Regulierung des lebensfähigen/inaktivierten/lysierten probiotischen Lactobacillus plantarum H6 auf Darmmikrobiota und Metaboliten bei hypercholesterinämischen Mäusen

npj Science of Food Band 6, Artikelnummer: 50 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Es gibt Hinweise darauf, dass probiotische Interventionen das Risiko nichtübertragbarer Krankheiten (NCDs) verringern. Allerdings sind seine therapeutische Wirkung und sein Mechanismus noch unklar. Um die hypocholesterinämische Wirkung von Lactobacillus plantarum H6 (Lp H6), einem neuen kommerziellen Patentstamm, der Hypercholesterinämie verhindern kann, und seinen Mechanismus im Detail zu bewerten, wurden drei Zustände des Stammes hergestellt, nämlich lebensfähig (vH6), hitzeinaktiviert (iH6). ) und ultraschalllysierte (uH6) Bakterienzellen. Die Ergebnisse zeigten, dass v/i/uH6-Zellen die Blutfettwerte im Serum und in der Leber senken, Leberschäden lindern und die Indizes des Glukosetoleranztests (GTT) und des Insulintoleranztests (ITT) verbessern können. v/i/uH6-Zellen verbesserten die mikrobielle Zusammensetzung des Darms und reduzierten das Verhältnis von Firmicutes zu Bacteroidetes (F/B-Verhältnis) im Stuhl deutlich. Insbesondere Muribaculaceae könnten ein potenzieller Biomarker für eine wirksame Cholesterinsenkung sein. Auch die Wiederherstellung dieser biochemischen Indizes und des Darmmikrobioms wurde nach einer fäkalen Mikrobiota-Transplantation (FMT) unter Verwendung von Stuhl von mit vH6 behandelten Mäusen festgestellt. Die v/i/uH6-Zellen erhöhten den Metabolismus von Vitamin-Cofaktoren sowie Aminosäuren in der Darmflora und verringerten gleichzeitig den relativen Gehalt an primären Gallensäuren. Die Pearson-Korrelationsanalyse zeigte, dass norank_f__Muribaculaceae und Lactobacillus eine negative Korrelation mit den Blutfettwerten hatten. Insgesamt waren v/i/uH6-Zellen wirksam bei der Verbesserung der Hypercholesterinämie bei Mäusen, und dieser Effekt wurde teilweise auf die Regulierung der Darmmikrobiota und der Metaboliten im Zusammenhang mit dem Lipidstoffwechsel zurückgeführt. Unsere Erkenntnisse lieferten eine theoretische Grundlage für die industrielle Entwicklung von Probiotika und Postbiotika sowie die Behandlung von Cholesterinerkrankungen.

Der Cholesterinspiegel im menschlichen Körper spielt eine wichtige Rolle für die normale Zell- und Funktionsfähigkeit. Überhöhte Werte können jedoch zu Problemen mit dem Fettstoffwechsel führen und das Risiko nichtübertragbarer Krankheiten (NCDs) wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) und nichtalkoholischer Steatohepatitis (NASH) erhöhen. , Fettleibigkeit usw.1. Laut der Weltgesundheitsstatistik aus dem Jahr 2021 bleiben Herz-Kreislauf-Erkrankungen die häufigste Todesursache durch nichtübertragbare Krankheiten, insbesondere in Entwicklungsländern mit niedrigem Einkommen2. Daher ist die wirksame Aufrechterhaltung eines normalen Cholesterinspiegels ein wichtiges Thema für die öffentliche Gesundheit. Statine und Fibrate sind die am häufigsten verwendeten cholesterinsenkenden Medikamente, aber eine langfristige Einnahme kann schwerwiegende Nebenwirkungen haben, einschließlich eines erhöhten Risikos für Rhabdomyolyse, allergisches Syndrom und kognitive Beeinträchtigung3.

In den letzten Jahren hat die cholesterinsenkende Wirkung von Probiotika die Aufmerksamkeit von Forschern auf sich gezogen4. Im Vergleich zur medikamentösen Therapie werden ihre Eigenschaften wie hohe Effizienz, Sicherheit und Wirtschaftlichkeit von den Verbrauchern bevorzugt. Studien haben gezeigt, dass Lactobacillus plantarum NCU116 auch den Lipidstoffwechsel bei Ratten mit Hyperlipidämie wirksam regulieren kann, und zwar ausreichend, um den Gesamtcholesterinspiegel (TC) bei Ratten mit Hyperlipidämie zu senken, und das Potenzial hat, den Lipidstoffwechsel sowie die Leber- und Fettgewebemorphologie zu regulieren5. Sowohl lebende als auch ultraschallinaktivierte Lacticaseibacillus casei waren in der Lage, den TC-Spiegel zu senken und die Insulinresistenz bei männlichen Ratten zu kontrollieren, die eine fettreiche Diät erhielten6. Probiotika können den Cholesterinspiegel senken, indem sie die Darmmikrobiota und ihre Metaboliten regulieren7. Die Veränderung der Darmmikrobiota, die als „zweites Gehirn“ des menschlichen Körpers bekannt ist, kann sich auf die Energiehomöostase, systemische Entzündungen, den Fettstoffwechsel, den Glukosehaushalt und die Insulinsensitivität des Wirts auswirken8. Darüber hinaus können der Reichtum und die Vielfalt der Darmmikrobiota, insbesondere das Verhältnis von Firmicutes zu Bacteroidetes (F/B-Verhältnis)9, durch die Einnahme von Probiotika deutlich verbessert werden. Der Einsatz der fäkalen Mikrobiota-Transplantation (FMT) hat gezeigt, dass die Regulierung der Darmmikrobiota das metabolische Syndrom wirksam behandeln kann10.

Gegenwärtig wurden viele probiotische Produkte zur Regulierung des Cholesterinspiegels entwickelt, aber alle konzentrieren sich auf lebende Bakterien, um einen Anstieg des Cholesterinspiegels zu verhindern. Darüber hinaus ergaben einige Studien, dass tote Bakterien und ihre Metaboliten, sogenannte „Postbiotika“11,12, immer noch physiologische Aktivität haben können13. Zuvor identifizierte unser Team einen probiotischen Stamm Lactobacillus plantarum H6 (Lp H6, CGMCC 18205, Patent Nr. ZL 201910955071. X) mit guter Verträglichkeit im Verdauungstrakt. Der Stamm H6 wurde zu einem Massenprodukt entwickelt. Die In-vitro-Cholesterin-Clearance-Fähigkeit von H6 erreichte 92,07 %, und Tierversuche haben gezeigt, dass es die durch eine cholesterinreiche Ernährung verursachte Dysbiose der Darmmikrobiota und Leberschäden wirksam lindern kann14. In dieser Studie wurden die regulatorische Wirkung von lebensfähigem, inaktiviertem und ultraschalllysiertem Lp H6 auf Cholesterin und sein Einfluss auf die Darmmikrobiota bewertet und die therapeutischen Wirkungen von Lp H6 auf hypercholesterinämische Mäuse systematisch untersucht, was eine theoretische Grundlage für die Industrie lieferte Entwicklung von Probiotika und Behandlung von Cholesterinerkrankungen.

Im Vergleich zur ND-Gruppe wies die HCD-Gruppe keine signifikanten Unterschiede in der Nahrungsaufnahme und Gewichtszunahme auf (ergänzende Abbildung 1a), während TC und Triglycerid (TG) im Serum und in der Leber von Mäusen in der HCD-Gruppe signifikant anstiegen und der Gehalt signifikant anstieg betrug etwa das Zwei- bis Dreifache der ND-Gruppe (Abb. 1a), was darauf hinweist, dass das Hypercholesterinämie-Mäusemodell erfolgreich etabliert wurde.

a Serum-TC- und TG- und Leber-TC- und TG-Spiegel bei Hypercholesterinämie-Modellmäusen. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (n = 6) dargestellt. ***P < 0,001, ****P < 0,0001 vs. Kontroll-ND. b Serum-TC-, TG-, LDL-C-, High-Density-Lipoprotein-Cholesterin- (HDL-C), ALT- und AST-Spiegel nach 12 Wochen. c Lebergewicht, TC- und TG-Werte. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (n = 8) dargestellt. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001 vs. Kontrolle HCD_ND; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 vs. Kontroll-FMT1. HCD_ND bezieht sich auf die Gruppe der Hypercholesterinämie-Modellmäuse; v/i/uH6 bezieht sich auf lebensfähige (vH6), hitzeinaktivierte (iH6) und ultraschalllysierte (uH6) Bakterienzellen; FMT1/2/3 bezieht sich auf die Verwendung von Fäkalien aus den Gruppen HCD_ND, Sim und vH6.

Im Vergleich zur HCD_ND-Gruppe waren nach 12-wöchiger Behandlung mit v/i/uH6 und FMT3 die physikochemischen Indizes im Zusammenhang mit dem Lipidstoffwechsel im Mäuseserum verbessert (Abb. 1b), der TC war signifikant verringert, insbesondere der Serum-TC im FMT3 Gruppe, die um 43,98 % zurückging (P < 0,05). Die Serum-TG-Spiegel von Mäusen, denen vH6 und FMT3 verabreicht wurden, waren signifikant um 18,69 % bzw. 17,17 % verringert (P < 0,05). Im Vergleich zur HCD-Gruppe waren die Low-Density-Lipoprotein-Cholesterinspiegel (LDL-C) bei Gabe von vH6, uH6 und FMT3 signifikant niedriger (0,18–0,34 mmol/L vs. 1,5 mmoL). Darüber hinaus reduzierten v/i/uH6 und FMT3 die Serum-Alanin-Aminotransferase (ALT)-Spiegel von Mäusen signifikant, insbesondere von denen, denen vH6 und iH6 verabreicht wurden (10,76 U/L bzw. 11,58 U/L). vH6 und FMT3 senkten die Serum-Aspartat-Aminotransferase (AST)-Spiegel signifikant (P < 0,05).

v/i/uH6 und FMT3 verbesserten in ähnlicher Weise das Lebergewicht sowie den TC- und TG-Gehalt (außer iH6) von Mäusen (Abb. 1c). Wenn beispielsweise vH6 und iH6 verabreicht wurden, verringerte sich das Lebergewicht um 21,27 % bzw. 22,10 % (P < 0,05). v/i/uH6 verringerte TC um 30,44 %, 24,49 % bzw. 35,67 % (P < 0,05). Insgesamt verbesserten v/i/uH6 und FMT3 die physikochemischen Eigenschaften von Serum und Leber, einschließlich niedrigerer TC, TG, LDL-C, ALT, AST im Serum und TC, TG in der Leber auf verschiedenen Ebenen.

Mit HCD gefütterte Mäuse zeigten eine Hepatomegalie mit einem grau-gelben Farbton. Allerdings hemmten v/i/uH6 und FMT3 die Hepatomegalie, die Farbe (rötlich-braun) und die weiche Textur der Leber waren nahezu normal. (Abb. 2a). Die HE-Färbung zeigte, dass in der HCD-Gruppe die Anordnung der Leberzellen locker und ungeordnet war, eine große Anzahl von Fettvakuolen unterschiedlicher Größe und Anzahl auftrat, die Leberzellen vergrößert und teilweise nekrotisch waren und die Leberzellen schwer geschädigt waren. (Abb. 2b). Wenn Mäuse mit v/i/uH6 und FMT3 behandelt wurden, wurde die Schädigung der Leberzellen offensichtlich reduziert, die Fetttröpfchen im Zytoplasma wurden reduziert und die Leberzellen waren ordentlich angeordnet.

a Bilder von Mäuselebern nach verschiedenen Behandlungen. b, c Repräsentative Bilder der H/E-Färbung und Oil Red O-Färbung von Leberschnitten (400×, Maßstabsbalken = 50 μm). Einige lokal beschädigte Teile der Hepatozyten werden durch gelbe Pfeile in der H/E-Färbung angezeigt. d Repräsentative Bilder der Immunfluoreszenzfärbung von Leberschnitten mit Anti-UCP1 (400×, Maßstab = 50 μm). HCD_ND bezieht sich auf die Gruppe der Hypercholesterinämie-Modellmäuse; v/i/uH6 bezieht sich auf lebensfähige (vH6), hitzeinaktivierte (iH6) und ultraschalllysierte (uH6) Bakterienzellen; FMT1/2/3 bezieht sich auf die Verwendung von Fäkalien aus den Gruppen HCD_ND, Sim und vH6.

Die Ölrot-O-Färbung zeigte, dass Leberlipidtröpfchen in Hepatozyten von HCD-Mäusen eine Partikelansammlung und Verschmelzung zu Flocken zeigten (Abb. 2c). Wenn Mäuse jedoch mit vH6, iH6 und FMT3 behandelt wurden, waren die Lipidtröpfchen deutlich geringer, die Größe war kleiner und die Verteilung war unregelmäßig und ungleichmäßig.

Die Expression von UCP1 in Lebergeweben wurde durch immunhistochemische Färbung nachgewiesen (Abb. 2d). Im Vergleich zu HCD_ND und FMT1 war die UCP1-Expression bei Mäusen, denen vH6, iH6 und FMT3 verabreicht wurde, deutlich erhöht, und es gab einen großen Bereich positiver brauner Partikel im Lebergewebe. Zusammenfassend kann beobachtet werden, dass v/i/u H6 und FMT3 durch die Färbung von Leberschnitten die Leberdegeneration in unterschiedlichem Ausmaß verbessern.

In der HCD-Gruppe war der Glukosespiegel der Mäuse gestört und der Blutzuckerspiegel stieg stark an. v/i/uH6 und FMT3 verringerten die Werte der Fläche unter der Kurve (AUC), die der Glukosetoleranz bei Mäusen entsprechen, die in den uH6- und FMT3-Gruppen um 23,89 % bzw. 20,50 % signifikant verringert waren (P < 0,05, Abb. 3a, B). In ähnlicher Weise verbesserten v/i/uH6 und FMT3 die Insulintoleranz von Mäusen, was durch verringerte Glukose- und niedrigere AUC-Werte im Insulintoleranztest belegt wurde, die bei vH6, iH6 signifikant um 19,53 %, 15,10 % und 8,35 % verringert waren bzw. FMT3-Gruppen (P <0, 05, Abb. 3c, d). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass v/i/uH6 und FMT3 die Glukose- und Insulintoleranz bei hypercholesterinämischen Mäusen verbessern können.

a, b GTT: Mäusen, die über Nacht gefastet hatten, wurde Glucose (2 mg/kg) intraperitoneal injiziert. Anschließend wurde der Blutzucker nach 0, 15, 30, 60 und 120 Minuten bestimmt. c, d ITT: Mäusen, die 4 Stunden lang gefastet hatten, wurde Insulin (0,75 U/kg) injiziert. Anschließend wurde der Blutzucker nach 0, 15, 30, 60 und 120 Minuten bestimmt. Der AUC-Wert wurde berechnet. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (n = 8) dargestellt. *P < 0,05, **P < 0,01 vs. Steuerung HCD_ND; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 vs. Kontroll-FMT1. HCD_ND bezieht sich auf die Gruppe der Hypercholesterinämie-Modellmäuse; v/i/uH6 bezieht sich auf lebensfähige (vH6), hitzeinaktivierte (iH6) und ultraschalllysierte (uH6) Bakterienzellen; FMT1/2/3 bezieht sich auf die Verwendung von Fäkalien aus den Gruppen HCD_ND, Sim und vH6.

Insgesamt 1061 OTUs, darunter 18 Phyla, 33 Klassen, 78 Ordnungen, 112 Familien, 196 Gattungen und 305 Arten, wurden mithilfe der 16S-rRNA-Sequenzierungstechnologie in der Darmmikrobiota von Mäusen identifiziert. Die α-Diversität der Darmmikrobiota verschiedener behandelter Mäuse wurde anhand der OTU-Werte bewertet. Die Ace-, Shannon- und Shannoneven-Indizes der Darmmikrobiota von Mäusen, denen v/i/uH6 und FMT3 verabreicht wurden, waren signifikant höher als die der HCD_ND- und FMT1-Gruppen (Abb. 4a und ergänzende Abb. 2b). Die β-Diversity-Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) zeigte, dass die Darmmikrobiota von Mäusen, denen die Gruppen v/i/uH6 und FMT3 verabreicht wurden, denen der ND-Gruppe ähnelte, sich jedoch signifikant von denen der HCD-, HCD_ND- und FMT1-Gruppen unterschied (Abb. 4b). Im Vergleich zu HCD_ND erhöhte v/i/uH6 die Häufigkeit der Darmmikrobiota bei Mäusen und die Anzahl der OTUs stieg um 31,16 %, 39,86 % bzw. 17,63 % (Abb. 4c). Auf OTU-Werten basierende Wärmekarten zeigten, dass die Struktur der Darmmikroflora der HCD-, HCD_ND-Gruppen und anderer Behandlungsgruppen klar in drei Teile unterteilt war und die Gemeinschaftshäufigkeit von v/i/uH6 der der ND- und Sim-Gruppen ähnlicher war (Abb. 4d). Eine weitere Analyse der Darmmikrobiota-Zusammensetzung auf Phylum-Ebene (Abb. 4e) zeigte, dass in der HCD-Gruppe die Firmicutes zunahmen und die Bacteroidota im Darm abnahmen, was zu einem Anstieg des F/B-Verhältnisses führte. Während v/i/uH6 die relative Häufigkeit von Firmicutes um 5,94 %, 44,96 % bzw. 44,64 % reduzierte, erhöhte es die relative Häufigkeit von Bacteroidota um 234,85 %, 377,05 % bzw. 362,53 % und verringerte das F/B-Verhältnis signifikant im Vergleich zur HCD_ND-Gruppe.

a Alpha-Vielfalt, bewertet durch Reichtum (ACE) und Vielfalt (Shannon). b Beta-Diversität berechnet mit gewichtetem UniFrac von PCoA. c Venn-Diagramm von OTUs bei Mäusen, denen v/i/uH6 verabreicht wurde. d Heatmap der relativen Häufigkeit der 100 wichtigsten OTUs bei Mäusen, denen v/i/uH6 verabreicht wurde. e Relative Häufigkeit von Mikrobiota auf Stammebene und Firmicutes/Bacteroidetes-Verhältnis. f LDA-Score (LDA > 2,5) bei Mäusen, denen v/i/uH6 verabreicht wurde. g Vergleich zweier Gruppen mithilfe eines Student-t-Tests. h-Venn-Diagramm der OTUs, Heatmap der relativen Häufigkeit der 100 besten OTUs, LDA-Score und Vergleich zweier Gruppen mithilfe eines Student-t-Tests in fäkalen Mikrobiota-Transplantationsgruppen. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (n = 3) dargestellt. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. HCD_ND bezieht sich auf die Gruppe der Hypercholesterinämie-Modellmäuse; v/i/uH6 bezieht sich auf lebensfähige (vH6), hitzeinaktivierte (iH6) und ultraschalllysierte (uH6) Bakterienzellen; FMT1/2/3 bezieht sich auf die Verwendung von Fäkalien aus den Gruppen HCD_ND, Sim und vH6.

Die LEfSe-Analyse zeigte signifikante Unterschiede in der Struktur der Darmmikrobiota zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen (ergänzende Abbildung 2f), und die lineare Diskriminanzanalyse (LDA) wurde verwendet, um die vorherrschenden Bakterien in den verschiedenen Gruppen zu bewerten. Die dominanten Bakterien von Mäusen, denen vH6 verabreicht wurde, waren Lactobacillus, Coriobacteriaceae_UCG-002 und norank_f__Oscillospiraceae, Muribaculum, unclassified_o__Bacteroidales und Ruminococcus, wenn ihnen iH6 verabreicht wurde, und norank_f__Muribaculaceae, wenn ihnen uH6 verabreicht wurde (Abb. 4f). Der Student-t-Test zeigte, dass in der HCD_ND-Gruppe die Häufigkeit von Faecalibaculum, Allobaculum und Turicibacter im Vergleich zu der mit v/i/uH6 behandelten Gruppe signifikant zunahm, in der die Häufigkeit von norank_f__Muribaculaceae im Vergleich zu der der HCD_ND-Gruppe signifikant zunahm (Abb. 4g). Darüber hinaus erhöhte i/uH6 im Vergleich zur HCD_ND-Gruppe unclassified_o__Oscillospirales und Lachnoclostridium und vH6 erhöhte Muribaculum deutlich, sodass diese dominanten Bakterien potenzielle Biomarker für eine wirksame Cholesterinsenkung durch Lp sein könnten

Eine fäkale Mikrobiota-Transplantation (FMT) unter Verwendung von Fäkalien von Mäusen, die mit vH6 behandelt wurden, verbesserte auch die durch HCD induzierte mikrobielle Zusammensetzung des Darms (Abb. 4h). Im Vergleich zur FMT1-Behandlung stieg die Anzahl der Darmmikroben-OTUs von mit FMT3 behandelten Mäusen um 15 %, und die Wärmekarte der Gemeinschaftsverteilung ähnelte eher der der normalen und mit FMT2 behandelten Mäuse. In ähnlicher Weise verringerte sich die Menge an Firmicutes um 15,45 % und die an Bacteroidota stieg um 79,3 % bei mit FMT3 behandelten Mäusen. Die dominanten Bakterien der mit FMT3 behandelten Mäuse waren norank_f__Muribaculaceae, unclassified_f__Ruminococcaceae, unclassified_c__Bacilli und Intestinimonas, von denen norank_f__Muribaculaceae auch die am häufigsten vorkommenden dominanten Bakterien der mit uH6 behandelten Mäuse waren. Im Vergleich zur FMT1-Behandlung erhöhte FMT3 die Häufigkeit von Enterorhabdus, Muribaculum, unclassified_c__Bacilli, Coriobacteriaceae_UCG-002 und norank_f__Paracaedibacteraceae. Darüber hinaus senkte FMT3 die Faecalibaculum-Spiegel, was mit der mit v/i/uH6 behandelten Gruppe übereinstimmte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass v/i/uH6 und FMT3 die Dysbiose der Darmmikrobiota von Mäusen mit Hypercholesterinämie lindern können, indem sie Darmmikroben regulieren.

Der nicht gezielte Nachweis von fäkalen Metaboliten von Mäusen wurde auf der Grundlage von UPLC/Q-TOF-MS/MS durchgeführt. MS- und MS/MS-Informationen wurden mit den öffentlichen Stoffwechseldatenbanken HMDB (http://www.hmdb.ca/) und Metlin (https://metlin.scripps.edu/) abgeglichen. Insgesamt wurden 1114 fäkale Metaboliten identifiziert. Die PLS-DA-Analyse zeigte, dass die Gruppen HCD, HCD_ND und FMT3 offensichtlich von den anderen Behandlungsgruppen getrennt waren (Abb. 5a), und das Substitutionstestmodell zeigte, dass das PLS-DA-Modell zuverlässig war (ergänzende Abb. 3a). Laut Wärmekarte ähnelten die fäkalen Metaboliten von Mäusen, denen v/i/uH6 und FMT3 verabreicht wurden, eher der ND-Gruppe, waren jedoch offensichtlich von den HCD-, HCD_ND- und FMT1-Gruppen getrennt (ergänzende Abbildung 3b). Alle Metaboliten wurden als Vitamin-Cofaktoren, Aminosäuren, Gallensäuren und Lipide klassifiziert. Im Vergleich zur HCD_ND-Gruppe erhöhte v/i/uH6 den relativen Gehalt von sechs Vitamin-Cofaktoren, darunter Pantothenat und Niacinamid signifikant erhöht (Abb. 5b). FMT3 veränderte den Gehalt an Vitamin-Cofaktoren jedoch nicht wesentlich (ergänzende Abbildung 3c). Im Vergleich zur HCD_ND-Gruppe erhöhte v/i/uH6 den Gehalt an Aminosäuren (Abb. 5c), wie z. B. L-Tryptophan, L-Prolin, L-Phenylalanin und L-Glutamat, sowie den Gehalt an verzweigtkettigen Aminogruppen signifikant Säuren (BCAA), wie z. B. L-Isoleucin. In Bezug auf Gallensäuren reduzierte v/i/uH6 im Vergleich zur HCD_ND-Gruppe den Gehalt an primären Gallensäuren um 18,10 %, 13,31 % bzw. 21,00 % und reduzierte den Gehalt an sekundären Gallensäuren wie Desoxycholsäure. 3-Dehydrocholsäure, 12-Ketolithocholsäure, Glycolithocholsäure. FMT3 hatte den gleichen Trend bei der Gallensäureregulation (Abb. 5d). Die unterschiedlichen Metaboliten zwischen verschiedenen Behandlungsgruppen wurden anhand einer Cluster-Heatmap und eines VIP-Balkendiagramms überprüft (Abb. 5e). Mit v/i/uH6 und FMT3 behandelte Mäuse wurden für 7, 7, 16 bzw. 4 bemerkenswerte Lipidmetaboliten identifiziert. Im Vergleich zur HCD_ND-Gruppe regulierte vH6 vier Lipidmetallolithe signifikant hoch, nämlich 9,12,13-TriHOME, 9-HOTrE, Stearidonsäure und Dodecandisäure. iH6 regulierte Stearidonsäure, Dodecandisäure und Alprostadil deutlich hoch. uH6 hat Ouabain eins deutlich hochreguliert. FMT3 reduzierte im Vergleich zu FMT1 alle differenziellen Metaboliten. Insgesamt gibt es Ähnlichkeiten bei den unterschiedlichen Metaboliten von v/i/uH6 und FMT3, wie Elaidinsäure, Transvaccensäure, Stearidonsäure usw.

eine partielle Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate (PLS-DA) basierend auf den mikrobiellen Metaboliten. b–d Der relative Gehalt an Vitamin-Cofaktoren, Aminosäuren und Gallensäuren, nachgewiesen durch UPLC/Q-TOF-MS/MS-basierten, nicht zielgerichteten Metabolomics-Ansatz. e Die Cluster-Heatmap und die VIP-Balkenkarte der Differenzlipide wurden zwischen den beiden Gruppen verglichen. f Der Gehalt an Capronsäure. g KEGG-Signalweg-Anreicherungsanalyse unterschiedlicher Metaboliten in HCD_ND vs. vH6. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (n = 3) dargestellt. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. HCD_ND bezieht sich auf die Gruppe der Hypercholesterinämie-Modellmäuse; v/i/uH6 bezieht sich auf lebensfähige (vH6), hitzeinaktivierte (iH6) und ultraschalllysierte (uH6) Bakterienzellen; FMT1/2/3 bezieht sich auf die Verwendung von Fäkalien aus den Gruppen HCD_ND, Sim und vH6.

Für den gezielten Nachweis von SCFAs wurde ein Thermo TRACE1310-ISQ LT Gaschromatograph, ausgestattet mit einer Agilent HP-INNOWAX Kapillarsäule, verwendet. Im Vergleich zur HCD_ND-Gruppe (Abb. 5f) erhöhte vH6 den Gehalt an Capronsäure (P < 0,05), Essigsäure, Propionsäure, Isobuttersäure, Buttersäure, Valeriansäure und den gesamten SCFAs; uH6 erhöhte den Gehalt an Essigsäure, Propionsäure und Valeriansäure. Im Vergleich zur FMT1-Gruppe erhöhte FMT3 den Gehalt an Essigsäure und Propionsäure, obwohl keiner dieser Unterschiede statistisch signifikant war (ergänzende Abbildung 3e).

Die biologischen Prozesse fäkaler Metaboliten wurden mithilfe der KEGG-Signalweganalyse vorhergesagt. Die Analyse unterschiedlicher Metaboliten zwischen vH6- und HCD_ND-Gruppen ergab, dass vH6 die Hypercholesterinämie bei Mäusen über viele Wege regulierte, darunter Vitaminverdauung und -absorption, Lipolyseregulierung, cAMP-Signalweg, Linolsäurestoffwechsel, Phenylalanin-, Tyrosin- und Tryptophan-Biosynthese, mTOR-Signalweg, PI3K- Akt-Signalweg und sekundäre Gallensäurebiosynthese. Ähnlich wie vH6 sind iH6 und uH6 an der Regulierung von Stoffwechselwegen wie dem cAMP-Signalweg, der Gallensekretion, der Lipolyseregulation oder dem mTOR-Signalweg beteiligt (Abb. 5g und ergänzende Abb. 3f). Im Vergleich zu FMT1 kann FMT3 den Stoffwechsel über die Gallensekretion und die sekundäre Gallensäurebiosynthese regulieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass v/i/uH6 alle die Darmmetaboliten bei Mäusen mit Hypercholesterinämie in unterschiedlichem Maße verbesserte. Insbesondere steigerten die v/i/uH6-Zellen den Metabolismus von Vitamin-Cofaktoren sowie Aminosäuren in der Darmflora und verringerten gleichzeitig den relativen Gehalt an primären Gallensäuren.

Eine weitere Analyse der Pearson-Korrelationen zwischen Darmmikrobiota (Top-10-Gattungen auf Gattungsebene) und physikochemischen Indikatoren für Hypercholesterinämie zeigte, dass norank_f__Muribaculaceae und Lactobacillus signifikante negative Korrelationen mit TC, TG, LDL, ALT, AST und Lebergewicht aufwiesen. Turicibacter, Romboutsia und Faecalibaculum wiesen alle signifikante positive Korrelationen mit diesen Indizes auf (Abb. 6a). Allobaculum hatte auch einen signifikanten positiven Zusammenhang mit LDL, Leber-TC und Lebergewicht. Die Korrelation zwischen fäkalen Metaboliten und der Struktur der mikrobiellen Gemeinschaft wurde durch Redundanzanalyse (RDA) bewertet, wie in Abb. 6b – d und der ergänzenden Abb. dargestellt. 4a, b. In der mit v/i/uH6 behandelten Gruppe zeigten Faecalibaculum, Allobaculum und Turicibacter eine signifikante negative Beziehung zu anderen Bakterien, was frühere Ergebnisse bestätigte. D-Biotin und Folsäure hatten eine starke positive Korrelation mit Lactobacillus, Coriobacteriaceae_UCG-002 und Muribaculum, während Vitamin-Cofaktoren eine positive Korrelation mit den dominanten Bakterien von mit v/i/uH6 behandelten Mäusen aufwiesen (Abb. 6b). L-Serin korrelierte stark mit Lactobacillus und Coriobacteriaceae_UCG-002, während die übrigen Aminosäuren mit v/i/uH6-dominanten Bakterien korrelierten (Abb. 6c). Bei Gallensäuren hatte Glycolithocholsäure keine Korrelation mit nicht klassifizierten Bacteroidales und Turicibacter. Romboutsia und Faecalibaculum zeigten signifikante positive Korrelationen mit den meisten Gallensäuren (Abb. 6d). Diese Ergebnisse deuten auf eine starke Korrelation zwischen der Produktion und Häufigkeit von fäkalen Metaboliten und Darmmikroben bei hypercholesterinämischen Mäusen hin, denen v/i/uH6 verabreicht wurde. In ähnlicher Weise wurde in der FMT3-Gruppe eine Korrelation zwischen mikrobiellen Gemeinschaften und physikalisch-chemischen Indikatoren und Metaboliten entdeckt, es gab jedoch keine statistische Signifikanz (ergänzende Abbildung 4c – g). Kurz gesagt, die Pearson-Korrelationsanalyse zeigte, dass norank_f__Muribaculaceae und Lactobacillus eine negative Korrelation mit den Blutfettwerten hatten. RDA zeigte eine starke positive Korrelation zwischen der Produktion und Häufigkeit von fäkalen Metaboliten und Darmmikroben bei hypercholesterinämischen Mäusen, denen v/i/uH6 verabreicht wurde.

eine Korrelationsanalyse zwischen den zehn reichsten Bakterien und den physikalisch-chemischen Indizes der Hypercholesterinämie nach der Spearman-Methode. b–d Redundanzanalyse (RDA) der Korrelation zwischen der v/i/uH6-Mikrobengemeinschaft und fäkalen Metaboliten (Vitamin-Cofaktoren, Aminosäuren, Gallensäuren). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (n = 3) dargestellt. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. HCD_ND bezieht sich auf die Gruppe der Hypercholesterinämie-Modellmäuse; v/i/uH6 bezieht sich auf lebensfähige (vH6), hitzeinaktivierte (iH6) und ultraschalllysierte (uH6) Bakterienzellen.

Lactobacillus plantarum H6 (CGMCC 18205) ist ein probiotischer Stamm mit cholesterinsenkender Wirkung, der in unserem Labor aus dem fermentierten Teig isoliert wurde und ein nationales Erfindungspatent erhalten hat (Nr. ZL 201910955071. X). Zuvor haben wir In-vivo-Experimente durchgeführt, um die präventive Wirkung von Lp H6 auf Hypercholesterinämie zu bewerten. In der aktuellen Studie wurden die therapeutischen Wirkungen bei Hypercholesterinämie weiter untersucht. Auch die toten und lysierten H6-Zellen wurden gemeinsam ausgewertet, um ein umfassenderes Verständnis der regulatorischen Wirkung von H6 auf den Lipidstoffwechsel zu gewinnen.

Die hypercholesterinämischen Mäuse, denen sowohl lebensfähiges als auch inaktiviertes H6 verabreicht wurde, erhöhten ihre Nahrungsaufnahme, zeigten jedoch keine signifikante Veränderung der Gewichtszunahme. Dieser Befund steht im Einklang mit einer früheren Studie, in der festgestellt wurde, dass Lactobacillus fermentum ZJUIDS06 und Lactobacillus plantarum ZY08 keinen Einfluss auf den Gewichtsverlust bei hypercholesterinämischen Ratten hatten15. Allerdings verringerte v/i/uH6 das Lebergewicht signifikant, ebenso wie der Stuhl aus dem Darm von mit vH6 behandelten Mäusen (FMT3), was darauf hindeutet, dass v/i/uH6 die mikrobielle Funktion im Darm verbessern und somit den Lipidstoffwechsel und den Energieverbrauch steigern könnte.

In der klinischen Praxis sind die Werte von TC, TG, LDL-C, ALT und AST im Körper für die Gesundheitsüberwachung von entscheidender Bedeutung16,17. In dieser Studie hatte der Stamm H6, einschließlich lebender und toter Zellen, gute lipidsenkende Wirkungen, was durch biochemische Indikatoren im Serum und in der Leber sowie durch einen histopathologischen Test bestätigt wurde. Im Allgemeinen ist die Lebensfähigkeit der Zellen eine wichtige Voraussetzung dafür, dass Probiotika ihre gesundheitsfördernden Funktionen erfüllen können16. Allerdings könnten Postbiotika, bei denen es sich um nicht lebensfähige Bakterienzellen, Bakterienfraktionen oder Zelllysate handelt, dem Wirt auch physiologische Vorteile bieten, indem sie zusätzliche Bioaktivität bieten6. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die hitzegetöteten und ultraschalllysierten H6-Zellen bis zu einem gewissen Grad noch eine gewisse physiologische Aktivität aufrechterhalten, was möglicherweise auf die Fähigkeit der Zellwandkomponenten zurückzuführen ist, Cholesterin zu adsorbieren. Es wurde gezeigt, dass Cholesterin an Peptidoglycan der Zellwand bindet, das Aminosäuren mit Bindungskapazität enthält, die genauen Mechanismen sind jedoch noch unbekannt6. Darüber hinaus verbessert Exopolysaccharid nachweislich auch den Fettstoffwechsel. Es verändert die Cholesterinhomöostase durch die Synthese und Kombination von Cholesterin und Gallensäuren, und der spezifische Mechanismus muss noch erforscht werden18.

Es wurde gezeigt, dass das hepatische Entkopplungsprotein 1 (UCP1) extrazelluläres Succinat und Entzündungen in der Leber reguliert, indem es den Energieverbrauch erhöht und die Leberlipide reduziert19. In dieser Studie erhöhte sich UCP1 in der Leber von Mäusen, denen v/i/uH6 und FMT3 verabreicht wurden, was darauf hindeutet, dass der Stamm H6 die Leberdegeneration bei Mäusen mit Hypercholesterinämie hemmt, indem er die Thermogenese und den Lipidstoffwechsel verbessert. Im Hinblick auf den Glucolipid-Metabolismus verbesserten sowohl lebensfähiges als auch totes H6 die Insulintoleranz, während lysiertes H6 die Glukosetoleranz bei Mäusen verbesserte. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit früheren Erkenntnissen, wonach sterilisierte Bifidobakterien die Glukosetoleranz und Insulinresistenz verbessern und somit den Blutzuckerspiegel bei Mäusen mit Störungen des Kohlenhydrat- und Lipidstoffwechsels senken könnten20. Bemerkenswert ist, dass FMT3 unter Verwendung von Stuhl von Mäusen, denen lebensfähiges H6 verabreicht wurde, die gleichen physiologischen Vorteile wie die lebensfähigen Stämme hat, wie z. B. eine Senkung der Lipide und eine Verbesserung des Glukolipidstoffwechsels, was darauf hindeutet, dass lebensfähiges H6 die Produktion nützlicher Metaboliten durch Darmmikroorganismen bei Mäusen induzierte21.

Es wurde erkannt, dass probiotische Nahrungsergänzungsmittel zu offensichtlichen Veränderungen in der mikrobiellen Zusammensetzung des Darms führen und somit den Fettstoffwechsel in der Nahrung regulieren22. Daher wurden Darmmikroorganismen, die für die Gesundheit des Wirts relevant sind, isoliert und identifiziert. Die Rolle von Darmmikroorganismen für Gesundheit oder Krankheit wird mittlerweile erkannt23.

In dieser Studie reichten sowohl v/i/uH6 als auch FMT3 aus, um die mikrobielle Zusammensetzung im Darm zu verbessern, die durch eine cholesterinreiche Ernährung hervorgerufen wurde. Lactobacillus und Coriobacteriaceae_UCG-002 wurden in Mäusen, denen vH6 verabreicht wurde, angereichert, was mit den vorherigen Ergebnissen in unserem Labor übereinstimmt14. Es wurde festgestellt, dass Lactobacillus ein häufig vorkommendes nützliches Bakterium ist, das aufgrund seiner hohen Gallensalz-Hydrolase-Aktivität die Fähigkeit besitzt, den Cholesterinstoffwechsel zu regulieren24,25. Bei Mäusen, denen v/i/uH6 verabreicht wurde, wurden vier dominante Gattungen gefunden, darunter norank_f__Oscillospiraceae, Muribaculu, unclassified_o__Bacteroidales und Ruminococcus, wobei Ruminococcus angereichert im Darmtrakt von Kindern mit normalem Gewicht gefunden wurde, während bei adipösen Personen weniger Oscillospiraceae nachgewiesen wurden , was darauf hindeutet, dass diese beiden Gattungen negativ mit der Cholesterinsenkung korrelieren26. Sowohl uH6 als auch FMT3 erhöhten den Norank_f__Muribaculaceae, ein gut definiertes entzündungshemmendes Bakterium.

Muribaculaceae wurden nach der Analyse und Beschreibung der Probleme und Merkmale der Bakterienfamilie S24-7 in Bezug auf Diversität, Ökologie, Funktionspotenzial und Keimbahnvorkommen benannt27. Es unterscheidet sich funktionell von seiner Nachbarfamilie und ist multifunktional im Hinblick auf komplexe Kohlenhydrate und einen hohen Kalorienabbau28. Studien haben gezeigt, dass die Gemeinschaft der Muribaculaceae in der Darmflora fettreicher Mäuse deutlich reduziert ist29. Muribaculacea ist in unserer Studie das am häufigsten vorkommende Bakterium im Darm auf Gattungsebene. Im Vergleich zu Mäusen, die mit einer cholesterinreichen Diät gefüttert wurden, war Muribaculacea bei Mäusen, die i/uH6 oder FMT3 erhielten, deutlich häufiger anzutreffen, was darauf hindeutet, dass es möglicherweise eine wichtige Rolle im Lipidstoffwechsel spielt. Darüber hinaus erhöhte FMT3 auch unklassifizierte_f__Ruminococcaceae, unklassifizierte_c__Bacilli und Intestinimonas. In einer Kohortenstudie mit Proben von Gesundheits- und Stoffwechselerkrankungen wurde berichtet, dass Intestinimonas das Körpergewicht kontrolliert und Typ-II-Diabetes vorbeugt30. Allobaculum und Turicibacter waren Gattungen, die Entzündungen und Fettleibigkeit auslösen konnten26,31. Es wurde festgestellt, dass Allobaculum und Faecalitalea häufiger bei Mäusen vorkommen, die mit Schweineproteinen und Schweineschmalz behandelt wurden, was darauf hindeutet, dass diese Gattungen positiv mit Entzündungen korrelieren32. Ähnlich zu diesen Ergebnissen stellten wir fest, dass die Häufigkeit von Faecalibaculum, Allobaculum und Turicibacter bei Mäusen zunahm, die mit cholesterinreichen Diäten gefüttert wurden, während sie bei Mäusen, denen v/i/uH6 verabreicht wurde, abnahm. Obwohl Bifidobacterium allgemein als nützliches Bakterium anerkannt ist33,34, wurde in dieser Studie festgestellt, dass es bei Mäusen, denen v/i/uH6 oder FMT3 verabreicht wurde, weniger häufig vorkommt, und die Gründe dafür müssen weiter untersucht werden.

Es ist bekannt, dass viele Nährstoffe eine Rolle bei der Regulierung des Fettstoffwechsels spielen35,36. Eine vitaminreiche Ernährung kann das Risiko einer koronaren Herzkrankheit und Arteriosklerose verringern, da Vitamine des B-Komplexes nachweislich die TC- und TG-Spiegel im Körper senken. Niacin, ein Vitamin des B-Komplexes, wird zur Behandlung von atherosklerotischen Erkrankungen in Kombination mit einigen lipidsenkenden Medikamenten eingesetzt37. α-Methyl-L-Tryptophan könnte Hyperglykämie, Insulinresistenz und Lebersteatose verbessern38, während L-Glutaminsäure das Fortschreiten von Arteriosklerose und Fettlebererkrankungen hemmen könnte39. In dieser Studie erhöhte die Behandlung mit v/i/uH6 die Spiegel an Vitamin-Cofaktoren und Aminosäuren, die mit dem Lipidstoffwechsel der Darmmikrobiota zusammenhängen, was teilweise den Mechanismus der cholesterinsenkenden Wirkung des Stamms Lp H6 erklärt. Gallensäuren (BAs) sind wichtige Signalmoleküle, die eng mit dem Cholesterinstoffwechsel verbunden sind. Viele Studien haben gezeigt, dass die Biotransformation primärer BAs durch Darmmikroorganismen die Fettansammlung in der Leber reduzieren und die Blutfettwerte senken kann40. Unsere vorherige Studie zeigte, dass H6 seine cholesterinsenkende Wirkung durch Gallensalzhydrolase sowie Membranadsorption, Copräzipitation und Hemmung von Cholesterinmizellen wirksam entfalten kann. Darüber hinaus könnte lebensfähiges H6 durch die Förderung der Expression des CYP7A1-Gens und die Hemmung des Farnesoid-X-Rezeptorwegs die Synthese von BAs und die Häufigkeit von Bakterien mit Gallensalzhydrolase (BSH)-Aktivität steigern14. In dieser Studie haben wir auch herausgefunden, dass a/i/sH6 und FMT3 die relativen Mengen primärer BAs reduzieren, was darauf hindeutet, dass H6 die Absorption von BAs im Dünndarm verhindern könnte. SCFAs sind ein weiterer wichtiger Metabolit der Darmmikrobiota, der nachweislich eine wichtige Rolle bei der Prävention und Behandlung vieler Krankheiten spielt41. Allerdings veränderten sich die SCFA-Mengen nach der Einnahme von v/i/uH6 in dieser Studie nicht, was im Einklang mit einer kürzlich durchgeführten randomisierten Doppelblindstudie steht, die zeigt, dass Freiwillige, die eine Art probiotisches L. plantarum Dad-13 konsumierten, das Lipidprofil effektiv verbesserten ohne signifikante Veränderung der SCFA-Konzentration im Darm42. Der Grund ist nicht klar.

Es wurde gezeigt, dass Muribaculaceae eine negative Korrelation mit dem Körpergewicht und den biochemischen Parametern der Maus haben43. Anhand der oben aufgezeichneten Beobachtungen untersuchten wir die Korrelation zwischen Darmmikrobiota und physikalisch-chemischen Parametern mittels Pearson-Korrelationsanalyse und RDA und stellten fest, dass sie stark korrelierten. Diese Korrelation muss jedoch auf Dehnungsebene validiert werden.

Diese Studie untersuchte die therapeutische Wirkung eines neuen patentierten Stammes Lactobacillus plantarum H6 in verschiedenen Zuständen (aktiv, hitzeinaktiviert und ultraschalllysiert) auf hypercholesterinämische Mäuse. Wie in Abb. 7 gezeigt, verbesserten die v/i/uH6-Zellen und der Stuhl von mit vH6 behandelten Mäusen (FMT3) die Hypercholesterinämie bei Mäusen, und dieser Effekt wurde teilweise auf die Regulierung der Darmmikrobiota und der Metaboliten im Zusammenhang mit dem Lipidstoffwechsel zurückgeführt. Muribaculaceae könnten als potenzieller Biomarker für eine wirksame Cholesterinsenkung eingesetzt werden. Hitzeinaktiviertes und ultraschalllysiertes Lp H6 könnte ein vielversprechendes Postbiotikum zur Regulierung des Cholesterinstoffwechsels sein. Obwohl Lp H6 in den drei Zuständen Hypercholesterinämie-Mäuse in unterschiedlichem Maße verbessern kann, ist sein Mechanismus noch unbekannt, und die Effektormoleküle und Signalwege von Lp H6 bei der Senkung des Cholesterinspiegels sind in zukünftigen Studien noch einer Untersuchung wert.

v/i/uH6-Zellen könnten TC, TG, LDL-C, ALT, AST im Serum und TC, TG in der Leber auf verschiedenen Ebenen senken und die GTT- und ITT-Indizes verbessern. Außerdem wurde eine Wiederherstellung dieser biochemischen Indizes und des Darmmikrobioms nach FMT unter Verwendung von Stuhl von mit vH6 behandelten Mäusen festgestellt. Es wurde festgestellt, dass Muribaculaceae nach v/i/uH6-Behandlungen im Darm von Mäusen am häufigsten vorkommen, was darauf hindeutet, dass es als potenzieller Biomarker für die wirksame Senkung des Cholesterinspiegels verwendet werden könnte. Die v/i/uH6-Zellen erhöhten den Metabolismus von Vitamin-Cofaktoren sowie Aminosäuren in der Darmflora und verringerten gleichzeitig den relativen Gehalt an primären Gallensäuren. Die Pearson-Korrelationsanalyse zeigte, dass norank_f__Muribaculaceae und Lactobacillus eine negative Korrelation mit den Blutfettwerten hatten. RDA zeigte eine starke positive Korrelation zwischen der Produktion und Häufigkeit von fäkalen Metaboliten und Darmmikroben bei hypercholesterinämischen Mäusen, denen v/i/uH6 verabreicht wurde. Insgesamt waren v/i/uH6-Zellen wirksam bei der Verbesserung der Hypercholesterinämie bei Mäusen, und dieser Effekt wurde teilweise auf die Regulierung der Darmmikrobiota und der Metaboliten im Zusammenhang mit dem Lipidstoffwechsel zurückgeführt. v/i/uH6 bezieht sich auf lebensfähige (vH6), hitzeinaktivierte (iH6) und ultraschalllysierte (uH6) Bakterienzellen. (Abbildung wurde mit Biorender.com erstellt.)

Simvastatin wurde von Shandong Lu'an Anti-Pharmaceutical Group Saite Co., Ltd, Shandong, China, gekauft. Die Insulininjektion wurde von Jiangsu Wanbang Biochemical Pharmaceutical Group Co., Ltd. gekauft. Blutzuckermessgerät und Blutzuckertestpapier (Typ GA-3) wurden von Sanno Biosensing Co., Ltd, Jiangsu, China, gekauft. TC-, TG-, LDL-C-, HDL-C-, ALT- und AST-Nachweiskits wurden vom Jiancheng Bioengineering Research Institute (Nanjing, China) erworben.

Lactobacillus plantarum H6 (CGMCC 18205) wurde aus dem klebrigen Teig, einem traditionellen chinesischen fermentierten Mehlprodukt, ausgewählt. Vor dem Experiment wurden die Bakterienzellen zweimal aktiviert. Die aktivierten Zellen wurden mit MRS-Medium beimpft und 24 Stunden lang unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C kultiviert. Nach der Kultivierung wurde die Bakteriensuspension zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und die Konzentration der Suspension auf 1 × 109 KBE/ml (vH6) eingestellt. Inaktivierte Zellen (iH6) wurden aus Bakteriensuspension in einem Wasserbad bei 90 °C für 30 Minuten mit geringfügigen Änderungen gegenüber dem vorherigen Ansatz hergestellt44. Die Bakteriensuspension wurde mit einem Ultraschall-Zellpulverisierer für 5 Sekunden und 60 Minuten in Abständen von 9 Sekunden behandelt, um bakterielles Ultraschalllysat (uH6) mit geringfügigen Änderungen gegenüber dem vorherigen Ansatz herzustellen45 und die Plattenkultur zeigte, dass keine lebensfähigen Bakterien wuchsen.

Achtundachtzig männliche C57BL/6-Mäuse (5 Wochen alt und 18–19 g schwer) wurden von Shenyang Changsheng Biotechnology Co., Ltd. gekauft (Zulassungsnummer: SCXK (Liao) 2021-0001, Liaoning, China). Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren der Jilin Agricultural University durchgeführt und von der Tierethikkommission der Jilin Agricultural University genehmigt. Die Mäuse wurden bei Raumtemperatur (25 ± 1 °C) in 12-stündigen Licht-/12-stündigen Dunkelzyklen gehalten. Nach einer Woche Anpassung wurden die Mäuse in drei Gruppen eingeteilt, darunter die Gruppe mit normaler Ernährung (Beijing Co-operative Feeds Co., Ltd.) (ND), die Gruppe mit hohem Cholesterinspiegel (Highcholesterin Rat Food, Dietz Biotechnology Co., Ltd.). ) Gruppe (HCD) und die Behandlungsgruppe.

Nach 4-wöchiger Fütterung wurden Serum und Leber der ND- und HCD-Mäuse nach der Euthanasie entnommen, um die TC- und TG-Spiegel zu messen. Wenn die Lipidwerte der HCD-Gruppe zwei- bis dreimal höher waren als die der ND-Gruppe, wurde das Hypercholesterinämie-Modell als erfolgreich angesehen und in den folgenden Experimenten verwendet. Von der 5. bis zur 12. Woche erhielten alle Gruppen mit Ausnahme der HCD-Gruppe die normale Nahrung, währenddessen wurden täglich v/i/uH6-Zellen (1 × 109 KBE/ml) und Simvastatin (3,80 mg/kg KG) per Sonde verabreicht. Die Gruppen ND und HCD erhielten täglich eine Magensonde mit 0,9 % NaCl in gleicher Menge (die HCD-Gruppe wurde mit einer normalen Diät ernährt und erhielt den Namen HCD_ND-Gruppe).

Der experimentelle Aufbau des Tests zur fäkalen Mikrobiota-Transplantation (FMT) ist wie folgt: Unter aseptischen Bedingungen wurden jeden Tag 300 mg frischer Kot aus den Gruppen HCD_ND, Sim und vH6 gesammelt und in 3 ml sterilem 0,9 % NaCl resuspendiert. dann 3 min bei 800 g zentrifugiert46. Anschließend wurde der Überstand gesammelt und die Hypercholesterinämie-Modellmäuse (HCD_ND-Gruppe) als Empfänger des FMT-Tests verwendet. FMT unter Verwendung von Kot aus den Gruppen HCD_ND, Sim und vH6 wird als FMT1, FMT2 bzw. FMT3 bezeichnet, wie in Abb. 8 dargestellt. Am Tag vor der Tötung der Mäuse wurde der Kot der Mäuse unter aseptischen Bedingungen gesammelt und in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei −80 °C gehalten. Nach 12 Wochen Tierversuch wurden Mäuse mit Ether betäubt und durch Genicktrennung getötet. Es wurde Blut gesammelt und bei 4 °C und 15 °C mit 3000 g min zentrifugiert, um Serum zu erhalten, das zur späteren Verwendung bei –20 °C gelagert wurde. Die Leber wurde gesammelt und gewogen, ein Teil davon wurde mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und ein Teil davon wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80 °C gelagert.

In den ersten 4 Wochen wurden 88 männliche C57BL/6-Mäuse zufällig in eine Gruppe mit normaler Ernährung (ND) und eine Gruppe mit hoher Cholesterin-Ernährung (HCD) eingeteilt. Von der 5. bis zur 12. Woche erhielten alle Gruppen die normale Nahrung mit Ausnahme von HCD, währenddessen wurden täglich v/i/uH6-Zellen (1 × 109 KBE/ml) und Simvastatin (3,80 mg/kg KG) per Sonde verabreicht. Die Gruppen ND und HCD erhielten täglich eine Magensonde mit 0,9 % NaCl in gleicher Menge. Als Empfänger des FMT-Tests wurden die Hypercholesterinämie-Modellmäuse verwendet. Die FMT wurde mit Kot von Mäusen durchgeführt, die mit NaCl bzw. vH6 behandelt wurden. (Die Abbildung stammt vom Autor. Es wurden keine Materialien Dritter verwendet.)

In der 8. Woche der Behandlung mit v/i/uH6 und FMT3 ließ man die Mäuse über Nacht (für den Glukosetoleranztest) oder 4 Stunden lang (für den Insulintoleranztest) fasten und ihnen wurde intraperitoneal Glukose (2 g/kg KG) oder Insulin injiziert (0,75 U/kg KG). Schwanzblut wurde 0, 15, 30, 60 und 120 Minuten nach der Injektion gesammelt und der Blutzucker wurde mit einem Blutzuckermessgerät8 gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Der AUC-Wert jeder Gruppe wurde berechnet.

Der Gehalt an TC, TG, HDL-C, LDL-C, AST und ALT im Serum und an TC, TG in der Leber wurde mit den Reagenzienkits der Nanjing Jiancheng Biomedical Company bestimmt.

HE-Färbung: Entwachste Paraffinschnitte der Leber wurden 3–5 Minuten lang in Hämatoxylin-Färbelösung gefärbt und dann unter fließendem Wasser gewaschen. Danach wurden die Gewebeschnitte 5 Minuten lang in 85 % und 95 % Gradientenalkohol dehydriert, 5 Minuten lang in Eosin-Färbelösung gefärbt, mit Neutralgel versiegelt und 400-fache Bilder unter einem Mikroskop aufgenommen.

Ölrot-O-Färbung: Frisch gefrorene Gewebeschnitte wurden fixiert und dann mit Ölrot-O gefärbt. Die Schnitte wurden entnommen, 3 Sekunden lang belassen und dann nacheinander für jeweils 3 Sekunden und 5 Sekunden in zwei Tassen 60 %iges Isopropanol getaucht. Anschließend wurden die Schnitte 3–5 Minuten lang erneut mit Hämatoxylin gefärbt, mit Glycerin-Gelatine-Versiegelung versiegelt und 400-fache Bilder unter einem Mikroskop aufgenommen.

Immunhistochemische Analyse: Gewebeschnitte wurden zur Antigenreparatur entparaffiniert, in 3 %ige Wasserstoffperoxidlösung gegeben, um endogene Peroxidase zu blockieren, bei Raumtemperatur 30 Minuten lang durch Auftropfen von 3 % BSA versiegelt, über Nacht bei 4 °C mit primärem Antikörper inkubiert und mit sekundärem Antikörper inkubiert Antikörper für 50 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend wurde die neu zubereitete DAB-Farblösung tropfenweise zugetropft und die Chromogenitätszeit unter einem Mikroskop kontrolliert. Die Kerne wurden 3 Minuten lang erneut mit Hämatoxylin angefärbt und zur mikroskopischen Abbildung bei 400-facher Vergrößerung mit neutralem Gel versiegelt.

Genomische DNA der Mikrobengemeinschaft wurde aus Stuhlproben mit dem EZNA® Boden-DNA-Kit (Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA) extrahiert. Die hypervariable Region V3-V4 des bakteriellen 16S-rRNA-Gens wurde mit den Primerpaaren 338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′) und 806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde aus 2 % Agarosegel extrahiert, mit dem AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA) gereinigt und mit Quantus™ Fluorometer (Promega, USA) quantifiziert. Für die Sequenzierung wurde die Miseq PE300/NovaSeq PE250-Plattform von Illumina verwendet (Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd). Die Rohsequenzen wurden mit der Software fastp47 (https://github.com/OpenGene/fastp, Version 0.20.0) und der Software FLASH48 (http://www.cbcb.umd.edu/software/flash, Version 1.2) qualitätskontrolliert .7) zum Spleißen. Unter Verwendung der UPARSE-Software (http://drive5.com/uparse/, Version 7.1) wurden die Sequenzen OTU-geclustert und Chimären basierend auf einer Ähnlichkeit von 97 % entfernt. Die Daten wurden auf der Cloud-Computing-Plattform Megisense (http://cloud.majorbio.com/) analysiert.

Nicht zielgerichtete Metabolomics-Analyse basierend auf Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Flugzeit-Massenspektrometrie (UPLC/Q-TOF-MS/MS; Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd). 50 mg Stuhlproben wurden zur Extraktion in 400 μl Extraktionslösung (Acetonitril:Methanol = 1:1) gegeben und 10 μl Überstand wurden zur Analyse in die Maschine gegeben. Die mobilen Phasen bestanden aus 0,1 % Ameisensäure in Wasser (Lösungsmittel A) und 0,1 % Ameisensäure in Acetonitril: Isopropanol (1:1, v/v) (Lösungsmittel B). Der Lösungsmittelgradient änderte sich entsprechend den folgenden Bedingungen: von 0 bis 3 Min., 95 % (A): 5 % (B) bis 80 % (A): 20 % (B), von 3 bis 9 Min., 80 % (A). ): 20 % (B) bis 5 % (A): 95 % (B), von 9 bis 13 Min., 5 % (A): 95 % (B) bis 5 % (A): 95 % (B), von 13 bis 13,1 Min., 5 % (A): 95 % (B) bis 95 % (A): 5 % (B), von 13,1 bis 16 Min., 95 % (A): 5 % (B) bis 95 % (A): 5 % (B) zur Äquilibrierung der Systeme. Das Probeninjektionsvolumen betrug 2 μl und die Flussrate wurde auf 0,4 ml/min eingestellt. Die Säulentemperatur wurde bei 40 °C gehalten. Die massenspektrometrischen Daten wurden mit einem Thermo UHPLC-Q Exactive-Massenspektrometer erfasst, das mit einer Elektrospray-Ionisationsquelle (ESI) ausgestattet ist, die entweder im positiven oder negativen Ionenmodus arbeitet. Massenspektren dieser Stoffwechselmerkmale wurden mithilfe der genauen Masse, der MS/MS-Fragmentspektren und der Isotopenverhältnisdifferenz durch Suche in zuverlässigen biochemischen Datenbanken wie der Human Metabolome Database (HMDB) (http://www.hmdb.ca/) identifiziert. und Metlin-Datenbank (https://metlin.scripps.edu/). Vorverarbeitete Daten wurden auf der Cloud-Computing-Plattform Megisense (http://cloud.majorbio.com/) analysiert.

Ein Thermo TRACE1310-ISQ LT-Gaschromatograph, ausgestattet mit einer Agilent HP-INNOWAX-Kapillarsäule, wurde verwendet, um kurzkettige Fettsäuren, einschließlich Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Isobuttersäure, Valeriansäure, Isovaleriansäure und Caprinsäure, zu untersuchen ( Suzhou Panomic Biopharmaceutical Technology Co., Ltd.). Kurz gesagt: Mischen Sie 50 mg Stuhlprobe mit 50 μL 15 %iger Phosphorsäure, 100 μL 125 μg/ml interner Standardlösung (Isocaproinsäure) und 400 μL Ether und zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 4 °C und 12.000 × g. Chromatografische Bedingungen49: Split-Injektion, Injektionsvolumen 1 μL, Split-Verhältnis 10:1. Die Temperatur des Probeneinlasses, der Ionenquelle und der Übertragungsleitung betrug 250 °C, 300 °C bzw. 250 °C. Die programmierte Anstiegstemperatur begann bei 90 °C, stieg dann mit 10 °C/min auf 120 °C, dann mit 5 °C/min auf 150 °C und schließlich mit 25 °C auf 250 °C °C/min für 2 Min. Das Trägergas war Helium mit einer Durchflussrate von 1,0 ml/min und einer Elektronenenergie von 70 eV50. Der Gehalt an SCFAs wurde anhand der Kalibrierungskurven jedes Standards berechnet.

Die Daten wurden mit Graphpad Prism 8.0, Majorbio Cloud Platform und Genes Cloud statistisch analysiert und grafisch dargestellt. Die Signifikanz der Unterschiede zwischen den beiden Gruppen wurde mittels t-Test analysiert. Für Vergleiche zwischen drei oder mehr Bedingungen wurde eine einfache ANOVA gefolgt von mehreren Vergleichstests nach Dunnett oder Tukey verwendet. Eine Korrelationsanalyse wurde mittels Pearson-Analyse durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± (SD) dargestellt. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Alle Experimente wurden mindestens dreimal wiederholt.

Die in dieser Studie präsentierten Datensätze können in Online-Repositories gefunden werden. Die Namen des Repositorys/der Repositorys und die Zugangsnummer(n) finden Sie unten: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA882947 für 16S-rRNA-Sequenzierung und http://www.ebi.ac. uk/metabolights/MTBLS5977, MTBLS5977 und http://www.ebi.ac.uk/metabolights/MTBLS5978, MTBLS5978 für nicht gezielte Metabolomik und gezielte Metabolomik. Die anderen Daten der aktuellen Studie sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

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Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (32172189) und dem National College Students Innovation and Entrepreneurship Training Program (202010193104) unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Yue Li, Mengling Chen.

Hochschule für Lebensmittelwissenschaft und -technik, Jilin Agricultural University, 130118, Changchun, China

Yue Li, Mengling Chen, Yuxuan Ma, Yue Yang, Ying Cheng, Huijing Ma, Dayong Ren und Ping Chen

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RDY, CP und LY konzipierten und gestalteten die Experimente. LY verarbeitete, analysierte und interpretierte 16S-rRNA-Gensequenzdaten und Metabolomics-Daten. LY, CML, MYX, YY, CY und MHJ führten Experimente durch und analysierten Daten. RDY und LY haben den Artikel mit Beiträgen aller Autoren verfasst. Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse und genehmigten das endgültige Manuskript.

Korrespondenz mit Dayong Ren oder Ping Chen.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Li, Y., Chen, M., Ma, Y. et al. Regulierung des lebensfähigen/inaktivierten/lysierten probiotischen Lactobacillus plantarum H6 auf Darmmikrobiota und Metaboliten bei hypercholesterinämischen Mäusen. npj Sci Food 6, 50 (2022). https://doi.org/10.1038/s41538-022-00167-x

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Eingegangen: 04. Mai 2022

Angenommen: 11. Oktober 2022

Veröffentlicht: 31. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41538-022-00167-x

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