Struktur und Saccharose-Bindungsmechanismus des pflanzlichen SUC1-Saccharosetransporters

Naturpflanzen (2023)Diesen Artikel zitieren

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Der Saccharoseimport aus photosynthetischen Geweben in das Phloem wird durch Transporter aus der Familie der Saccharosetransporter mit niedriger Affinität (SUC/SUT-Familie) vermittelt. Darüber hinaus wird die Umverteilung von Saccharose in andere Gewebe durch die Bewegung des Phloemsafts vorangetrieben, das Produkt des hohen Turgordrucks, der durch diese Importaktivität entsteht. Darüber hinaus sind auch Senkenorgane wie Früchte, Getreide und Samen, die hohe Zuckerkonzentrationen ansammeln, auf diesen aktiven Saccharosetransport angewiesen. Hier präsentieren wir die Struktur des Saccharose-Protonen-Symporters Arabidopsis thaliana SUC1 in einer nach außen offenen Konformation mit einer Auflösung von 2,7 Å zusammen mit Molekulardynamiksimulationen und biochemischer Charakterisierung. Wir identifizieren den wichtigsten sauren Rest, der für die protonengesteuerte Saccharoseaufnahme erforderlich ist, und beschreiben, wie Protonierung und Saccharosebindung stark gekoppelt sind. Die Saccharosebindung ist ein zweistufiger Prozess, wobei die anfängliche Erkennung durch die direkte Bindung der Glucosyleinheit an den wichtigsten Säurerest in einer stringenten pH-abhängigen Weise vermittelt wird. Unsere Ergebnisse erklären, wie der Saccharosetransport mit niedriger Affinität in Pflanzen erreicht wird, und zeigen eine Reihe von SUC-Bindern auf, die zur Definition der Selektivität beitragen. Unsere Daten zeigen einen neuen Modus für protonengesteuerten Symport mit Verbindungen zum kationengesteuerten Symport und liefern ein breites Modell für den allgemeinen Transport mit niedriger Affinität in hochangereicherten Substratumgebungen.

Saccharose ist für das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung von wesentlicher Bedeutung, da sie als zentraler Pflanzenmetabolit fungiert und darüber hinaus auch eine Rolle als Signalmolekül spielt1,2,3. Bei den meisten Pflanzenarten ist Saccharose die Hauptform des assimilierten Kohlenstoffs, der bei der Photosynthese entsteht. Die Fernverteilung von Saccharose von den grünen Quellgeweben, im Allgemeinen Blättern, zu energieintensiven Senkengeweben wird durch Phloem4 vermittelt. Hier spielen Zuckertransporter aus zwei Familien, der Saccharosetransporterfamilie (SUT/SUC-Familie genannt) und der SWEET-Familie, eine zentrale Rolle5,6,7,8. Während die SWEET-Facilitatoren Zucker ausströmen, hängt die aktive Beladung von SUCs ab, die die protonentreibende Kraft der Plasmamembran nutzen, um die Aufnahme von Saccharose zur Akkumulation voranzutreiben, wobei die Konzentrationen im Phloem bis zu 1,3 molar betragen9,10,11,12,13,14. Die Bewegung des Phloemsafts ist das Produkt des hohen Turgordrucks, der durch diese SUC-Aktivität erzeugt wird6,15. Darüber hinaus sind auch Senkenorgane wie Früchte und Samen, die in Entwicklungsstadien hohe Zuckerkonzentrationen ansammeln, auf den aktiven Transport von Saccharose durch SUCs angewiesen15,16.

SUCs sind Teil der Glycosid-Pentoside-Hexuronid (GPH):Kation-Symporter-Familie, die zur Major Facilitator Superfamily (MFS)17,18 gehört. Von Mitgliedern der GPH-Familie ist bekannt, dass sie ein breites Spektrum an Substraten transportieren, von kleinen löslichen Molekülen wie Glucose, Melibiose oder Saccharose bis hin zu großen amphiphilen Lysolipiden, normalerweise gekoppelt an den Transport einwertiger Kationen19,20,21. SUCs nehmen als protonengekoppelte Transporter eine einzigartige Stellung in der vielfältigen GPH-Familie ein und weisen eine sehr geringe Sequenzidentität zu anderen bekannten Zweigen auf (<16 %).

Trotz ihrer Schlüsselrolle in grundlegenden Prozessen der Pflanzenphysiologie ist der Wirkmechanismus von SUCs weiterhin unbekannt. Es ist unklar, wie SUCs Saccharose erkennen und wie der Transport protonengekoppelt ist. Da die Saccharose-Bindungsstelle über die Fähigkeit verfügt, Saccharose in Umgebungen mit extrem hohen Saccharosekonzentrationen freizusetzen, muss sie über einzigartige Eigenschaften verfügen. Tatsächlich muss seine Kopplung an den treibenden Protonengradienten eng und gut koordiniert sein. Arabidopsis thaliana verfügt über neun SUC-Transporter (SUC1–9), wobei SUC1 zu den ersten identifizierten Saccharose-H+-Symportern gehört (Extended Data Abb. 1)22,23,24,25,26,27,28. SUC1 wird überwiegend in Fortpflanzungsorganen, Trichomen und Wurzeln exprimiert, wo es sich in der Plasmamembran befindet und für die ordnungsgemäße Pollenfunktion benötigt wird24,29,30,31,32,33.

Hier präsentieren wir die Struktur von A. thaliana SUC1 zusammen mit umfassenden biochemischen Charakterisierungs- und Molekulardynamik-Simulationen (MD). Unsere Arbeit identifiziert Schlüsselelemente zum Verständnis des protonengekoppelten Saccharosetransports, indem sie die Substraterkennung erklärt und erklärt, wie Protonen in einem einzigartigen Mechanismus direkt an den Saccharosetransport gekoppelt sind. Dieser Mechanismus ermöglicht die Bindung und Freisetzung von Saccharose in Umgebungen mit hohen molaren Saccharosekonzentrationen, was für die ordnungsgemäße Funktion des Phloems, den Transport in apoplastisch isolierte Gewebe und das Pflanzenwachstum von entscheidender Bedeutung ist.

Um den Transportmechanismus von SUCs zu untersuchen, haben wir eine Reihe von SUC-Transportern untersucht und festgestellt, dass A. thaliana SUC1 stabil ist und in Saccharomyces cerevisiae gut exprimiert wird (Extended Data Abb. 2a – d). In Oozytenaufnahmetests zeigt SUC1 eine robuste Aufnahme von Saccharose mit einer scheinbaren Michaelis-Konstante (Kmapp) von 1,28 mM (Abb. 1a und erweiterte Daten Abb. 3a), vergleichbar mit früheren Ergebnissen6,34. Gereinigtes SUC1-Protein wurde in Liposomen rekonstituiert und der Transport wurde mithilfe kapazitiver Kopplung durch Elektrophysiologie mit fest unterstützten Membranen (SSM) gemessen. Dies zeigte eine ähnlich robuste, aber geringe Affinität für Saccharose in vitro mit einem Kmapp (SSM-basierte Elektrophysiologie-Assays in Methoden) von 19 mM bei pH 5,5 (Abb. 1b). Wir fanden eine starke pH-Abhängigkeit, wobei der Transport durch eine erhöhte Protonenkonzentration in vivo stimuliert wurde und in vitro ein funktionelles Optimum bei symmetrischem pH 5,5 auftrat (Extended Data Abb. 3b, c).

a: Oozytenaufnahmetest für SUC1 bei pH 5,5 mit nichtlinearer Michaelis-Menten-Anpassung. Datenpunkte sind Mittelwert ± SD; Punkte stellen biologisch unabhängige Messungen dar (n = 4 für Konzentrationen von 0,8, 1,5, 6 und 15 mM; n = 6 für eine Konzentration von 20 mM; n = 9 für Konzentrationen von 0,1 und 0,3 mM). b: Spitzenströme, bestimmt durch SSM-basierte Elektrophysiologie an SUC1-Proteoliposomen bei symmetrischem pH-Wert 5,5. Der Transport kann durch die Michaelis-Menten-Kinetik beschrieben werden. Datenpunkte sind Mittelwerte ± Standardabweichung (n = 3 biologisch unabhängige Experimente). Die Einfügung zeigt Rohstromspuren bei verschiedenen Saccharosekonzentrationen. c, Die 2,7 Å-Elektronendichtekarte von SUC1 (2mFo-DFc-Karte, konturiert bei 1σ). Die der N- und C-Domäne entsprechende Dichte ist cyan bzw. orange gefärbt. EHR- und IHR-Domänen sind hellgelb gefärbt. d, Seitenansicht der Struktur von SUC1 in der Ebene der Plasmamembran, gefärbt nach Domänen. Unten eine Draufsicht von der extrazellulären Seite mit der Beschriftung M1–M12. Dargestellt ist die verbindende Disulfidbrücke EHR–M6. e, Topologie von SUC1. Ungeordnete N-terminale (Reste 1–24) und C-terminale (Reste 501–513) Enden sind als Striche dargestellt.

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Wir fuhren fort, die Struktur von SUC1 mithilfe der Kristallographie mit einer Auflösung von 2,7 Å zu lösen (Abb. 1c und erweiterte Daten Abb. 2a – d). In der asymmetrischen Einheit bildet SUC1 ein nicht-physiologisches invertiertes Dimer, wobei beide Monomere die gleiche Konformation haben (quadratische Abweichung (rmsd) der Cɑ-Atome = 0,1 Å). Die hervorragende Kartendichte ermöglichte die Erstellung eines endgültigen Atommodells mit den Resten 25–500 (von 513 Resten) und einem freien R-Faktor (Rfree) von 29, 3% (Abb. 1c, erweiterte Daten, Abb. 4 und Ergänzungstabelle 1). Insgesamt übernimmt SUC1 die kanonische MFS-Transporterfalte mit zwölf Transmembranhelices, die in zwei pseudosymmetrischen Hälften angeordnet sind und aus zwei Sechs-Helix-Domänen bestehen, der N-terminalen Domäne (N-Domäne, M1–M6) und der C-terminalen Domäne (C-Domäne, M7– M12) (Abb. 1d,e). Die beiden Domänen sind durch eine kurze zytoplasmatische Linkerregion mit 26 Resten verbunden, die in der experimentellen Karte gut definiert sind. Bemerkenswert ist, dass der zytoplasmatische Linker eine amphipathische ɑ-Helix mit 9 Resten (intrazelluläre helikale Region (IHR) genannt) enthält (Abb. 1c – e und erweiterte Daten Abb. 4 und 5a, b). Extrazellulär befindet sich in der Schleifenverbindung zwischen M5 und M6 eine kurze helikale Region (extrazelluläre helikale Region (EHR) genannt), die ebenfalls deutliche amphipathische Eigenschaften aufweist. Die EHR ist an der Seite der N-Domäne durch eine Disulfidbrücke zwischen den streng konservierten Resten Cys216 und Cys220 verankert (Abb. 1d und Extended Data Abb. 4, 5a, c und 6). Wir untersuchten die Rolle von IHR und EHR durch Mutagenese und stellten fest, dass die Transportaktivität in Eizellen gegenüber der Mutagenese der hydrophoben Reste im IHR gleichgültig zu sein scheint (Extended Data Abb. 5b, d). Allerdings reagiert die EHR auf der extrazellulären Seite sehr empfindlich auf Veränderungen. Die Unterbrechung der kurzen EHR-M6-Verbindung durch Mutation von Cys216 der Disulfidbrücke führt zum Verlust des Transports. Die Mutation der drei Reste (Leu204, Met207 und Phe208) des EHR, die im Membranblatt verborgen zu sein scheinen, zu polaren Serinresten führt zu einem ähnlichen Transportverlust, was darauf hindeutet, dass diese extrazelluläre Region beim Transport eine wichtige Rolle spielt (Extended Data Abb. 5e).

Die Struktur fängt SUC1 in einer nach außen offenen Konformation mit einem konservierten elektrostatischen Netzwerk zwischen den N- und C-Domänen auf der zytosolischen Seite ein (Extended Data Abb. 6 und 7). Ein großer und klar definierter V-förmiger Hohlraum, der etwa zwei Drittel der Membranebene zwischen der N- und C-Domäne überspannt, ist zur extrazellulären Seite hin offen (Abb. 2a). Insgesamt ist der Hohlraum elektronegativ, zum umschließenden Boden hin wird er jedoch elektropositiv. Trotz der Anwesenheit von Saccharose während der Kristallisation kann im Hohlraum keine definierte Dichte für die Saccharosebindung beobachtet werden.

a, Plattenansicht von SUC1, die die nach außen offene Konformation zeigt, gesehen von der Membranebene (links) oder von der extrazellulären Seite (rechts). Die gestrichelten Kästchen beziehen sich auf Bereiche der H+-Bindungsstelle und der Saccharose-Bindungstasche. Die Oberfläche wird durch das elektrostatische Potential (kBT e−1) gefärbt. b, Nahaufnahme der in a gezeigten Protonenbindungsstelle. Der Abstand zwischen dem Restpaar, das die Protonenstelle bildet (Asp152 (rot) und Gln50 (blau)), wird durch den gestrichelten Pfeil angezeigt, wobei 8,2 Å der kürzeste Abstand ist (von Asp152 ε-Sauerstoff zu Gln50 ε-Sauerstoff/Stickstoff). c: Oozytenaufnahmetest für SUC1-Mutanten, die bei drei verschiedenen externen pH-Werten auf die Protonentasche abzielen. Der Kasten erstreckt sich vom 25. bis zum 75. Perzentil und der Median wird angezeigt. Die Whisker erstrecken sich bis zum Minimal- und Maximalwert. Punkte stellen biologisch unabhängige Experimente dar (n = 4 für S78A (pH 3,5 und 5,5) und Q456A (pH 3,5); n = 5 für WT (pH 4,5), Wasser (pH 3,5, 4,5 und 5,5), C74A (pH 5,5), S78A (pH 4,5) und Q456A (pH 4,5); und n = 6 für WT (pH 3,5 und 5,5), W47A (pH 3,5, 4,5 und 5,5), Q50A (pH 3,5, 4,5 und 5,5), C74A (pH 3,5). und 4,5), D152N (pH 3,5, 4,5 und 5,5) und Q456A (pH 5,5)). Die Farben entsprechen den Rückständen in Tafel b. d, Rohstromspuren aus der SSM-basierten Elektrophysiologie für WT-Proteoliposomen SUC1 (blassgrün bis dunkelgrün), SUC1-D152N (blassrot bis dunkelrot) oder SUC1-Q50A (blassblau bis dunkelblau), hervorgerufen durch Zugabe von 30 mM Saccharose bei dem angegebenen symmetrischen pH-Wert. Diagramme zeigen Spitzenströme. Der Kasten reicht vom 25. bis zum 75. Perzentil und der Median wird angezeigt. Die Whisker erstrecken sich bis zum Minimal- und Maximalwert (n = 3, Datenpunkte sind einzelne Experimente). WT, Wildtyp.

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Der aktive Transport von Saccharose durch SUC1 ist protonengesteuert und empfindlich gegenüber dem Protonenentkoppler Carbonylcyanid m-Chlorphenylhydrazon in Oozytentests (Extended Data Abb. 8a). Bei Transportern sind im Transmembranbereich vergrabene Säurerückstände im Allgemeinen für den Protonentransport unerlässlich35. In den Transmembrandomänen von SUC1 ist Asp152(M4) der einzige saure Rest, der in SUCs streng konserviert ist und daher der Hauptkandidat als Protonendonor-/Akzeptorrest während des Symports ist (Abb. 2b und Extended Data Abb. 1 und 6). . Asp152 wird dem Hohlraumlösungsmittel ohne engen Kontakt zu anderen Rückständen ausgesetzt (Abb. 2b). Die Mutation von Asp152 zu Asparagin führte zum Verlust der Transportaktivität, ohne die Lokalisierung der Plasmamembran in vivo zu beeinträchtigen (Abb. 2c und erweiterte Daten Abb. 9). Wie erwartet stört dieser Mutant auch die aktuelle Reaktion, die sonst für Wildtyp-SUC1 in Liposomen beobachtet wird, und untermauert seine Schlüsselrolle als zentraler Protonendonor/-akzeptor (Abb. 2d und erweiterte Daten Abb. 8b). Eine weitere allgemeine Voraussetzung für die Transmembran-Protonentranslokation ist die pKa-Kontrolle des Protonendonors/-akzeptors, die häufig durch einen positiv geladenen Rest vermittelt wird35,36,37,38. Allerdings gibt es im nach außen offenen Zustand von SUC1 keine offensichtlichen Kandidaten für diese Funktion.

Um einen nach innen gerichteten Zustand zu erhalten, haben wir versucht, verschiedene auf künstlicher Intelligenz (KI) basierende Tools zur Vorhersage der Proteinstruktur zu verwenden, haben jedoch nur nach außen gerichtete Konformationen erhalten, die unserer experimentellen Struktur ähneln (rmsd von Cɑ 1,6–2,5 Å). In der Struktur haben wir jedoch ein Netzwerk von Salzbrücken zwischen der N- und C-Domäne auf der intrazellulären Seite identifiziert, das den nach außen offenen Zustand stabilisiert (Extended Data Abb. 6 und 7a). Die Störung dieser Interaktionen führte zu inaktiver oder stark verminderter Transportaktivität (Extended Data Abb. 7b). Wir folgerten, dass das Protein durch diese Mutationen im nach innen gerichteten Zustand stabilisiert worden war, und nutzten diese Informationen, um ein AI-basiertes Tool zur Vorhersage der Proteinstruktur zu steuern, um die nach innen gerichtete offene Konformation zu erzeugen (Extended Data Abb. 7a)39,40. Basierend auf dieser nach innen offenen Konformationsvorhersage schlagen wir vor, dass das streng konservierte Gln50 (M1) der wahrscheinliche Kandidat für die Kontrolle des pKa von Asp152 ist (Extended Data, Abb. 7c). Obwohl Gln50 in der Struktur 8,2 Å von Aspartat entfernt ist, verschob es sich durch Bewegungen von M1, um im vorhergesagten, nach innen offenen Modell Wasserstoffbrücken zum Asp152 zu bilden (Abb. 2b und erweiterte Daten, Abb. 7c). Der Ersatz von Gln50 durch Alanin führte zu einem Verlust der Transportaktivität, der in seinem Ausmaß mit D152N in Eizellen vergleichbar war (Abb. 2c). Mutierende andere Reste in der Nähe zeigten entweder keine verringerte Transportaktivität (Cys74) oder zeigten eine etwas verringerte Transportaktivität (Ser78 oder Gln456), mit Ausnahme der Substitution von Trp47, die zu einem mit der Q50A-Mutante vergleichbaren Transportverlust führte (Abb . 2c). Darüber hinaus zeigte die Q50A-Mutante, ähnlich wie die D152N-Mutante, im Vergleich zu Wildtyp-SUC1 in Liposomen den gleichen Verlust der Stromreaktion und der pH-Abhängigkeit (Abb. 2d). Auf dieser Grundlage schlagen wir vor, dass Asp152 der Protonenakzeptor/Donor ist, der für die Protonentranslokation während des Symports verantwortlich ist, wobei Gln50 möglicherweise an der Steuerung von pKa-Änderungen an der Protonenstelle beteiligt ist.

Von hier aus richteten wir unser Interesse auf die Saccharose-Bindungsstelle im V-förmigen Hohlraum. Es gibt eindeutig eine Reihe von Resten sowohl aus der N- als auch der C-Domäne im Hohlraum und in der Nähe der Protonenstelle, die an der Saccharosebindung beteiligt sein könnten (Abb. 3a).

a, Nahaufnahme der blau umrandeten Saccharose-Bindungstasche, wie in Abb. 2a dargestellt. b, Ergebnisse von jeweils fünf unabhängigen MD-Simulationswiederholungen für Asp152(H) und Asp152(−), ausgehend von der identifizierten stabilen Bindungsposition für Saccharose. Die Wiederholungen zeigen konsistente Ergebnisse, zusammengefasst durch den Zeitanteil, in dem Saccharose in der stabilen Haltung gebunden war. Rechts ist Wiederholung 2 der Simulationen mit Saccharose als Stecknadel dargestellt, wobei der Kopf die Glucosyleinheit darstellt. Unten das RMSD-Diagramm von Saccharose. Der Hintergrund des RMSD-Diagramms wird als gebundene (dunkelblau) oder ungebundene (hellblau) Pose der Saccharose bezeichnet. c, Kontaktkarte zwischen Saccharoseatomen und SUC1-Resten in MD-Lauf 2 mit Asp152(H). Es werden nur Wechselwirkungen angezeigt, die während mindestens 25 % der Simulationszeit auftreten, einschließlich Wasserstoffbrücken-Wechselwirkungen (blau) und hydrophoben Wechselwirkungen (rot). d, Repräsentative Momentaufnahme der stabilen Saccharose-Pose in Simulationen mit Asp152(H). Blaue Striche zeigen Wasserstoffbrückenbindungen an und rote Striche zeigen hydrophobe Wechselwirkungen an. e, Schematische Darstellung der Saccharose-Koordination durch SUC1 im Schnappschuss in Tafel d. f, Oozytenaufnahmetest für SUC1-Mutanten, die auf die Reste abzielen, die die Saccharose-Bindungstasche auskleiden. Die Aufnahmeaktivitäten sind auf die des Wildtyps normalisiert. Balken sind Mittelwerte ± SD. Punkte stellen biologisch unabhängige Experimente dar (n = 5 für Q44A und F184A; n = 6 für F298A, F427A, N449A und Q456A; n = 7 für N155A, N156A, R163A, M188A, F423A, S431A und I452A; n = 10 für W294A; n = 12 für WT und Q159A; n = 14 für T290A; n = 18 für Q83A). P-Werte für Unterschiede zwischen Wildtyp und Varianten wurden aus einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) und anschließendem Mehrfachvergleichstest nach Dunnett ermittelt. P-Werte sind in der Abbildung dargestellt. NS, nicht signifikant.

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Um den Bindungsmodus von Saccharose und die funktionellen Rollen der Reste in der zentralen Bindungstasche zu beurteilen, wurden MD-Simulationen mit einem Saccharosemolekül durchgeführt, um eine stabile Bindungsposition von Saccharose zu identifizieren. Zur Orientierung basierte eine Ausgangsposition für Saccharose auf dem nächsten bekannten Strukturhomolog: dem Melibiose/Kationen-Symporter MelB, gebunden an ein Galactosyl-haltiges Melibiose-Analogon, das vermutlich einen substratgebundenen Zustand nachahmt (15,7 % Sequenzidentität) (Erweitert). Daten Abb. 10a). Wir führten zehn und fünf unabhängige Simulationen von jeweils ~1 µs (insgesamt 14,3 µs) an SUC1 durch, wobei entweder ein protoniertes Asp152 (Asp152(H)) oder ein deprotoniertes Asp152 (Asp152(−)) und eine Saccharose in der MelB-inspirierten Zelle platziert wurden Pose. In allen Wiederholungen zeigte das Protein ein stabiles Verhalten (Extended Data Abb. 10a,b).

Die meisten dieser Simulationen erfassten keine statische Saccharose-Bindungshaltung und Saccharose bewegte sich frei im Hohlraum. In einer der Wiederholungen mit Asp152(H) stabilisierte sich die Glucosyleinheit der Saccharose jedoch über 1.050 ns lang in einer statischen Position in Richtung der N-Domäne (Extended Data, Abb. 10c). Um zu untersuchen, ob diese Haltung einem stabilen anfänglichen Bindungsereignis des Saccharosemoleküls ähnelt und ob dies von der Protonierung von Asp152 abhängt, wurden fünf neue Simulationen mit Asp152(H) oder Asp152(−) (insgesamt 10,6 µs) mit platzierter Saccharose durchgeführt in dieser neuen Bindungsposition (Extended Data Abb. 10d). In vier von fünf Wiederholungen mit Asp152(H) behielt die Saccharose eine stabile Bindungsposition bei, wohingegen sie in den Asp152(−)-Wiederholungen leicht und schnell freigesetzt wurde (Abb. 3b und erweiterte Daten Abb. 10e). Auch in den Wiederholungen mit Asp152(H) würde die Saccharose nach einem Dissoziationsereignis in die identifizierte Bindungsposition zurückkehren. Die Kartierung der Kontakte aus den unabhängigen Simulationen zeigt, dass Saccharose in dieser anfänglichen stabilen Bindungsposition spezifisch und direkt mit seiner Glucosyleinheit am Asp152(H) und den Resten Trp47, Gly75, Asn155 und Asn156 interagiert (Abb. 3c – e und erweiterte Daten). Abb. 10d). Die Kontaktanalyse zeigt deutlich, dass es keine anderen Bindungsstellen gibt, deren Größenordnung auch nur annähernd vergleichbar ist. Die Kontaktkarte zeigt, dass mit den Glucosylhydroxylen an den Positionen O2, O3 und O4 Wasserstoffbrückenbindungen gebildet werden, was zur Substraterkennung führt. Darüber hinaus tragen hydrophobe Wechselwirkungen zunächst zur Bindung mit dem Glucosyl und teilweise auch mit dem Fructosyl bei. Insgesamt deuten die Simulationen darauf hin, dass die Glucosylgruppe von Saccharose der Auslöser des anfänglichen Bindungsereignisses ist, wodurch eine anfängliche Selektivität entsteht, und legen daher nahe, dass ein Asp152(H) für die Stabilisierung der Saccharosebindung direkt innerhalb des Transporters entscheidend ist.

Um die von MD vorgeschlagenen Wechselwirkungen zu testen und ihre funktionelle Bedeutung für den Transport zu untersuchen, haben wir als Nächstes die biochemischen Charakterisierungen der vorgeschlagenen Rückstände und anderer Rückstände, die den Hohlraum auskleiden, bestimmt (Abb. 3a, d – f). Unsere Ergebnisse bestätigen, dass die Reste, von denen vorhergesagt wurde, dass sie für die anfängliche Bindung von zentraler Bedeutung sind, für den Transport essentiell sind. Die Mutation von Asn156 führte zu einem vollständigen Verlust des Transports in Eizellen, was mit seiner herausragenden Rolle bei der Koordination des Glukoseanteils von Saccharose übereinstimmt (Abb. 3f). Für die Glucosyleinheit identifizierte die Kontaktkarte auch das Rückgrat von Gly75 sowie die Seitenketten von Trp47 und Asp152(H), was bei Mutation zum Verlust der Transportaktivität führte (Abb. 2c). Bei den identifizierten Fructosylkontakten hatte die Mutagenese von Asn155 kaum offensichtliche Auswirkungen auf die Transportaktivität, was darauf hindeutet, dass die Wasserstoffbindung zu diesem Rest und alle spezifischen Wechselwirkungen mit der Fructosyleinheit in der anfänglichen Bindungsposition für den Gesamttransport von geringerer Bedeutung sind. Bei den anderen identifizierten Kontakten hatte die Mutation von Gln159 keine Auswirkung, wohingegen die Mutation von Asn449 den Transport eliminiert (Abb. 3c, f). Wir zielten auch auf Reste in der identifizierten Bindungsstelle ab, die sich in der Nähe der Saccharosebindung befanden, aber noch nicht an der Saccharosebindung beteiligt waren (Abb. 3a). Die Mutation der polaren Reste Gln83 und Thr290 hatte keine negativen Auswirkungen, wohingegen die Mutation der polaren Reste Gln44, Ser431 und Gln456 den Transport erheblich reduzierte (Abb. 3f). Darüber hinaus reduzierte die Mutagenese der hydrophoben Reste Phe184, Trp294, Phe298, Phe423, Phe427 oder Ile452 den Transport ebenfalls (Abb. 3f). Interessanterweise führte die Mutation von Arg163 oder Met188 zu einem vollständigen Verlust des Transports, ähnlich wie bei Asn449, das sich ebenfalls am Boden der Höhle befindet, was zusammen auf eine Rolle dieser drei Reste im vollständig verschlossenen Zustand hinweist (Abb. 3f). Zusammengenommen belegen diese Daten, dass die in den MD-Simulationen von protoniertem SUC1 beobachtete stabile Saccharosebindung ein anfängliches Bindungsereignis darstellt. Die anfängliche Substraterkennung durch SUC1 konzentriert sich auf Wasserstoffbrückenbindungen zur Glucosyleinheit, wohingegen andere Reste, die die zentrale Bindungstasche bilden, in späteren Phasen des Transportzyklus eine Rolle spielen.

Um diese Ergebnisse weiter zu untermauern, haben wir die Substratspezifität von SUC1 mit einer Vielzahl verschiedener mutmaßlicher Liganden getestet, wobei wir sowohl Eizellentests als auch SSM-basierte Elektrophysiologie verwendeten (Abb. 4a – c). Wir haben Moleküle sowohl mit als auch ohne Glucosyl getestet und festgestellt, dass eine Glucosyleinheit ein erforderlicher Bestandteil für Substrate ist, wohingegen die Fructosyleinheit leichter durch zyklische Gruppen mit teilweise polaren Eigenschaften ersetzt werden kann (Abb. 4). Diese Ergebnisse stimmen mit dem Bindungsmodell überein, dass SUC1 in der anfänglichen stabilen Bindungsstellung mit der Glucoseeinheit der Saccharose interagiert und dass die spezifische Erkennung der Fructoseeinheit für die Transportaktivität weniger wichtig ist.

a, Substratspezifität von SUC1, bestimmt durch Konkurrenztest in Eizellen mit 1 mM Saccharose und dem 20-fachen der konkurrierenden Substrate bei pH 5,5. P-Werte für Unterschiede zwischen der Kontrolle (Saccharoseaufnahme ohne Konkurrenz) und der Saccharoseaufnahme mit verschiedenen konkurrierenden Verbindungen wurden aus einer einfaktoriellen ANOVA gefolgt von Dunnetts Mehrfachvergleichstest ermittelt. P-Werte sind in der Abbildung dargestellt. Balken sind Mittelwerte ± Standardabweichung. Datenpunkte sind einzelne Experimente (n = 4 für Saccharoseaufnahme, Sucralose, Raffinose, Sorbitol; n = 5 für alle anderen Verbindungen; n = 7 für kein Protein). b: Substratspezifität von SUC1, gemessen bei pH 5,5 durch SSM-basierte Elektrophysiologie. Spitzenströme, die durch eine Reihe mutmaßlicher Substrate hervorgerufen werden, die bei 10 mM getestet wurden. Die Spitzenströme wurden relativ zu den durch Saccharose hervorgerufenen Strömen nach Korrektur des Artefaktsignals normalisiert. P-Werte für aktuelle Antworten wurden aus einer einfaktoriellen ANOVA gefolgt von Dunnetts Mehrfachvergleichstest ermittelt. P-Werte sind in der Abbildung dargestellt. Die mit * gekennzeichneten Stromreaktionen unterschieden sich erheblich von denen von Saccharose, was darauf hindeutet, dass sie wahrscheinlich keine Liganden für den Transporter sind, niedrigere Spitzenströme hervorrufen oder höhere Spitzenstromreaktionen hervorrufen als Saccharose. Balken sind Mittelwerte ± SD; n = 4. Die Punkte stellen Einzelmessungen dar und alle Messungen wurden an einem einzigen Sensor durchgeführt. c, Chemische Strukturen von Glykosiden, die zum Screening von Substraten verwendet werden. Das Screening umfasst Monosaccharide (blau), Disaccharide (grün), Oligosaccharide (gelb), Zuckeralkohole (rosa) und andere Glucoside (orange). pNP-α-d-glc, p-Nitrophenyl-alpha-d-glucopyranosid; pNP-β-d-glc, p-Nitrophenyl-beta-d-glucopyranosid.

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Unsere Strukturanalyse, Funktionsstudien und MD-Simulationsdaten liefern ein Modell dafür, wie Saccharose von SUC1 erkannt wird, und identifizieren wichtige Strukturelemente, wie z. B. die Protonenbindungsstelle, die für die Funktion erforderlich sind. Der vermutete Protonenakzeptor/Donor Asp152 ist in Mitgliedern der SUT/SUC-Familie streng konserviert (Extended Data Abb. 1 und 6) und wurde zuvor als entscheidend für Saccharose-induzierte Transportströme von SUC1 und für das entsprechende Reisortholog OsSUT1 beschrieben ( Ref. 31,41). SUC1 weist deutliche Unterschiede zu anderen bekannten protonengekoppelten Symportern auf und stellt ein einzigartiges Modell für Symport dar. Erstens die direkte Kopplung zwischen Protonenstelle und Substratbindungsstelle. Zweitens steuert Gln50 auf der M1-Helix, das wir vorschlagen, den pKa von Asp152 auf der M4-Helix und bricht damit mit dem allgemeinen Muster der Verwendung eines basischen Rests für diese Funktion, wie es bei anderen Protonentransportern beobachtet wurde14,35,42. Aufgrund dieser beiden Faktoren ist die Bindung von Zucker direkt mit der Bindung von Protonen verbunden, was die Freisetzung von Zucker in eine Umgebung mit sehr hoher Saccharosekonzentration ermöglicht, solange das Proton dissoziiert. Der Aufbau legt ein enges Kopplungsverhältnis von 1:1 zwischen Proton und Saccharose nahe, in Übereinstimmung mit zuvor berichteten kinetischen Modellen34,43. Unsere Daten legen nahe, dass die Protonierung von Asp152 notwendig ist, um eine enge polare Wechselwirkung von der N-Domäne zur Glucosyleinheit des Substrats zu ermöglichen.

Diese enge und direkte Kopplung bietet einen zentralen Ausgangspunkt für die Erklärung, wie Mitglieder der SUT/SUC-Familie bei extremen Saccharosekonzentrationen im molaren Bereich arbeiten können. Die geringe Affinität von SUC1 ist eine Voraussetzung für den Saccharosetransport mit hoher Kapazität und zeigt sich an den Herausforderungen bei der Erfassung eines substratgebundenen Zustands sowohl in der Kristallographie als auch in der MD. Dennoch legen unsere Arbeiten nahe, dass die anfängliche Erkennung von Saccharose durch Wechselwirkungen des Glucosyls mit der protonierten N-Domäne vermittelt wird. Dies steht im Einklang mit früheren Erkenntnissen, dass die Glucosylhydroxylgruppen für die Substraterkennung von zentraler Bedeutung sind44,45,46,47. Wir stellen außerdem fest, dass Reste sowohl in der N- als auch in der C-Domäne während des gesamten Transportzyklus eine wichtige Rolle in der zentralen Bindungstasche spielen. Die Verteilung der beitragenden Reste teilt die Bindungstasche in zwei Hälften: Eine Hälfte trägt zu polaren Wechselwirkungen bei, hauptsächlich aus der N-Domäne; wohingegen die zweite Hälfte hydrophobe Eigenschaften aufweist, hauptsächlich aus der C-Domäne (Abb. 3a). Dies steht im Gegensatz zum Bindungsmodus von Glukosetransportern wie tierischen Glukosetransportern (GLUTs) und pflanzlichen Zuckertransportproteinen (STPs) aus der Sugar-Porter-Familie. Hier vermittelt die C-Domäne die meisten Kontakte über polare Wechselwirkungen zum Monosaccharid36,42,48,49. In den protonengesteuerten STPs verbindet die N-Domäne indirekt eine distale Protonenstelle mit der hochaffinen Bindung von Glucose an der zentralen Bindungsstelle36.

In der SUC1-Struktur spielt das perfekt konservierte Arg163 am Boden des Bindungshohlraums eine stabilisierende torartige Rolle, indem es Wasserstoffbrückenbindungen zum Rückgrat von Phe423 (M10) und der Seitenkette von Asn181 (M5) bildet. Der Ersatz durch ein Lysin konnte die Transportaktivität nicht ergänzen, was auf eine zentrale Rolle des Arginins beim Transport hinweist (Extended Data Abb. 6 und 7). Darüber hinaus sind die amphipathischen Helices des EHR, stabilisiert durch eine kritische Disulfidbrücke, und die amphipathische Helix im IHR unterschiedliche Strukturmerkmale. Eine Störung des IHR in Eizellentests hatte keine offensichtliche Auswirkung, wohingegen eine Störung des EHR die Aktivität eliminierte. Frühere Studien ergaben, dass Oxidationsmittel die Transporteraktivität erhöhen, wohingegen p-Chlormercuribenzolsulfonsäure, die kovalent an die SH-Gruppe von Cysteinen bindet, die Transportaktivität stark hemmt5. Es wurde vermutet, dass diese Beobachtungen mit der Dimerisierung von SUCs zusammenhängen. Unsere Ergebnisse befassen sich nicht direkt mit einer möglichen Dimerisierung, und die vorherigen Beobachtungen zur Transportaktivität können vollständig durch die Schlüsselrolle erklärt werden, die wir bei der EHR der Disulfidbrücke beobachten. Die genaue Rolle dieser amphipathischen Regionen und jeglicher Zusammenhang mit einer möglichen Dimerisierung bleibt jedoch unklar (Extended Data Abb. 5). Die SUC1-Architektur legt auch eine physiologische Funktion der linearen Abhängigkeit vom pH-Wert und Membranpotential nahe, die die SUC1-Transportaktivität aufweist6,34,50. Diese Abhängigkeit unterscheidet sich beispielsweise im Vergleich zu SUC2, das ein kanonisches pH-Optimum um pH 5,5 aufweist (Ref. 6,51). Da SUC1 mit Sink-Geweben verbunden ist, wo ein schneller Postphloem-Saccharosetransport zur Kontrolle der Sink-Stärke erforderlich ist, ist eine direkte 1:1-Abhängigkeit von der Protonenbindung für den Substrattransport sinnvoll. Die in SUC1 beobachtete enge Protonenkopplung bedeutet, dass die Konzentration des treibenden Substrats, die Protonenkonzentration, linear mit der Saccharose-Translokation verknüpft ist und eine Freisetzung gegen einen hohen Konzentrationsgradienten ermöglicht52. Die Änderung des Apoplasten-pH-Werts kann von der Pflanze reaktionsschnell genutzt werden, um die Transporteraktivität von SUC1 zu regulieren und zu optimieren, was durch die geringe passive Pufferkapazität des Apoplasten51 unterstützt wird. Eine Ansäuerung des Apoplasten im Wettbewerb mit Zuckertransportern invasiver Krankheitserreger würde sowohl die SUC1-Transportkapazität als auch die scheinbare Affinität erhöhen und gleichzeitig die Verringerung der Aktivität der Krankheitserregertransporter erleichtern.

Die GPH-Familie ist eine monovalente kationengetriebene Symporterfamilie und unsere Arbeit erklärt, wie diese Architektur in Pflanzen modifiziert wurde, um den protonengetriebenen Transport zu ermöglichen. In den bekannten Strukturen des bakteriellen Melibiose/Na+-Symporters MelB und des tierischen Lysophosphatidylcholin/Na+-Symporters MFSD2A21,53,54 bilden Reste an der äquivalenten Position zu Asp152 einen Teil der konservierten Natriumbindungsstelle, und MelB zeigt sogar Kationenpromiskuität, die in Teil, bestimmt die Substratselektivität. Die humane gelöste Trägerfamilie 45 (SLC45) ist ebenfalls mit der SUT/SUC-Familie verwandt und für die Melaninsynthese und eine Reihe damit verbundener Krankheiten relevant. In SLC45A2 führt die Mutation des zu Asp152 äquivalenten Rests zu okulokutanem Albinismus, was wiederum die entscheidende Rolle des Aspartats in Orthologen über Königreiche hinweg untermauert55. Darüber hinaus spielt der äquivalente Rest zu Arg163 eine wichtige Rolle bei der Substratbindung in der ligandengebundenen MelB-Struktur, und seine Mutation in MFSD2A von Säugetieren ist tödlich, was einmal mehr die Schlüsselrolle dieser Position innerhalb der GPH-Familie zeigt54,56.

Basierend auf unseren Daten schlagen wir vor, dass SUCs nach einem alternierenden Zugriffsmechanismus mit dem folgenden mechanistischen Modell für die Substraterkennung beim Transport funktionieren (Abb. 5). Im nach außen offenen Zustand ist ein großer Hohlraum zur apoplastischen Seite hin offen, der den Eintritt von Saccharose und Protonen ermöglicht. Die Saccharose setzt sich mit der Glucosyleinheit ab, die gegen Asp152 und die umgebenden Reste verschachtelt ist (Abb. 3d – e). Diese anfängliche Bindung mit geringer Affinität an die Glucosyleinheit hängt von der Protonierung von Asp152 ab. Nach der Saccharose- und Protonenbindung erzeugen Arg163 und andere Bindungstaschenreste in späteren Phasen der Substraterkennung weitere Saccharosekontakte. Dies bildet ein zweistufiges Erkennungsschema, das eine anfängliche Glucosyl-Erkennungsstelle und eine spätere Beteiligung von Arg163 an der Saccharose-Translokation umfasst, was mit früheren Studien übereinstimmt57. Dieser Erkennungsaufbau erklärt auch die breitere Substratpromiskuität gegenüber dem sekundären Saccharid des Substrats. Obwohl das Glucosyl relativ invariant ist, kann das Fructosyl leichter ausgetauscht werden (Abb. 4). Während des Transporterübergangs wird das intrazelluläre Netzwerk von Salzbrücken unterbrochen, während auf der extrazellulären Seite geladene und polare Reste wahrscheinlich Kontakte zwischen Helices bilden, um den Verschluss des Hohlraums von der apoplastischen Seite und die Stabilisierung in Richtung des inneren Zustands sicherzustellen, wie vorhergesagt Modelle und Oozytenmutagenesestudien (Extended Data Abb. 7a,b). Nach der Öffnung nach innen führen durch Gln50 gesteuerte pKa-Änderungen zur Deprotonierung von Asp152, um die Saccharosefreisetzung zu begünstigen.

Die N- und C-Domänen sind entsprechend der SUC1-Struktur gefärbt, wobei M1, M4, M7 und M10 als Cartoons hervorgehoben dargestellt sind. Saccharose wird in Grün und Blau dargestellt und das Proton wird als blaue Kugel dargestellt.

Zusammenfassend identifiziert unsere Arbeit Asp152 als Protonenbindungsstelle in der SUT/SUC-Familie und zeigt, wie die Saccharosebindung mit anfänglicher Erkennung des Glucosyls durch eine direkte Kopplung mit der Protonenbindung an dieser Stelle erreicht wird. Wir identifizieren Schlüsselelemente und Eigenschaften der Transporterfunktion und erklären einen zentralen molekularen Mechanismus hinter der Zuckersignalisierung, Stressreaktionen und die zentrale Triebkraft hinter der Gefäßbewegung von Saccharose und anderen gelösten Stoffen in Gefäßpflanzen.

Die cDNA von A. thaliana SUC1 (UniProt: Q39232) wurde in ein Expressionskonstrukt auf Basis von p423-GAL1 mit einer C-terminalen Thrombin-Spaltungsstelle und einem Decahistidin-Reinigungs-Tag eingeführt. Transformierte S. cerevisiae (Stamm DSY-5) wurden in einem Kulturgefäß durch Fed-Batch-Kultivierung zu hoher Dichte gezüchtet und nach einer 22-stündigen Induktion mit Galactose58 geerntet. Die geernteten Zellen wurden in kaltem Wasser gewaschen, zentrifugiert und in Puffer (100 mM Tris pH 7,5, 600 mM NaCl, 1,2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) resuspendiert, gefolgt vom Schlagen der Perlen mit 0,5 mm Glasperlen zur Lyse. Das Homogenat wurde 20 Minuten lang bei 17.568 g zentrifugiert, gefolgt von der Sedimentation der Membranen durch Ultrazentrifugation bei 200.000 g für 2 Stunden. Zellmembranen wurden homogenisiert und in Puffer (50 mM Tris pH 7,5, 500 mM NaCl, 20 % Glycerin) resuspendiert, bevor sie in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80 °C gelagert wurden. Die aufgetaute Zellmembran wurde in Puffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,5, 5 % (v/v) Saccharose) mit 1 % (w/v) n-Dodecyl-β-d-maltosid (DDM) und 0,1 % gelöst. (w/v) Cholesterinhemisuccinat (CHS) für 30 Minuten bei 4 °C. Unlösliches Material wurde durch 10-minütige Zentrifugation bei 5.000 g entfernt und der Überstand wurde unter Verwendung eines 1,2-μm-Filters (PALL) filtriert. Der Überstand wurde mit 20 mM Imidazol (pH 7,5) ergänzt und bei 3 ml min−1 auf eine 5 ml Ni-NTA-Säule (GE Healthcare) geladen. Die Säule wurde mit zehn Säulenvolumina Puffer (Solubilisierungspuffer, ergänzt mit 0,1 % DDM, 0,01 % CHS und 90 mM Imidazol, pH 7,5) und 20 Säulenvolumina Puffer (20 mM Tris, pH 7,5, 250 mM NaCl, 5 % (Vol.)) gewaschen /v) Saccharose, 0,02 % (w/v) DDM, 0,002 % (w/v) CHS und 0,5 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP)), ergänzt mit 40 mM Imidazol (pH 7,5). Das Protein wurde im gleichen Puffer mit 500 mM Imidazol (pH 7,5) eluiert und die eluierten Proteinproben wurden gepoolt, mit Rinderthrombin ergänzt, gefolgt von einer Dialyse über Nacht bei 4 °C in Puffer (20 mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES). ) pH 6,0, 250 mM NaCl, 5 % (v/v) Saccharose, 0,02 % (w/v) DDM, 0,002 % (w/v) CHS und 0,5 mM TCEP) unter Verwendung eines Molekulargewichts-Cutoffs von 12–14 kDa ( MWCO)-Schläuche (Spektrum). Am nächsten Tag wurde das Protein mit 50 mM Tris (pH 7,5) ergänzt und auf eine 5 ml Ni-NTA-Säule (GE Healthcare) geladen, um die Reinigungsmarkierung und Verunreinigungen zu entfernen. Protein wurde mit Puffer (20 mM Tris pH 7,5, 250 mM NaCl, 5 % (v/v) Saccharose, 0,02 % (w/v) DDM, 0,002 % (w/v) CHS und 0,5 mM TCEP) gesammelt, ergänzt mit 40 mM Imidazol (pH 7,5), konzentriert unter Verwendung einer 50 kDa MWCO-Spin-Säule (Vivaspin) und einer Superdex 200-Erhöhung 10/300 GL-Säule (GE Healthcare) in Puffer (20 mM MES pH 6,0, 250 mM NaCl, 5 % (v /v) Saccharose, 0,02 % (w/v) DDM, 0,002 % (w/v) CHS und 0,5 mM TCEP). Die Zusammensetzung des Größenausschlusspuffers wurde für die Probenstabilität optimiert59. Peakfraktionen wurden gepoolt und das Protein mithilfe einer 50 kDa MWCO-Spinsäule (Vivaspin) auf 14 mg ml–1 konzentriert.

SUC1 wurde in der kubischen Lipidphase kristallisiert. Gereinigtes Protein wurde mit Monoolein (Sigma) in einem Protein-zu-Lipid-Verhältnis von 1:1,5 unter Verwendung eines Spritzenmischers gemischt. Zur Kristallisation wurden 50 nl der Mesophase mit 1000 nl Kristallisationspuffer, der 43,5 % Polyethylenglykol 400 (Vol./Vol.), 0,25 M Ammoniumdihydrogenphosphat und 0,15 M Bistrispropan (pH 6,3) enthielt, auf Glas-Sandwichplatten unter Verwendung von gemischt ein Gryphon-Roboter (Art Robbins Instruments). Die kubischen Lipidphasenkristalle erschienen nach 1–2 Tagen und wuchsen bei 19 °C innerhalb einer Woche auf die volle Größe von 100 × 10 × 30 µm an. Die Kristalle wurden mit Dual Thickness MicroMounts LD (MiTeGen) gesammelt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren.

Nach einem umfassenden Screening wurde der endgültige Datensatz an der Diamond Light Source-Mikrofokus-Beamline I24 mit einem 20 × 20 µm-Strahl erfasst. Ein Einkristall wurde um 360° mit einem Oszillationswinkel von 0,10° mit Röntgenstrahlen mit einer Wellenlänge von 1,0 Å gebeugt. Der Datensatz wurde mit DIALS60 und AIMLESS61 über die XIA2-Pipeline62 in der triklinen Raumgruppe P1 (Punktgruppe 1) verarbeitet und skaliert, was auf das Vorhandensein von zwei SUC1-Molekülen in der asymmetrischen Einheit mit ~56 % Lösungsmittelgehalt schließen ließ. Bei Versuchen, das Phasenproblem zu lösen, wurden 65 Suchmodelle, die aus bekannten Strukturen von MFS-Mitgliedern generiert wurden, für den molekularen Ersatz verwendet. Es konnte jedoch keine für die Strukturlösung geeignete Lösung erhalten werden. Das Phasenproblem wurde durch molekularen Ersatz unter Verwendung von PHASER63 mit einem RoseTTAFold-vorhergesagten64 SUC1-Modell gelöst; RMSD-Schätzungen des Modells wurden vor endgültigen Änderungen des Suchmodells mit SCULPTOR65 in B-Faktoren umgewandelt. Diese Suche ergab eine Lösung mit einem Übersetzungsfunktions-Z-Score von 9 und einem Log-Likelihood-Gain-Score von 259 bei einem Auflösungsgrenzwert von 3,5 Å, wobei zwei Moleküle in der asymmetrischen Einheit ein nicht-physiologisches Dimer mit einer anfänglichen Rfree-Berechnung von 52 % bildeten. in Refmac66. Eine anfängliche Verfeinerung mit Refmac und eine Dichtemodifikation mit Histogrammanpassung, Lösungsmittelabflachung und Anisotropiekorrektur wurden durchgeführt, um die Suchmodellverzerrung mit Parrot67 in der CCP4-Suite68 zu reduzieren. Die Elektronendichtekarte ermöglichte die iterative Modellerstellung in Coot69 und die Verfeinerung mit phenix.refine unter Verwendung von 2mFO-DFc-Karten und generierte Feature Enhanced Maps70 unter Verwendung von Modellphasen. Wir haben die endgültige Verfeinerung in phenix.refine mit einer Verfeinerungsstrategie einzelner Standorte, einzelner Atomverschiebungsparameter (ADP) und Gruppentranslation-Libration-Schraube (neun Gruppen) sowie nichtkristallographischer Symmetriebeschränkungen gegen ein Maximum-Likelihood-Ziel mit Reflexionen in der 35 durchgeführt –2,68 Å Auflösungsbereich. Das endgültige Modell ergab einen freien R-Faktor (Rfree) von 29,30 % und einen R-Faktor (Rwork) von 26,96 % (Ergänzungstabelle 1). Die MolProbity71-Auswertung des Ramachandran-Diagramms ergab 98,31 % in bevorzugten Regionen und 0,13 % Ausreißer. Die Abbildungen wurden mit ChimeraX v.1.4 (Ref. 72) erstellt. Sequenz-Alignments wurden mit PROMALS3D73 erstellt. Ausrichtungen wurden mit ALINE v.1.0.025 (Ref. 74) visualisiert. Die Erhaltung der evolutionären Sequenz wurde mit ConSurf75 analysiert. Das elektrostatische Coulomb-Potential wurde in ChimeraX v.1.4 (Ref. 72) berechnet.

Polarer Sojalipidextrakt (Zusammensetzung (w/w), 45,7 % Phosphatidylcholin, 22,1 % Phosphatidylethanolamin, 18,4 % Phosphatidylinositol, 6,9 % Phosphatidsäure und 6,9 % andere Sojalipide) in Chloroform (Avanti) wurde getrocknet und in Rekonstitutionspuffer (30 mM) resuspendiert HEPES pH 7,4, 140 mM NaCl und 5 mM MgCl2). Die Liposomen wurden durch Extrudieren durch Polycarbonatmembranen mit einer Porengröße von 0,4 µm (Millipore) homogenisiert und n-Octyl-β-d-glucosid (Anatrace) wurde bis zu einer Endkonzentration von 1 % (v/v) zugegeben. Die Liposomensuspension wurde im Wasserbad dreimal für 1 Minute mit Ultraschall behandelt, mit einer Inkubation auf Eis für 1 Minute zwischen jeder Ultraschallbehandlung. Den Liposomen wurde gereinigtes Protein bis zu einem berechneten Lipid:Protein-Verhältnis von fünf zugesetzt. Das Detergens n-Octyl-β-d-glucosid wurde durch Inkubation mit 400 mg ml−1 Bio Beads (Bio-Rad) über Nacht bei 4 °C unter Verwendung eines Rotationsschüttlers entfernt. Proteoliposomen (5 mg ml−1) wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80 °C gelagert.

Die SSM-basierte Elektrophysiologie wurde an einem SURFE2R N1 (Nanion Technologies) durchgeführt. Bei allen Experimenten erfolgte die Vorbereitung der Sensoren wie beschrieben76. Proteoliposomen wurden 1:5 in nicht aktivierendem Puffer verdünnt, dreimal 10 s lang in einem Wasserbad beschallt und auf 3-mm-Sensoren aufgetragen, gefolgt von einer 30-minütigen Zentrifugation bei 2.100 g und 4 °C. Für Zuckertitrationsassays wurden sowohl nichtaktivierender als auch aktivierender Puffer aus demselben Hauptpuffer (5 mM MgCl2 und 100 mM Kaliumphosphatpuffer bei einem bestimmten pH-Wert) hergestellt. Der nicht aktivierende Puffer wurde mit 810 mM Mannitol ergänzt, einem strukturell verwandten Molekül, das nicht von SUC1 transportiert wird. Aktivierungspuffer wurde äquimolar durch Zugabe von 810 mM Saccharose hergestellt und anschließend mit nicht aktivierendem Puffer verdünnt, um die Osmolarität für alle während eines Experiments verwendeten Lösungen konstant zu halten. Es wurde ein einzelner Lösungsaustausch-Workflow verwendet. Datenpunkte stellen den Mittelwert aus drei unabhängigen Messungen dar. Für Substratspezifitätsmessungen wurden nichtaktivierende und aktivierende Puffer aus Hauptpuffer pH 5,5 hergestellt, wobei der aktivierende Puffer 10 mM des interessierenden Substrats enthielt. Der Assay wurde sowohl an Proben- als auch an Negativkontrollmembranen durchgeführt, um Ströme, die von SUC1 stammen, und Artefaktströme zu unterscheiden, die durch die verschiedenen Komponenten, die mit dem SSM interagieren, induziert werden. Um die SUC1-Transportströme für jedes einzelne Substrat zu bestimmen, wurde von den gemessenen Strömen für ein bestimmtes Substrat der Durchschnittswert der entsprechenden Negativkontrolle abgezogen. Die Daten stellen den Mittelwert von drei unabhängigen Messungen dar, die an einem einzelnen Sensor durchgeführt wurden, und wurden gemäß Saccharosemessungen normalisiert. Für die Messung unter symmetrischen pH-Bedingungen wurde eine einzelne Lösungsaustauschkonfiguration verwendet. Die Probe wurde zwischen den Messungen bei verschiedenen pH-Werten 6 Minuten lang bei einem bestimmten pH-Wert inkubiert, um den inneren pH-Wert der Proteoliposomen an den äußeren pH-Wert anzupassen. Spitzenströme wurden nach Zugabe von aktivierendem Puffer mit 10 mM Saccharose bei dem angegebenen pH-Wert gemessen. Für jeden Sensor wurde nach Messungen bei unterschiedlichen pH-Werten das Signal des Sensors beim anfänglichen neutralen pH-Wert erneut gemessen, um einen möglichen Signalverlust während der pH-Titration zu bewerten, der beispielsweise durch eine abnehmende Proteinstabilität bei unterschiedlichen pH-Werten verursacht wird. Diese Signalamplituden waren mit den ersten Messungen vergleichbar und zeigten, dass die Transporteraktivität während des gesamten Experiments erhalten blieb. Die Experimente wurden mindestens dreifach durchgeführt und die Daten wurden mit GraphPad Prism v.9 analysiert. Für die Kurvenanpassungsanalyse und die Km-Bestimmung wurde die Michaelis-Menten-Anpassung verwendet. Fehlerbalken stellen die SD dar. Da das Spitzenstromsignal ein kombinierter Effekt elektrogener Ereignisse aus der Bindung, dem Transport und der Abschirmung oder Neutralisierung von Strömen sein kann, verwenden wir den Kmapp-Parameter nur für den Saccharosetransport im gesamten Manuskript, der alternativ auch als beschrieben werden kann halbmaximale wirksame Konzentration. Im Symport haben wir mehr als ein Substrat, in diesem Fall Saccharose und H+. Für alle Fälle mit zwei Substraten wird der Km-Wert für ein Substrat im Prinzip durch Extrapolation auf unendliche Konzentrationen des zweiten Substrats bestimmt. Daher verwenden wir in Kmapp „app“, um hervorzuheben, dass die für Saccharose ermittelten Km-Werte speziell für den definierten pH-Wert gelten.

Die cDNA von A. thaliana SUC1 (UniProt: Q39232) wurde in den pNB1-U-Vektor77 und die GFP-Fusionsvariante des Vektors kloniert, die einen C-terminalen Glycin-Serin-Linker mit zehn Resten enthielt, gefolgt von der für eGFP kodierenden Gensequenz. Alle Mutationen wurden durch ortsspezifische Mutagenese mit einer Q5-Polymerase (New England Biolabs) erzeugt. Zur cDNA-Präparation wurden Gene durch PCR unter Verwendung von Standardprimern mit 5'- und 3'-untranslatierten Regionen amplifiziert (vorwärts, TTAACCCTCACTAAAGGGTTGTAATACGACTCACTATAGGG; rückwärts, TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATACTCAAGCTAGCCTCGAG), gefolgt von einer PCR-Reinigung (GeneJET PCR Purification, Thermo Fisher) nach Trennung auf 1 % Agarosegel. Die RNA wurde durch In-vitro-Transkription unter Verwendung des mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) synthetisiert. Kapillarnadeln für die RNA-Injektion wurden mit einem PC-10-Mikropipettenzieher (Narishige) hergestellt. Zur Expression wurden den Oozyten von , 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7,4) mit 10 IU ml−1 Gentamycin (Invitrogen). Für konzentrationsabhängige Aufnahmetests wurden Saccharosekonzentrationen im Bereich von 0,1 bis 20 mM in ND-96-Reaktionspuffer (96 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 5 mM MES pH 5,5) verwendet und [14C Zu jeder Zuckerlösung wurde Saccharose (PerkinElmer) in einer Konzentration von 1 μCi ml−1 hinzugefügt. Vor den Aufnahmetests wurden die Eizellen gewaschen und 5 Minuten lang in Reaktionspuffer vorinkubiert. Für den Aufnahmetest wurden Eizellen 30 Minuten lang im Reaktionspuffer bei einer bestimmten Saccharosekonzentration inkubiert. Sofern nicht ausdrücklich anders angegeben, wurden alle Tests bei einem pH-Wert von 5,5 durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von eiskaltem Reaktionspuffer, ergänzt mit 100 mM Saccharose, gestoppt, gefolgt vom sofortigen Waschen der Eizellen in eiskaltem Reaktionspuffer. Zur Kontrolle wurden Eizellen, denen reines Wasser anstelle von RNA injiziert wurde, auf ähnliche Weise inkubiert. In Konkurrenztests bestand der Reaktionspuffer aus 1 μCi ml−1 [14C]Saccharose, 0,5 mM Saccharose und einer 20-fach höheren Konzentration des konkurrierenden Zuckers (10 mM). Für den Aufnahmeaktivitätstest von Mutanten und pH-abhängige Aufnahmetests bestand der Reaktionspuffer aus 1 μCi ml−1 [14C]Saccharose und 1 mM Saccharose. Für die pH-abhängigen Tests wurde der Reaktionspuffer mit 50 mM Kaliumphosphat, eingestellt auf den beabsichtigten pH-Wert, oder 25 mM Citrat, eingestellt auf pH 3,5, 4,5 oder 5,5, in pH-abhängigen Tests von Mutanten ergänzt. Für zeitabhängige Aufnahmetests wurde eine Konzentration von 675 μM Saccharose (Sigma-Aldrich) verwendet und [14C]Saccharose bis zu einer Endkonzentration von 1 μCi ml−1 zugegeben. Jede Eizelle wurde als einzelnes Experiment behandelt. Die Eizellen wurden einzeln in ein Szintillationsfläschchen überführt und durch Zugabe von 100 μl einer 10 %igen SDS-Lösung und anschließendes sofortiges Vortexen aufgeschlossen. Jeder Probe wurde ein Volumen von 3 ml OptiPhase HiSafe 3-Szintillationsflüssigkeit (PerkinElmer) zugesetzt und die Radioaktivität wurde mit einem Tri-Carb 4910TR-Flüssigkeitsszintillationszähler (PerkinElmer) quantifiziert. Die Experimente wurden mindestens dreifach durchgeführt und die Daten wurden mit GraphPad Prism v.9 analysiert. Für die Kurvenanpassungsanalyse und die Km-Bestimmung wurde die Michaelis-Menten-Anpassung verwendet. Fehlerbalken stellen die SD dar. Um festzustellen, ob die Proteinlokalisierung durch Punktmutagenese beeinflusst wurde, wurde die zelluläre Lokalisierung an C-terminalen eGFP-fusionierten Wildtypen und Mutanten durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie analysiert. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop Zeiss LSM 780 Axio Imager 2 mit der Betriebssoftware ZEN v.3.5 aufgenommen. Wir verwendeten das 10-fach-Objektiv mit einer Anregungswellenlänge von 488 nm, einer Laserleistung von 2,55 % und einer Bildzeit von 7,75 s und zeigten ein Viertel eines optischen Schnitts einer Eizelle drei Tage nach der Injektion an. Da wir mehr als ein Substrat im Symport haben, wurden Kmapp-Werte wie in SSM-basierten elektrophysiologischen Tests erläutert verwendet.

Das vorhergesagte Modell von RoseTTAFold, das wir für die Phaseneinteilung des molekularen Ersatzes verwendet haben, und das vorhergesagte Modell von AlphaFold v.2 zeigen beide eine nach außen offene Konformation mit einem RMSD von Cɑ-Atomen zur experimentellen Struktur zwischen 1,6 und 2,5 Å. Daher sind die von der KI vorhergesagten Modelle zumindest für die Kernteile der Struktur recht genau. Um Reste zu identifizieren, die dafür verantwortlich sein könnten, dass der pKa von Asp152 den Protonierungszustand steuert, haben wir AlphaFold v.2 (Ref. 39) verwendet, um alternative Konformationen von SUC1 zu testen. Dies geschah durch Reduzierung der Tiefe des Input Multiple Sequence Alignment (MSA)40 und Modifizierung der SUC1-Input-Proteinsequenz durch Einführung von Alaninmutationen in Arg99, Arg100 und Arg357, die Reste des intrazellulären Netzwerks des stabilisierenden Interdomänen-Salzbrückennetzwerks sind SUC1 in der nach außen offenen Konformation. Vorhersageläufe wurden mit AlphaFold v.2.0.1 über den ColabFold-Server unter Verwendung des Notebooks AlphaFold2_advanced78 ausgeführt. Alle MSAs wurden mit dem MMSeqs2-Server79 erhalten und max_msa_clusters wurde auf 32 zufällig ausgewählte Sequenzcluster und max_extra_msa auf 64 zusätzliche Sequenzen reduziert, die zur Berechnung zusätzlicher zusammenfassender Statistiken verwendet wurden. Alle vorhergesagten Modelle wurden im Anschluss an ihre Vorhersage einer Amber-Relax-Behandlung unterzogen.

Kette A der Kristallstruktur von SUC1 wurde zunächst mit Maestro v.13.0 verarbeitet. Die Protonierungszustände ionisierbarer Reste wurden mit PROPKA80 bestimmt, wobei die apoplastische Seite des Transporters bei pH 5 und die zytoplasmatische Seite bei pH 7 lag. Bei der Auswahl der Tautomeren wurde die Wasserstoffbindung optimiert. Asp304 (pKa 7,47) wurde als protoniert modelliert; His65 (pKa 6,19), His205 (pKa 5,90) und His390 (pKa 6,25) waren dem apoplastischen Milieu ausgesetzt und wurden daher sowohl am Nδ als auch am Nε des Imidazolrings protoniert. His89 (pKa 6,14) war dem Zytoplasma zugewandt und wurde nur auf Nε protoniert. Asp152 (pKa 6,50), das sich im zentralen Hohlraum befindet, wurde sowohl in einem protonierten (Asp152(H)) als auch in einem deprotonierten (Asp152(−)) Zustand betrachtet. Die beobachtete Disulfidbrücke wurde zwischen Cys216 und Cys220 modelliert.

SUC1 wurde an der z-Achse ausgerichtet und in einer kubischen Box (90 × 90 × 118 Å3) platziert und von 188 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholin-Lipiden in einer x-y-Ebene umgeben. Das Protein-Membran-System wurde in übertragbarem intermolekularem Potential mit 3-Punkt-Wasser (TIP3P)81 und einer ladungsneutralisierenden 150 mM NaCl solvatisiert.

Der Zugriff auf die ersten Saccharosekoordinaten erfolgte über die Proteindatenbank „Research Collaboratory for Structural Bioinformatics“ (chemische Kennung PRD_900003). Um die Konformationslandschaft zu erkunden, wurde ein einzelnes Saccharosemolekül in eine Dodekaederbox gegeben, mit TIP3P-Wasser81 und 0,15 M NaCl solvatisiert und mit dem CHARMM36m-Kraftfeld82 in drei Wiederholungen und jeweils 1 μs simuliert.

Die aus diesen Simulationen resultierenden Konformationsstellungen von Saccharose wurden mithilfe des Gromos-Algorithmus83, der in der Gromacs-Analysesuite84 implementiert ist, mit einem Clustering-Grenzwert von 4 Å geclustert. Die mittlere Struktur des größten Clusters, bestehend aus der Hälfte aller Simulationsrahmen, wurde als repräsentative Saccharose-Pose verwendet. Die Platzierung dieser Saccharose-Position im zentralen Hohlraum von SUC1 wurde durch eine bakterielle homologe Melibiose-Permease MelB (PDB: 7L17) bestimmt, die mit 4-Nitrophenyl-α-d-galactopyranosid54 cokristallisiert wurde. Zunächst wurden die Strukturen von MelB und SUC1 basierend auf den Positionen von ausgerichtet Cα-Atome des Rückgrats. Als nächstes wurden die Ringkohlenstoffe der Glucosyleinheit von Saccharose an den Ringkohlenstoffen der in der MelB-Struktur vorhandenen Galactose ausgerichtet. SUC1 wurde mit zwei Protonierungszuständen von Asp152 modelliert: Asp152(−), was zu einer negativ geladenen Seitenkette führte und der Asp152(H)-Zustand (ungeladen). Die Simulationen für beide Systeme wurden mit dieser MelB-inspirierten identischen Saccharose-Pose initiiert (Extended Data Abb. 10a). Nach ~14 μs Simulationen zeigte die Simulation die stabilste Bindung des Substrats (Extended Data Abb. 10c), Wiederholung 2 von Asp152(H), wurde verwendet, um eine stabile Saccharose-Bindungsposition im zentralen Hohlraum von SUC1 zu extrahieren. Die Simulationstrajektorie wurde auf die anfänglichen Cα-Atome des Proteinrückgrats ausgerichtet. Der Gromos-Clusteralgorithmus83 wurde für die RMSD-Werte schwerer Saccharoseatome mit einem Grenzwert von 3,8 Å verwendet und die mittlere Struktur des größten Clusters (repräsentativ für 78 % der Frames der Flugbahn) wurde als Konformation der stabilen Saccharosebindung verwendet Pose in SUC1. Eine zweite Simulationsrunde wurde nun ausgehend von der identifizierten stabilen Saccharose-Pose und unter den beiden Protonierungsbedingungen von Asp152 gestartet (Extended Data Abb. 10a).

Alle Simulationen wurden mit dem Kraftfeld CHARMM36m82 und in der Simulationssoftware Gromacs 202084 durchgeführt. Zunächst wurden die Systeme mithilfe des Algorithmus für den steilsten Abstieg minimiert, bis die Kräfte konvergierten oder einen Maximalwert von 500 kJ mol−1 nm−1 erreichten. Die Temperatur wurde auf 296 K eingestellt, um die Wachstumsbedingungen von A. thaliana widerzuspiegeln. Die Temperatur wurde mit dem Berendsen-Thermostat85 während der Äquilibrierungsphase und einem Geschwindigkeits-Reskalierungsthermostat86 während des Produktionslaufs reguliert, wobei die Temperaturkopplung auf drei Gruppen angewendet wurde: Protein mit dem Substrat, Membran und Lösungsmittel. Für die reinen Saccharose-Simulationen gab es nur zwei gekoppelte Gruppen: Saccharose und Lösungsmittel. Der Druck von 1 atm wurde mit dem Berendsen-Barostat85 während der Äquilibrierung und dem Parrinello-Rahman-Barostat87 während der Produktionsläufe aufrechterhalten. Alle Simulationen, die eine Membran enthielten, wiesen einen semiisotropen Druckkopplungstyp auf, während Simulationen, die nur Saccharose enthielten, auf isotrope Weise simuliert wurden. Während der Produktionsläufe wurde der Integrationsschritt des Leapfrog-Algorithmus auf 2 fs eingestellt, während der LINCS-Beschränkungsalgorithmus88 auf alle mit Wasserstoffatomen im System verbundenen Bindungen angewendet wurde. Die Berechnung weitreichender elektrostatischer Wechselwirkungen wurde mit der Partikelnetz-Ewald-Methode89,90 durchgeführt, mit einem Grenzwert von 1,2 nm für Wechselwirkungen im realen Raum. Der Grenzwert für Van-der-Waals-Wechselwirkungen wurde auf 1,2 nm festgelegt, wobei ein Kraftschalter-Modifikator bei 1,0 nm angewendet wurde. Alle Systeme wurden unter Verwendung des Standard-CHARMM-GUI-Protokolls und mit allmählich abnehmenden Positionsbeschränkungen äquilibriert, beginnend bei 4.000 kJ mol−1 nm−2 für die Grundgerüstatome und Saccharoseringatome; 2.000 kJ mol−1 nm−2 für die Proteinseitenkettenatome und die verbleibenden schweren Saccharoseatome; und 1.000 kJ mol−1 nm−2 für das Phosphoratom jedes Lipids, die ausgewählten Diederwinkel der Glycerineinheit und des doppelgebundenen Segments des Lipidschwanzes. Die Äquilibrierungen wurden für 250 ps in einem kanonischen Ensemble (NVT) durchgeführt, gefolgt von 1,75 ns isotherm-isobaren Ensemble-Äquilibrierungen (NPT). Die Produktionsläufe für SUC1 in der Membran wurden ohne Positionsbeschränkungen in Wiederholungen von fünf oder zehn und bis zu einer Zeitskala von Mikrosekunden durchgeführt (Extended Data Abb. 10c).

Der RMSD für die Protein-Cα-Atome wurde in Gromacs84 anhand der Referenz-SUC1-Kristallstruktur berechnet. Der RMSD-Wert für Saccharose wurde mit der stabilen Saccharose-Pose als Referenz verglichen. Wenn eine Saccharose-Pose einen RMSD-Wert von weniger als oder gleich 3 Å aufwies, wurde das Substrat als gebunden betrachtet, wohingegen höhere RMSD-Werte die Pose als ungebunden bezeichneten. Die Protein-Saccharose-Wechselwirkungen wurden mit der ProLIF-Software91 bewertet, bei der Wasserstoffbrückenbindungen als Wechselwirkungen zwischen einem Donor und einem Akzeptor definiert sind, an denen ein Wasserstoff beteiligt ist, innerhalb eines Abstands von 3,5 Å und unter Bildung eines Winkels zwischen 130 und 180°. Hydrophobe Wechselwirkungen finden zwischen unpolaren Atomen statt, die in einem Abstand von weniger als oder gleich 4,5 Å angeordnet sind. Die gemittelten Kontaktkarten für Asp152(H)- und Asp152(−)-Systeme wurden erstellt, indem Frames aller Simulationen ausgehend von einer stabilen Saccharose-Pose berücksichtigt wurden, die Häufigkeit jeder Interaktion über alle Frames berechnet wurde und nur die Interaktionen visualisiert wurden, die für mindestens 25 auftreten % der gesamten Simulationszeit.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Atommodell- und Strukturfaktoren wurden in der Proteindatenbank (PDB: 8BB6) hinterlegt. Die MelB-Koordinaten, die zur Zuordnung der anfänglichen Saccharoseposition für MD verwendet werden, können von der Proteindatenbank (PDB:7L17) heruntergeladen werden. Die in dieser Studie verwendete SUC1-Proteinsequenz für A. thaliana ist öffentlich verfügbar bei UniProt (https://www.uniprot.org/) (UniProt: Q39232). Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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3.0.CO;2-H" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291096-987X%28199709%2918%3A12%3C1463%3A%3AAID-JCC4%3E3.0.CO%3B2-H" aria-label="Article reference 88" data-doi="10.1002/(SICI)1096-987X(199709)18:123.0.CO;2-H">Artikel CAS Google Scholar

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Referenzen herunterladen

Wir danken D. Stokes und U. Hammes für Kommentare zum Manuskript. Wir danken den Strahllinien I24 und I04 an der Diamond Light Source und der Strahllinie BioMAX am MAX IV-Labor, wo Röntgendaten gesammelt wurden, sowie DESY-PETRA III für das Kristallscreening. MD-Berechnungen wurden im Grendel-S-Cluster des Zentrums für wissenschaftliches Rechnen Aarhus durchgeführt. Wir danken auch M. Nadzieja (Pflanzenmolekularbiologie, Abteilung für Molekularbiologie und Genetik, Universität Aarhus) für die Unterweisung in konfokaler Lasermikroskopie. MD-Berechnungen wurden durch Zuschüsse der Novo Nordisk Foundation (NNF18OC0032608 und NF20OC0065431) und der Lundbeck Foundation (R346-2020-1944) an BS ermöglicht. Dieses Projekt wurde vom Europäischen Forschungsrat im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union gefördert ( Finanzhilfevereinbarung Nr. 101000936) an BPP

Abteilung für Molekularbiologie und Genetik, Universität Aarhus, Aarhus, Dänemark

Laust Bavnhøj, Jan Heiner Driller & Bjørn Panyella Pedersen

Fachbereich Chemie, Universität Aarhus, Aarhus, Dänemark

Lorena Zuzic, Amanda Dyrholm Stange & Birgit Schiøtt

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LB war an der Probenvorbereitung beteiligt. LB und BPP trugen zur Erhebung und Analyse von Strukturdaten bei. LB und JHD trugen zu Aktivitätstests bei. LZ, ADS und BS haben zu MD-Simulationen beigetragen.

Korrespondenz mit Bjørn Panyella Pedersen.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Plants dankt John Ward und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Übereinstimmung zwischen A. thaliana SUC1 (Zugangsnummer Q39232), SUC2 (Zugangsnummer Q39231), SUC3 (Zugangsnummer O80605), SUC4 (Zugangsnummer Q9FE59), SUC5 (Zugangsnummer Q9C8X2), SUC6 (Zugangsnummer Q6A329), SUC7 (Zugang Nummer Q67YF8), SUC8 (Zugangsnummer Q9ZVK6), SUC9 (Zugangsnummer Q9FG00). Konservierte Rückstände werden durch Graustufen hervorgehoben, wobei Schwarz perfekt erhalten bleibt. Farbige Röhren stellen α-Helices dar, die in der N-Domäne (cyan), EHR und IHR (grau) und der C-Domäne (orange) vorkommen. Schlüsselreste sind oberhalb der α-Helix-Markierungen nummeriert. Wichtige Reste sind grün hervorgehoben, mit Ausnahme des Protonendonor/Akzeptorpaares in Rot (Asp152) und Blau (Gln50). Die Cysteine, die die Disulfidbrücke zwischen EHR und M6 bilden, sind gelb hervorgehoben. Die A-Motive, die die MFS-Superfamilie bezeichnen, sind hellblau hervorgehoben. Die posttranslationale Phosphorylierungsstelle am N-Terminus92 ist hellmagentafarben. Die Mutation dieses Stellenrests (Ser20) zu Alanin in SUC1 hatte keinen Einfluss auf die Aufnahme in Eizellen im Vergleich zum Wildtyp (Erweiterte Daten, Abb. 7b).

a, Größenausschlusschromatographieprofil von SUC1 und repräsentatives SDS-PAGE-Gel des gereinigten SUC1-Proteins. Unabhängige Experimente wurden dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. b: Foto mit polarisiertem Licht und Hellfeldfoto von SUC1-Kristallen im kubischen Lipidphasenaufbau. Unabhängige Experimente wurden dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. c, Asymmetrische Einheit und Kristallpackung von SUC1. d, Das Rückgrat von SUC1, gefärbt durch den atomaren Verschiebungsfaktor (B-Faktor) mit einem Regenbogengradienten von niedrig/blau (29,91 Å2) bis hoch/rot (103,48 Å2) mit einem Mittelwert von 47,10 Å2.

a, Aufnahme von Saccharose in SUC1-exprimierende Eizellen (schwarze Kreise) und mit Wasser injizierte Eizellen (leere Kreise) bei einer anfänglichen Außenkonzentration von 1 mM Saccharose bei pH 5,5. Datenpunkte sind Mittelwert ± SD; n = 4 Eizellen und jede Eizelle stellt individuelle Messungen dar. b: Der Oozytenaufnahmetest zeigt eine klassische pH-Abhängigkeit, die linear mit der externen Protonenkonzentration über den brauchbaren Bereich des Versuchsaufbaus skaliert. Der Transport wurde bei pH 3,5–9,5 in Phosphatpuffer gemessen. Alle Messungen wurden in Gegenwart von 1 mM Saccharose durchgeführt. Balken sind Mittelwerte ± SD; Datenpunkte sind einzelne Experimente (n = 4 (pH 3,5, 4,5, 5,5), n = 5 (pH 8,5, 9,5), n = 6 (pH 6,5, 7,5). c, Spitzenströme unter Verwendung der SSM-Elektrophysiologie für den SUC1 WT Proteoliposomen, die durch Zugabe von 10 mM Saccharose bei dem angegebenen symmetrischen pH-Wert (pHin = pHout) hervorgerufen wurden. Balken sind Mittelwerte ± Standardabweichung und n = 4. Die Punkte sind Einzelmessungen.

Quelldaten

Gewichtete 2mFo-DFc-Dichte bei 1σ der nach außen offenen SUC1-Struktur (Monomer, Kette A) mit überlagerten endgültigen Modellelementen, einschließlich M1 bis M12, EHR-Helix, C216-C220-Disulfidbrücke, IHR-Helix und vollständigem Modell, dargestellt als Lakritze mit Wasser ( rote Punkte) enthalten.

a, Seitenansichten der SUC1-Struktur mit molekularem Lipophiliepotential (MLP), dargestellt als molekulare Oberfläche und gefärbt von dunklem Cyan (am hydrophilsten) bis dunkelgolden (am lipophilsten). Einschübe heben helikale Regionen an den Plasmamembranblättern hervor. Membrangrenzen (äußeres Blättchen; blau, inneres Blättchen; rot) wurden mit dem PPM-Webserver93 berechnet. b: Amphipathischer intrazellulärer helikaler Bereich (IHR), dargestellt als Cartoon mit markierten Resten als Stäbchen (links), gefärbt entsprechend der Lipophilie wie in Tafel A und Edmundson-Rad-Projektionsdiagramm der Reste des helikalen Bereichs mit hydrophoben Resten, die dem inneren Blättchen der Plasmamembran zugewandt sind und polare Reste, die dem Zytoplasma zugewandt sind (rechts). c: Amphipathischer extrazellulärer helikaler Bereich (EHR), dargestellt als Cartoon und markierte Reste als Stäbchen (links), gefärbt entsprechend der Lipophilie, wie in Tafel A und Edmundson-Rad-Projektionsdiagramm der Reste des helikalen Bereichs mit hydrophoben Resten, die dem äußeren Blättchen der Plasmamembran zugewandt sind und polare Reste, die dem Apoplasten zugewandt sind. d, Oozytenaufnahmetest für SUC1-Mutanten, die auf das IHR abzielen. Die Aufnahmeaktivitäten sind auf die des Wildtyps normalisiert. Die Kontrolle besteht aus mit Wasser injizierten Eizellen. Balken sind Mittelwerte ± SD. Datenpunkte sind einzelne Experimente (n = 6 (I272S/F273S,E271A,F276S), n = 7 (L268S/F269S), n = 11 (L268S/F269S/I272S/F273S/F276S), n = 16(WT)). P-Werte für Unterschiede zwischen Wildtyp und Varianten stammten aus einer einfaktoriellen ANOVA-Analyse, gefolgt von Dunnetts Mehrfachvergleichstest (p = 0,9145 (L268S/F269S/I272S/F273S/F278S), p = 0,2915 (I272S/F273S), p = 0,8544 (F276S), p = 0,6264 (E271A)). e, Oozytenaufnahmetest für SUC1-Mutanten, die auf die EHR abzielen. Die Aufnahmeaktivitäten sind auf die des Wildtyps normalisiert. Die Kontrolle besteht aus mit Wasser injizierten Eizellen. Balken sind Mittelwerte ± SD. Datenpunkte sind einzelne Experimente (n = 3 (L204S/M207S, F208S), n = 6 (L204A/M207A/F208A), n = 7 (C216A), n = 16 (WT)). Die P-Werte für Unterschiede zwischen Wildtyp und Varianten stammten aus einer einfaktoriellen ANOVA-Analyse, gefolgt von Dunnetts Mehrfachvergleichstest (p = 0,4290 (L204A/M207A/F208A)).

Quelldaten

Konservierung der Reste in SUC1 (dargestellt als Cartoon) zwischen SUC-Sequenzen (mit 35–95 % seq. ID zu SUC1) über Pflanzenarten hinweg, wie von ConSurf erhalten. Die Rückstände (dargestellt als Stäbchen) sind von variabel (Cyan) bis vollständig konserviert (Magenta) gefärbt.

a, Extrazelluläre und intrazelluläre geladene Reste mit markierten Resten, die an der Salzbrückenbildung (schwarze Schrift) oder Wasserstoffbrückenbindungen (graue Schrift) in der nach außen offenen SUC1-Kristallstruktur und im von AlphaFold2 vorhergesagten nach innen offenen SUC1-Zustand beteiligt sind. Gelbe Striche zeigen Wasserstoffbrückenbindungen an (Abstands- und Winkelgrenzen für H-Brückenbindungen, wie in den Standardeinstellungen in chimeraX v1.4 definiert). b: Oozytenaufnahmetest für SUC1-Mutanten, die auf die in der Struktur (intrazelluläres Netzwerk) beobachteten oder vorhergesagten (vorhergesagtes extrazelluläres Netzwerk) beobachteten Wasserstoffbrückenbindungen und Salzbrückennetzwerke sowie auf die SUC1-Phosphorylierungsstelle auf Ser20 (P-Stelle) abzielen. Die Aufnahmeaktivitäten sind auf die des Wildtyps normalisiert. Balken sind Mittelwerte ± SD. Datenpunkte sind einzelne Experimente (n = 5 (D304N), n = 6 (D123N, R139A), n = 7 (H65K, D91N, R163K, D306N, E353Q), n = 10 (S20A), n = 13 (WT)). Die P-Werte für Unterschiede zwischen Wildtyp und Varianten stammten aus einer einfaktoriellen ANOVA-Analyse, gefolgt von Dunnetts Mehrfachvergleichstest (p = 0,1624 (S20A), p = 0,9729 (H65K)). Die Farben entsprechen der Restposition in Abb. 1e. c: AlphaFold2-Vorhersage des nach innen offenen SUC1-Modells (grau), überlagert mit der experimentell bestimmten nach außen offenen SUC1-Kristallstruktur (cyan). Gelbe Striche zeigen Wasserstoffbrückenbindungen an und graue Pfeile zeigen die Hauptbewegung der M1-Helix mit Gln50 an (Abstands- und Winkelgrenzen für H-Brückenbindungen, wie in den Standardeinstellungen in chimeraX v1.4 definiert).

Quelldaten

a, Oozytenaufnahmetest ohne oder mit Zusatz von 20-fachem (20 mM) CCCP (hellgrau) bei pH 5,5. Als Kontrolle für die Aufnahme dienten mit Wasser injizierte Eizellen (kein Protein). P-Werte für Unterschiede zwischen der Kontrolle (Saccharoseaufnahme) und keinem Protein und CCP stammten aus einer einfaktoriellen ANOVA-Analyse, gefolgt von Dunnetts Mehrfachvergleichstest. P-Werte sind in der Abbildung dargestellt. Balken sind Mittelwerte ± SD; Datenpunkte sind einzelne Experimente (n = 4 (Saccharoseaufnahme), n = 5 (CCCP), n = 7 (kein Protein)). b, Spitzenströme, bestimmt durch SSM-Elektrophysiologie an SUC1-Proteoliposomen bei symmetrischen pH-Werten wie angegeben. Der Transport wurde durch die Michaelis-Menten-Kinetik durch eine nichtlineare Anpassungsanalyse beschrieben. Graue Kreise zeigen Spitzenströme von einem Sensor mit präparierten proteinleeren Liposomen. Datenpunkte sind Mittelwerte ± Standardabweichung (n = 3 biologisch unabhängige Experimente).

Quelldaten

SUC1 und entsprechende Mutanten, die ein C-terminales GFP beherbergen, zeigen eine ähnliche Lokalisierung auf der Plasmamembran von Xenopus laevis-Oozyten. Unabhängige Experimente wurden zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

a, Flussdiagramm der MD-Analyse. b, rmsd Cα-Backbone-Trace im Verlauf aller MD-Simulationen. Alle Läufe im Vergleich zur Kristallstruktur. c, Vergleich des zeitlichen Verlaufs des RMSD von Saccharose aus anfänglichen Simulationen, die mit Saccharose in der „MelB-inspirierten“ Ausgangsposition durchgeführt wurden, wobei Asp152 entweder protoniert (Asp152(H)) oder deprotoniert (Asp152(−)) war. Die stabile Bindung von Saccharose an SUC1 ist durch den dunkelblauen Hintergrund gekennzeichnet. d, Kontaktkarten zwischen Saccharoseatomen und SUC1-Resten in allen fünf Wiederholungen, die mit Saccharose beginnend in der identifizierten stabilen Pose durchgeführt wurden. Berechnete Kontakte zwischen Atomen werden durch die Interaktionskriterien definiert, die von der ProLIF-Software91 bereitgestellt werden. Es werden nur Wechselwirkungen berücksichtigt, die in mindestens 25 % der Frames auftreten, und umfassen Wasserstoffbrückenbindungswechselwirkungen (blau) und hydrophobe Wechselwirkungen (rot). e, Vergleich des zeitlichen Verlaufs des RMSD von Saccharose aus Simulationen, die mit Saccharose in der identifizierten stabilen Ausgangsposition durchgeführt wurden, auch dargestellt als Nadel/Nadel mit Kopf, der die Glucosyleinheit darstellt, mit zwei unterschiedlichen Protonierungszuständen von Asp152: Asp152(H) und Asp152 (−) jeweils in fünf unabhängigen Wiederholungen. Der Hintergrund des RMSD-Diagramms zeigt die gebundene (dunkelblau) oder ungebundene (hellblau) Position der Saccharose an.

Ergänzende Tabelle 1. Statistiken zur Datenerfassung und -verfeinerung.

Aufnahmetest, Rohwerte pro Minute. SSM-Elektrophysiologie, Spitzenströme.

Aufnahmetest, Rohwerte pro Minute. SSM-Elektrophysiologie, Spitzenströme.

Aufnahmetest, Rohwerte pro Minute.

Aufnahmetest, Rohwerte pro Minute. SSM-Elektrophysiologie, Spitzenströme.

Aufnahmetest, Rohwerte pro Minute. SSM-Elektrophysiologie, Spitzenströme.

Aufnahmetest, Rohwerte pro Minute.

Aufnahmetest, Rohwerte pro Minute.

Aufnahmetest, Rohwerte pro Minute. SSM-Elektrophysiologie, Spitzenströme.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Bavnhøj, L., Driller, JH, Zuzic, L. et al. Struktur und Saccharose-Bindungsmechanismus des pflanzlichen SUC1-Saccharosetransporters. Nat. Pflanzen (2023). https://doi.org/10.1038/s41477-023-01421-0

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Eingegangen: 21. November 2022

Angenommen: 19. April 2023

Veröffentlicht: 15. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41477-023-01421-0

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Naturpflanzen (2023)