, im Gegensatz zum Durchflussregime, das bei allen anderen mikrofluidischen Zellseparationsgeräten verwendet wird32.

Die Rezirkulation wurde in dieser Studie mithilfe einer Spritzenpumpe durchgeführt, die so programmiert war, dass sie während der gesamten Dauer des Eingriffs mehrere „Entnahme-Infusions“-Zyklen durchlief. Ein solcher Rezirkulationsansatz ähnelt stark dem Betrieb eines Apheresegeräts im diskontinuierlichen Modus, der typischerweise für größere ECV- oder länger dauernde Eingriffe eingesetzt wird1,49, oder der manuellen Austauschtransfusion, die manchmal bei kleinen Kindern durchgeführt wird, wenn die zentrifugationsbasierte Leukapherese aufgrund von als zu riskant angesehen wird der hämodynamische Status eines Patienten, ein relativ kleines TBV im Vergleich zum ECV des Kreislaufs und/oder die Fähigkeit, einen Katheter geeigneter Größe zu platzieren28,62. Bemerkenswerterweise war das CIF-Gerät in der Lage, Blut ohne Anzeichen einer Verstopfung zu verarbeiten und gleichzeitig seine Trenneffizienz für > 3 Stunden beizubehalten, was der typischen Dauer eines herkömmlichen Leukaphereseverfahrens entspricht1,17,54,62. Diese Erkenntnis ist besonders bedeutsam, da jedes für die Leukapherese vorgesehene Gerät in der Lage sein muss, rezirkulierendes Blut über einen längeren Zeitraum zu verarbeiten.

Im Zusammenhang mit der Leukoreduktion würde die herkömmliche Leukapherese auf Zentrifugationsbasis die Leukozytenkonzentration bei der Verarbeitung von 1–2 TBV50 typischerweise um etwa ein Drittel und bei der Verarbeitung von 2–3 TBV63 um etwa die Hälfte reduzieren. Das CIF-Gerät konnte die WBC-Konzentration im rezirkulierenden Blut etwa doppelt so schnell reduzieren – um die Hälfte nach der Verarbeitung von nur einem TBV und um vier Fünftel nach der Verarbeitung von zwei TBV. Aus klinischer Sicht ist die Minimierung des Verlusts von Erythrozyten und PLTs während des Leukaphereseverfahrens wichtig, um die mit der Transfusion allogener Blutprodukte verbundenen Risiken zu verringern. Der Verlust von PLTs während des Betriebs des CIF-Geräts war etwa zwei- bis dreimal geringer als es bei einem zentrifugationsbasierten Verfahren typisch wäre (bei dem PLTs mit der gleichen Geschwindigkeit wie WBCs entfernt werden, da sich beide Zelltypen im „Buffy Coat“ kolokalisieren). ' Schicht)50,63. Weitere Forschungsarbeiten sind erforderlich, um das Durchflussverhältnis des CIF-Geräts zu erhöhen und so die RBC- und PLT-Verluste weiter zu reduzieren.

Die Einwirkung hoher Scherkräfte während der Zentrifugation kann zu mechanischen Schäden an Zellmembranen führen, eine übermäßige Zellaktivierung induzieren und hämostatische Reaktionen auslösen, was zu einer Vielzahl unerwünschter Folgen im Zusammenhang mit der Leukapherese bei Neugeborenen und Säuglingen beiträgt21,24,28,64. In unseren Experimenten wurden WBCs und PLTs im rezirkulierenden Blut nicht stärker aktiviert als die Zellen in der BT-Kontrolle (Probe blieb für die Dauer des Verfahrens auf dem Labortisch), was darauf hindeutet, dass das CIF-Gerät nur eine minimale zusätzliche Aktivierung beisteuerte. Darüber hinaus konnten sowohl WBCs als auch PLTs nach der Exposition gegenüber einem geeigneten Stimulans aktiviert werden, was darauf hindeutet, dass die Zellen nach der CIF-Verarbeitung nicht refraktär waren. Schließlich fanden wir auch keine Hinweise auf eine Beschädigung der Erythrozyten. Zusammenfassend deuten unsere Daten stark darauf hin, dass das CIF-Gerät, das im geschlossenen Rezirkulationskreislauf arbeitet, die Blutzellen nicht wesentlich aktiviert oder beschädigt hat.

Die Zentrifugation wird zur Durchführung der Leukapherese eingesetzt, da sie die einzige Technologie ist, mit der Leukozyten mit der erforderlichen Effizienz und dem erforderlichen Volumendurchsatz aus rezirkulierendem Blut abgetrennt werden können. Diese Studie zeigt die Machbarkeit des Einsatzes mikrofluidischer Zelltrennungstechnologie mit hohem Durchsatz, um letztendlich eine zentrifugationsfreie Leukapherese mit niedrigem ECV zu ermöglichen. Eine solche Möglichkeit wäre besonders bei kleinen Kindern nützlich, einer gefährdeten Patientengruppe, die derzeit unterversorgt ist.

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften der University of Houston und des US-Gesundheitsministeriums zum Schutz menschlicher Probanden durchgeführt. Alle Versuchsprotokolle mit menschlichen Blutproben wurden vom Institutional Review Board der University of Houston (Committee for the Protection of Human Subjects 1, Protokoll Nr. 16272-01) genehmigt. Die Einverständniserklärung aller Probanden und/oder ihrer Erziehungsberechtigten wurde eingeholt. Einheiten Vollblut (WB) wurden vom Gulf Coast Regional Blood Center (Houston, TX) gekauft. Proben von frischem WB wurden durch Venenpunktion von gesunden Freiwilligen entnommen (Antikoagulans: saure Zitronendextrose, Lösung A; Vacutainer, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Die Proben wurden sofort verwendet oder bis zur Verwendung in einem Blutbankkühlschrank (4 °C, iB111, Helmer Scientific, Noblesville, IN) gelagert und mit isotonischer Kochsalzlösung (0,9 % w/v NaCl, RICCA Chemical Company, Arlington, TX) verdünnt den gewünschten Hämatokrit (HCT) erreichen.

Der Entwurf und die Herstellung von Geräten, die auf der Technologie der kontrollierten inkrementellen Filtration (CIF) basieren, wurden bereits ausführlich beschrieben43,44,45,46. In einem typischen CIF-Design ist die Breite aller Filterspalte auf ~ 20 µm festgelegt, da mikrofluidische Geräte mit einer „minimalen Strukturgröße“ von weniger als 20 µm mit derzeit verfügbaren Herstellungsmethoden nur sehr schwer in Massenproduktion hergestellt werden können43. Ebenso ist die Herstellbarkeit mikrofluidischer Geräte mit einem Seitenverhältnis (Tiefe:Breite) über ~ 7:1 sehr begrenzt. Daher sind CIF-Geräte so konzipiert, dass sie Kanaltiefen von ~ 140 µm haben, um einen möglichst geringen Fluidwiderstand (und damit eine höhere Durchflussrate/einen höheren Durchsatz bei einem gegebenen Antriebsdruck) zu erreichen und gleichzeitig die grundsätzliche Herstellbarkeit des Designs beizubehalten. Da die Breite der Lücken fest ist, wird der Anteil des Flusses, der von den zentralen zu den seitlichen Kanälen an jeder Lücke fließt, durch die Änderung der Breite der Kanäle gesteuert, wie zuvor ausführlich beschrieben44. Wenn dieser Filterstromanteil Null ist, fließt keine Flüssigkeit durch die Lücken und daher werden keine Zellen von der Flüssigkeit in die Seitenkanäle transportiert. Wenn der Filterstromanteil zunimmt, nimmt die Menge an Flüssigkeit zu, die durch jeden Spalt fließt, und daher nimmt auch die Größe der Zellen zu, die ausreichend klein sind, um von der Strömung in die Seitenkanäle gezogen zu werden. Zellen, die zu groß sind, um von der durch die Lücken fließenden Flüssigkeit gezogen zu werden, bleiben im zentralen Kanal. Somit bestimmt die Größe des Flüssigkeitsstroms durch die Lücken die Trenngrößengrenze (nicht die Spaltbreite, die konstant bleibt). Diese Entkopplung der Größengrenze von der Spaltbreite ermöglicht es CIF-Geräten mit 20-µm-Lücken, erfolgreich Partikel/Zellen zu trennen, die kleiner als die Lücken sind, wie zuvor gezeigt43,44,45,46.

Das CIF-Gerätedesign, das mit benutzerdefiniertem Code in MATLAB (The MathWorks Inc, Natick, MA) erstellt wurde, wurde in eine ~ 140 µm dicke Schicht aus Fotolack (SU-8 3050; Kayaku Advanced Materials Inc, Westborough, MA) auf a übertragen 4-Zoll-Siliziumwafer (University Wafer, South Boston, MA) mittels Softlithographie. Der Master-Wafer wurde in Poly(dimethylsiloxan) (PDMS; Sylgard 184, Dow Corning Corp, Midland, MI) repliziert und die PDMS-Replik (Geräteschicht) wurde unter Verwendung von Sauerstoffplasma gegen eine PDMS-beschichtete Petrischale (flaches Substrat) versiegelt ( PDC-001, Harrick Plasma, Ithaca, NY). Die Einlass- und Auslassöffnungen in der Geräteschicht wurden mit Biopsiestanzen (Acuderm Inc, Fort Lauderdale, FL) in der passenden Größe für die Schlauchverbindungen (1,02 und 0,58 mm Innendurchmesser; Scientific Commodities, Havasu City, AZ) erstellt. Eine zusätzliche PDMS-Schicht, die ein System großer Kanäle zum Sammeln der Filtrat- und Retentatausgänge der einzelnen CIF-Elemente eines Multiplexgeräts enthält, wurde auf die Geräteschicht geklebt. Nach dem Verkleben wurde jedes zusammengebaute CIF-Gerät 25 Minuten lang bei 70 °C mit einer 1 % (w/v) wässrigen Lösung von mPEG-Silan (MW 5000, Laysan Bio Inc, Arab, AL) behandelt. Abschließend wurde das Gerät mit GASP-Puffer (9 mM Na2HPO4, 1,3 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, 5,5 mM Glucose, 1 % w/v Rinderserumalbumin, 290 mmol/kg, pH 7,4) gespült und bei 4 °C gelagert verwenden.

Der Rezirkulationsaufbau bestand aus einem Blutbeutel (500 ml; Fenwal 4R1590, GenesisBPS, Ramsey, NJ), der über Kunststoffschläuche (Scientific Commodities) und Luer-Lock-Anschlüsse geeigneter Größe mit dem Multiplex-CIF-Gerät und anderen Komponenten des Kreislaufs verbunden war (Qosina, Ronkonkoma, NY). Der Schlauch, der die Blutprobe vom Boden des Blutbeutels zum CIF-Gerät transportiert, war über zwei 3-Wege-Hähne (Qosina) mit einer Spritzenpumpe (Genie Touch, Kent Scientific, Torrington, CT) und dem Einlass des CIF-Geräts verbunden. . Ein Absperrhahn diente zur Probenahme des aus dem Beutel kommenden Bluts, der andere Absperrhahn diente dazu, die Spritzenpumpe entweder mit dem Auslass des Beutels (zur Entnahme von Blut aus dem Beutel) oder dem Einlass des Geräts (zur Blutinfusion) zu verbinden das Gerät). Die Betriebsart der Pumpe (Infusion/Entnahme) und die Position des Absperrhahns wurden während des Experiments manuell eingestellt. Der Blutbeutel wurde während und nach jeder Rezirkulationsrunde von Hand gemischt.

Das vollständige Blutbild mit einem 5-teiligen Differential wurde mit einem Hämatologieanalysator (XS-1000i, Sysmex America, Inc., Mundelein, IL) gemessen. WBC-, RBC- und PLT-Zählungen wurden verwendet, um die prozentuale Entfernung für jeden Zelltyp wie folgt zu berechnen: \(\% Entfernung={C}_{r}/\left({C}_{r}+{C}_{ f}\times FR\right)\times 100\), wobei \({C}_{r}\) die Zellzahl im Retentat (zentraler Kanalausgang aller CIF-Elemente) ist, \({C}_{ f}\) ist die Zellzahl im Filtrat (Seitenkanalausgang aller CIF-Elemente) und \(FR\) ist das Durchflussverhältnis des Geräts (definiert als das Verhältnis des kumulierten Volumens des Filtratausgangs zu dem von der Retentatausstoß des Gerätes)46. Alle Durchflussverhältnisse wurden anhand der gemessenen Volumina berechnet.

Die bildgebende Durchflusszytometrie (FC, Amnis ImagestreamX Mk II, Luminex Corporation, Austin, TX) wurde verwendet, um PLT- und WBC-Oberflächenantigenaktivierungsmarker sowie die Prävalenz von PLT-WBC-Aggregaten zu messen, wobei die folgenden Antikörpercocktails (alle von BD Biosciences, San Jose, Kalifornien). PLT-Aktivierung: CD41a/APC (20 µL; BD 559.777), CD62P/PE (20 µL; BD 555.524), Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Kalzium oder Magnesium (DPBS-/-; 10 µL). Als Positivkontrolle für die PLT-Aktivierung wurde das Thrombinrezeptor-Agonist-Peptid 6 (TRAP; 70 µM; Sigma) verwendet. WBC-Aktivierung: CD45/APC (5 µL; BD 561.864), CD62L/FITC (20 µL; BD 555.543), CD11b/PE (20 µL; BD 555.388) und DPBS-/- (25 µL). Als Positivkontrolle für die WBC-Aktivierung wurde Phorbolmyristatacetat (PMA; 0,5 µg/ml; Sigma) verwendet. PLT-WBC-Aggregate (PLA): CD45/APC (5 µL), CD41a/FITC (20 µL; BD 555.466) und DPBS-/- (45 µL). Als Positivkontrolle für die PLA-Bildung wurde TRAP (70 µM) verwendet. Um die FC-Messungen durchzuführen, wurden 30 µL der Blutprobe zu jedem Antikörpercocktail gegeben, vorsichtig gemischt und 15 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Nach der Antikörpermarkierung wurden die Erythrozyten unter Verwendung von 1X BD FACS-Lyselösung 15 Minuten lang bei RT lysiert. Nach der Lyse wurden die Proben 5 Minuten lang bei 900 × g zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen. Die pelletierten Zellen wurden in 100 µl 1 % Paraformaldehyd resuspendiert und dann bei 4 °C gelagert, bis FC-Messungen durchgeführt wurden (innerhalb von 24 Stunden).

Der Gehalt an freiem Hämoglobin (Hb) im Überstand wurde unter Verwendung der modifizierten Cyanmethämoglobin-Methode gemäß den Anweisungen des Herstellers (Drabkin-Reagenz; D5941, Sigma) gemessen. Kurz gesagt wurde eine Blutprobe 5 Minuten lang bei 1000 × g zentrifugiert, um die Erythrozyten zu pelletieren. Anschließend wurden 40 µL des Überstands zu 160 µL Drabkin-Reagenz gegeben und 20 Minuten lang inkubiert. Die Absorption wurde bei 540 nm mit einem Plattenlesegerät (SpectraMax M5, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) gemessen. Die Hb-Konzentration wurde anhand einer Kalibrierungskurve berechnet, die mit einem menschlichen Hb-Standard (Pointe Scientific Inc, Canton MI) erstellt wurde. Der Kaliumspiegel (K+) wurde mit einem tragbaren Blutanalysegerät (i-STAT, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) unter Verwendung von CHEM8+-Kartuschen gemessen, wie zuvor beschrieben47.

Alle Werte wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Die statistische Signifikanz (definiert als p < 0,05) der beobachteten Unterschiede wurde mithilfe des gepaarten zweiseitigen t-Tests für Zellzahldaten, einer Einweg-ANOVA für Hb-Messungen und entweder einer 2-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen oder einer gemischten Wirkung bestimmt Modell (eingeschränkte maximale Wahrscheinlichkeit), das sowohl hinsichtlich der Zeit als auch des Aktivierungszustands mit dem Mehrfachvergleichstest von Sidak für FC-Messungen abgeglichen wurde.

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Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde teilweise durch den University of Houston High Priority Area Research Seed Grant (I0503554, PI: SSS) und durch das National Heart, Lung, and Blood Institute der National Institutes of Health unter der Fördernummer R01HL151858 (PI) unterstützt : SSS). Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health, des US-Veteranenministeriums oder der Regierung der Vereinigten Staaten wieder.

Abteilung für Biomedizintechnik, University of Houston, 3605 Cullen Blvd, Houston, TX, 77204-5060, USA

Dalia L. Lezzar, Ravin Huerta, Anton Mukhamedshin, Madeleine Lu und Sergey S. Shevkoplyas

Abteilung für pädiatrische Intensivmedizin, Baylor College of Medicine, Houston, TX, 77030, USA

Fong W. Lam

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DLL, FWL und SSS haben die Studie entworfen und die Daten analysiert. FWL und SSS haben Fördermittel eingeworben und das Projekt betreut. DLL und ML stellten die mikrofluidischen Geräte her. DLL, FWL, RH und ML führten die Experimente durch. AM unterstützte bei der Datenanalyse und -interpretation. DLL, FWL und SSS haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren haben das Manuskript kritisch geprüft und genehmigt.

Korrespondenz mit Sergey S. Shevkoplyas.

SSS ist Erfinder des US-Patents Nr. 9.789.235 „Separation und Konzentration von Partikeln“, das die kontrollierte inkrementelle Filtrationstechnologie beschreibt, und Miteigentümer von Halcyon Biomedical Incorporated, einem Unternehmen, das von seiner Kommerzialisierung profitieren würde. Alle anderen Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Lezzar, DL, Lam, FW, Huerta, R. et al. Ein Mikrofluidikgerät mit hohem Durchsatz, das auf kontrollierter inkrementeller Filtration basiert und eine zentrifugationsfreie Leukapherese mit geringem extrakorporalen Volumen ermöglicht. Sci Rep 12, 13798 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-16748-5

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Eingegangen: 02. März 2022

Angenommen: 14. Juli 2022

Veröffentlicht: 13. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16748-5

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