Das Mosquito-Densovirus reduziert die Vektoranfälligkeit für Dengue-Virus Serotyp 2 bei Aedes albopictus-Mücken (Diptera: Culicidae) erheblich.

Infectious Diseases of Poverty Band 12, Artikelnummer: 48 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Das Dengue-Virus (DENV) stellt eine große Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar. Aedes albopictus ist der nachweislich für Dengue-Epidemien in Guangzhou, China, verantwortliche Überträger. Moskito-Densoviren (MDVs) sind pathogene, mückenspezifische Viren, und ein neuartiges MDV wurde zuvor aus Ae isoliert. albopictus in Guangzhou. Ziel dieser Studie ist es, die Prävalenz von MDVs in wildlebenden Ae zu bestimmen. Albopictus-Populationen und untersuchen ihre möglichen Wechselwirkungen mit DENV und ihre Auswirkungen auf die Vektoranfälligkeit für DENV.

Die Prävalenz von MDV in Wildmücken in China wurde mithilfe von Open-Access-Sequenzierungsdaten und PCR-Nachweis in Ae untersucht. albopictus in Guangzhou. Die Virusinfektionsrate und -titer in MDV-persistenten C6/36-Zellen wurden 12, 24, 48, 72, 96 und 120 Stunden nach der Infektion (hpi) durch indirekten Immunfluoreszenztest (IFA) und quantitative Echtzeit-PCR (RT-) bewertet. qPCR). Die Mitteldarminfektionsrate (MIR), die Verbreitungsrate (DR) und die Speicheldrüseninfektionsrate (SGIR) in verschiedenen Geweben MDV-infizierter Mücken wurden 0, 5, 10 und 15 Tage nach der Infektion (dpi) erfasst und quantifiziert RT-PCR und RT-qPCR. Der Chi-Quadrat-Test bewertete die Infektionsraten des Dengue-Virus Serotyp 2 (DENV-2) und des Aedes aegypti Densovirus (AaeDV) sowie die damit verbundenen Indizes bei Mücken, während Tukeys LSD- und t-Tests die Virustiter in C6/36-Zellen und -Geweben im Zeitverlauf verglichen.

Die Ergebnisse zeigten eine relativ weite Verbreitung von MDVs bei Aedes-, Culex- und Anopheles-Mücken in China und eine positive Rate von über 68 %. In vitro wurde eine signifikante Verringerung der DENV-2-Titer im Überstand bei 120 hpi und eine offensichtliche Abnahme der DENV-2-positiven Zellen bei 96 und 120 hpi beobachtet. In vivo wurde DENV-2 in den Eierstöcken und Speicheldrüsen erstmals bei 10 dpi sowohl bei monoinfizierten als auch bei superinfizierten Ae nachgewiesen. Albopictus-Weibchen, während eine MDV-Superinfektion mit DENV-2 die Speicheldrüseninfektionsrate bei 15 dpi unterdrückte. DENV-2-Titer im Eierstock und in den Speicheldrüsen von Ae. Albopictus wurde bei superinfizierten Mücken bei 15 dpi reduziert.

MDVs sind in natürlichen Mückenpopulationen weit verbreitet und die Replikation von DENV-2 wird in MDV-infizierten Ae unterdrückt. Albopictus, wodurch die Anfälligkeit des Vektors für DENV-2 verringert wird. Unsere Studie unterstützt die Hypothese, dass MDVs zur Reduzierung der Übertragung von DENV beitragen können und bietet eine alternative Strategie zur Bekämpfung von durch Mücken übertragenen Krankheiten.

Moskito-Densoviren (MDVs) sind mückenspezifische, entomopathogene ikosasedrische, unbehüllte Viren mit einem Durchmesser von 20–25 nm und einem einzelsträngigen linearen DNA-Genom von 4 bis 6 Kilobasen, das in zwei Haarnadelstrukturen endet [1]. Einer aktuellen Revision der Taxonomie zufolge gehören MDVs zur Familie Parvoviridae, zur Unterfamilie Hamaparvovirinae und zur Gattung Brevihamaparvovirus [2, 3].

1972 wurde das erste MDV, Aedes aegypti densovirus (AaeDV), in einem Ae identifiziert. Aegypti-Laborstamm in Russland [4]. MDVs wurden kontinuierlich aus in Labors gehaltenen Mückenzelllinien, etablierten Mückenlaborkolonien und wilden Mückenpopulationen isoliert [5]. Die meisten MDVs weisen in ihrem Mückenwirt unterschiedliche Pathogenitätsgrade auf [6]. MDVs können in mehrere Organe und Gewebe von Mücken eindringen und sich dort vermehren, und eine Infektion mit MDVs kann zum Tod oder zur Verformung der Larven führen. MDVs verlängern das Larvenstadium und verringern die Lebensdauer und Körpergröße erwachsener Tiere [1]. Darüber hinaus kann ihre Pathogenität durch gentechnische Techniken erheblich verbessert werden, beispielsweise durch die Veränderung des Vektors, der zur Expression des insektenspezifischen Toxins [7] verwendet wird, des Gens oder der spezifischen kurzen Haarnadel-RNA oder künstlichen Mikro-RNA, die auf Gene abzielt, die für die Entwicklung, das Wachstum, oder Physiologie von Mücken [8, 9]. MDVs können in Mückenpopulationen durch horizontale Übertragung in Larvenlebensräumen oder vertikale Übertragung, wenn überlebende infizierte Weibchen das Virus auf die Nachkommen übertragen, oder durch Geschlechtsübertragung während der Paarung übertragen werden [1, 10, 11]. Insgesamt verleihen diese biologischen und pathogenen Eigenschaften MDVs das Potenzial als biologische Kontrollmittel [5].

Einige Untersuchungen haben ergeben, dass MDVs eher in natürlichen Populationen, beispielsweise in Ae, verbreitet sind. aegypti, Anopheles minimus und Culex pipiens [23, 24]. Beispielsweise erreichte die MDV-Positivrate insgesamt 18,8 % bei wilden Larven und 15 % bei adulten Larven von An. minimus, gesammelt in Ban Phu Toei, einem Dorf in Thailand, bei Verwendung PCR-basierter Nachweismethoden [12]. Eine weitere PCR-Erhebung der MDV-Infektionsrate bei erwachsenen Ae. aegypti und Ae. albopictus, ebenfalls in Thailand durchgeführt, zeigte, dass nur die Ae. Die Wildpopulation von aegypti war mit MDV infiziert, mit einer Gesamtprävalenz von 44 % [13]. Eine umfassendere Untersuchung der allgemeinen Prävalenz des Culex pipiens-Densovirus (CpDV) in natürlichen Cx. pipiens (sl)-Populationen wurden kürzlich gemeldet; mehr als zweitausend Cx. Pipiens wurden an 136 verschiedenen Standorten weltweit gesammelt und 48 % der Proben waren CpDV-positiv, wie durch PCR-Diagnosetests festgestellt wurde [14].

Das Dengue-Virus (DENV) gehört zur Familie der Flaviviridae, Gattung Flavivirus, und wird hauptsächlich durch den Stich infizierter erwachsener weiblicher Mücken, insbesondere Ae, auf den Menschen übertragen. aegypti und Ae. albopictus [15, 16]. Die im Südosten Chinas gelegene Provinz Guangdong ist eine hyperendemische Region der Dengue-Übertragung. Seit dem ersten Ausbruch des Dengue-Fiebers im Jahr 1978 wurden in den letzten 40 Jahren über 0,72 Millionen kumulative Fälle registriert, was etwa 90 Prozent der Fälle in China ausmacht [17]. Seit 2010 sind Dengue-Virus-Serotyp 1 (DENV-1) und Dengue-Virus-Serotyp 2 (DENV-2) die vorherrschenden Serotypen in Guangdong. Aktuelle epidemiologische Analysen belegen jedoch, dass sich Dengue-Fieber in Guangdong noch nicht zu einer endemischen Arbovirus-Krankheit entwickelt hat und lokale Dengue-Ausbrüche immer noch durch importierte Fälle ausgelöst werden [17, 18]. Ae. Albopictus ist der einzige bestätigte Übertragungsvektor, der für diese Dengue-Epidemien in Guangdong verantwortlich ist [17].

Zuvor haben wir das neuartige Aedes albopictus densovirus-7 (AalDV-7) aus wild gefangenem Ae isoliert und charakterisiert. albopictus im Dengue-Endemiegebiet der Stadt Guangzhou, Provinz Guangdong [6], was zu der Frage führt, ob MDV in der Wildpopulation von Ae weit verbreitet ist. Albopictus und welchen möglichen Einfluss sie auf die DENV-Übertragung durch Mücken haben könnten. In dieser Studie verwendeten wir zunächst DENV-2 zur Superinfektion von dauerhaft mit AaeDV infizierten C6/36-Zellen und bestimmten die Auswirkung einer solchen Superinfektion auf DENV-2 durch Untersuchung der anhaltenden Infektion. Um eine kompetitive Beeinträchtigung in vivo weiter zu untersuchen, haben wir auch bewertet, ob das Vorhandensein von AaeDV in lebenden Mücken die Vektoranfälligkeit für DENV-2 und sequentielle Infektionsmodi beeinträchtigt, basierend auf der Wahrscheinlichkeit, dass sequentielle Herausforderungen in der Natur am häufigsten vorkommen.

Metagenomische Next-Generation-Sequencing-Daten (NGS) für Feldmücken in China wurden in der NCBI SRA-Datenbank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) und der CNGB Sequence Archive-Datenbank (https://db) durchsucht. cngb.org/cnsa/) mit den Schlüsselwörtern „mosquito OR Anopheles OR Aedes OR Culex“. Anschließend wurden die Datensätze mit weniger als 1 Million Lesevorgängen entfernt und die aus dem Feld in China abgeleiteten Datensätze beibehalten. Insgesamt wurden 29 veröffentlichte Datensätze aus fünf Verwaltungsbezirken auf Provinzebene (PLADs) abgerufen, darunter vier aus Guangdong (SRP188743) und drei aus Yunnan (SRP148705), elf aus Ningxia, fünf aus Gansu und sechs aus Shanxi (CNP0001261) (Einzelheiten in der Zusatzdatei 1: Tabelle S1).

26 Mücken-Densovirus-Genome (MDV) wurden als Referenz von GenBank unter Verwendung der Suchbegriffe „densovirus“ UND „(mosquito OR aAnopheles OR aAedes OR Culex)“ heruntergeladen, wobei die Sequenzlänge auf mehr als 3500 bp begrenzt war (siehe Zusatzdatei 2). : Tabelle S2 für die MDV-Zugangsnummer).

Adapter und minderwertige Basen wurden mit TrimGalore (v0.6.7) entfernt [19]. Die verbleibenden sauberen Lesevorgänge wurden mit den Genomen von Ae abgeglichen. albopictus (AaloF1.2, GCA_001444175.1), Cx. quinquefasciatus (JHB2020, GCA_015732765.1) und An. sinensis (AsinS2.6, GCA_000472065.2) von bowtie2 (v2.4.4) [20]. Alle diese Genome wurden von Vectorbase (http://www.vectorbase.org) heruntergeladen. Die Zuordnung von Lesevorgängen zu Wirtsgenomen wurde entfernt, um Störungen durch das Wirtsgenom und eine mögliche Einfügung viraler Sequenzen auszuschließen, und nicht kartierte Lesevorgänge wurden mithilfe von blatsn (v2.4.4, NIH, USA) mit dem Parameter „evalue < 1e−10“ an der MDV-Referenz ausgerichtet ". Die zugeordneten Lesevorgänge wurden als MDV-bezogene Lesevorgänge beibehalten. Die Häufigkeit der MDV-Lesevorgänge wurde durch die Anzahl der Bibliotheken dividiert und mit einer Million multipliziert, normalisiert auf CPM.

Guangzhou ist die drittgrößte Stadt Chinas und die größte im Süden des Landes. Die Bevölkerungszahl von Guangzhou wird im Jahr 2022 auf über 13.900.000 geschätzt. Die Region um Guangzhou ist für einen massiven Zustrom von Migranten bekannt, wobei bis zu 30 Millionen zusätzliche Migranten mindestens sechs Monate im Jahr in der Gegend leben. Die durchschnittliche Jahrestemperatur in Guangzhou beträgt 22,4 °C und die Niederschlagsmenge beträgt etwa 2123 mm pro Jahr. Daher begünstigen die Umwelt- und Sozialfaktoren in Guangzhou die DENV-Übertragung, und in dieser Region werden seit mehr als 40 Jahren DENV-Epidemien gemeldet [21]. Untersuchung der allgemeinen Prävalenz von MDVs im natürlichen Ae. Albopictus-Populationen, drei Standorte wurden für Mückensammlungen ausgewählt, das Wohnviertel der Southern Medical University (SMU) (113°19′E, 23°11′N, 31 m über dem Meeresspiegel (ü.d.M.), Bevölkerungsdichte von > 3000 Menschen/ km2), Liangtian (113°23′E, 23°21′N, 25 m ü.M.; Bevölkerungsdichte ca. 1000 Menschen/km2) und Dengcun (113°339′E, 23°309′N, 42 m ü.M. 100 Menschen/km2), die drei verschiedene Arten ökologischer Lebensräume repräsentieren: städtische, vorstädtische und ländliche. Mücken wurden zwischen Juni und Juli 2022 an drei Standorten in Guangzhou gesammelt (Abb. 1): SMU, Dengcun und Liangtian. Die Mücken wurden mithilfe von Menschenköder-Doppelnetzfallen (HDN) eingesammelt. Nach dem Einlegen in ein Eisbad bleibt nur noch Ae. Albopictus-Weibchenmücken basierend auf morphologischen Merkmalen wurden für den weiteren Nachweis einer MDV-Infektion zurückbehalten.

Analyse der positiven Raten des Mücken-Densovirus (MDV) in natürlichen Mückenpopulationen. Ein gestapeltes Säulendiagramm, das die positiven (rot) und negativen (blau) Leseraten des Mücken-Densovirus in metagenomischen Feldmückendaten aus fünf Verwaltungsbezirken auf Provinzebene zeigt. B MDV-Positivraten (rot) und Negativraten (blau) in natürlichen Mückenpopulationen, die an drei Standorten in Guangzhou gesammelt wurden. SMU Das Wohnviertel der Southern Medical University

DNA wurde aus einzelnen weiblichen Mücken extrahiert, die aus natürlichen Populationen an den drei Standorten (n = 100 pro Standort) gesammelt wurden, und durch traditionelle PCR auf das Vorhandensein von MDV getestet (zusätzliche Datei 3: Tabelle S3). Als Negativkontrolle dienten MDV-freie Proben aus der Laborkolonie. Ein Satz MDV-spezifischer Primer wurde entwickelt, um ein 655-bp-Fragment (von Position 899 bis 1554 des referenzierten AaeDV-Genoms; GenBank-Zugangsnummer: M37899.1) zu amplifizieren, das sich im hochkonservierten offenen Leserahmen (ORF) von NS1 befindet. Mit diesem Primer-Set konnten nicht nur AaeDV, sondern auch andere verwandte Densoviren wie Aedes albopictus Densovirus (AalDV), Anopheles gambiae Densovirus (AgDV) und Culex pipiens Densovirus (CpDV) nachgewiesen werden, basierend auf dem hohen Konservierungsgrad in dieser Region unter MDVs (Abb. 1, Zusatzdatei 4: Abb. S1). Ribosomales Protein S7 (Rps7) wurde als interne Kontrolle verwendet und im selben Reagenzglas basierend auf Multiplex-PCR (MPCR) amplifiziert. Siehe Zusatzdatei 3: Tabelle S3 für Primer und PCR-Protokolle. Alle Experimente wurden in einem Sicherheitslabor der Biosicherheitsstufe 2 durchgeführt.

Ae. Albopictus C6/36-Zellen (ATCC, Manassas, USA, Kat.-Nr. CRL-1660, RRID: CVCL_Z230) wurden bei 28 °C in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium (Gibco BRL, NY, USA) gezüchtet, ergänzt mit 10 % fötales Rinderserum (FBS; Gibco BRL, NY, USA) und bei 28 ° C gehalten.

Ae. In dieser Studie wurden Albopictus-Mücken des Stammes Foshan verwendet. Die Mücken wurden unter Standard-Insektenbedingungen bei konstanten 28 ± 2 °C, 70–80 % relativer Luftfeuchtigkeit und einer Hell/Dunkel-Photoperiode von 12:12 Stunden aufgezogen. Die Larven wurden in rechteckigen Edelstahlpfannen mit den Maßen 26,5 cm x 15,5 cm aufgezogen und mit handelsüblichem, fein gemahlenem Schildkrötenfutter (INCH-GOLD, Shenzhen, China) gefüttert. Erwachsene Kolonien wurden in Edelstahlkäfigen [20 (Länge) × 20 (Breite) × 30 (Höhe) cm, Volumen = 12.000 cm3] gehalten und mit einem in 10 % Zuckerlösung getränkten Baumwolldocht versorgt. Erwachsene Weibchen wurden drei und vier Tage nach dem Auflaufen mit defibriniertem Schafsblut (Solarbio Life Sciences, Peking, China) unter Verwendung von Hemotek-Membranfütterungssystemen (Hemotek Ltd., Blackburn, UK) gefüttert. Jede Mückencharge wurde mittels konventioneller PCR untersucht, um sicherzustellen, dass die Versuchsmücken frei von MDVs waren.

Um die persistent infizierte AaeDV-Zelllinie zu etablieren, wurden C6/36-Zellen mit AaeDV in einer Endkonzentration von 1011 Kopien/ml infiziert; Die infizierten Zellen wurden nach dreitägiger Inokulation mit AaeDV alle zwei Tage seriell passagiert. Die persistent infizierten C6/36-Zellen wurden nach der Inokulation mit AaeDV zehnmal seriell passagiert und für weitere Untersuchungen verwendet.

pUCA ist der infektiöse Klon von AaeDV, der die genomische DNA von AaeDV in voller Länge enthält und freundlicherweise von Prof. Erica Suchman und Jonathan Carlson zur Verfügung gestellt wurde. Die Konstruktion von Plasmiden wurde bereits ausführlich beschrieben [22]. Das Wildtypvirus AaeDV wurde durch Transfektion von pUCA in C6/36-Zelllinien gemäß einer zuvor beschriebenen Methode erzeugt [22].

Der in dieser Studie verwendete Neuguinea-C-Stamm (NGC) des Dengue-Virus Serotyp 2 (DENV-2) wurde im Labor des Guangdong Provincial Key Laboratory of Tropical Disease Research, School of Public Health, Southern Medical University aufbewahrt. DENV-2-Stammvorräte wurden durch Inokulation einer nahezu konfluenten Monoschicht aus C6/36-Zellen in einer 25-cm2-Gewebekulturflasche erhalten, wobei das Virus in 3 ml RPMI-1640-Medium, das 2 % hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum enthielt, auf 1:6 verdünnt wurde ( FBS; Gibco BRL, NY, USA). Überstände infizierter Zellen wurden drei Tage nach der Infektion gesammelt, bis eine offensichtliche zytopathische Wirkung eintrat, 5 Minuten lang bei 1500 × g zentrifugiert, in 0,5-ml-Aliquots aufgeteilt und bei –80 °C gelagert. Virustiter werden als 50 % infektiöse Gewebekulturdosis (TCID50/ml) ausgedrückt, basierend auf der von Reed und Muench [23] beschriebenen Methode.

Die Kopienzahl des AaeDV-Genoms wurde mittels quantitativer Echtzeit-PCR (qPCR) quantifiziert. Kurz gesagt, nicht eingekapselte genomische DNA wurde durch einstündige Behandlung mit TURBO DNase (Ambion, Austin, TX, USA) bei 37 ° C entfernt. Die gesamte eingekapselte genomische DNA wurde mit einem Viral DNA Kit (Omega Bio-Tek, GA, USA) extrahiert. Eine Standardkurve wurde unter Verwendung serieller zehnfacher Verdünnungen eines linearen Plasmids bei bekannten Konzentrationen erstellt. Die Einzelheiten dieser Verfahren wurden bereits zuvor beschrieben [24]. Die Anzahl der Virusgenomkopien wurde unter Verwendung eines SYBR-grünen qPCR-Assays mit SuperReal qPCR PreMix (Tiangen Biotech, Peking, China) bestimmt. Die verwendeten Primersequenzen und Reaktionsbedingungen waren wie zuvor beschrieben [24].

DENV-2-RNA wurde durch Echtzeit-RT-PCR (qRT-PCR) unter Verwendung zuvor beschriebener spezifischer Primer gemäß veröffentlichten Reaktionsbedingungen quantifiziert [25]. Ein 1995-bp-DNA-Fragment, das mit DENV2-F/DENV2-R-Primern amplifiziert wurde, wurde nach Linearisierung mit dem Restriktionsenzym EcoRI (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) in das Plasmid pMD18-T ligiert (zusätzliche Datei 3: Tabelle S3). Eine Standardkurve für DENV-2 wurde unter Verwendung einer zehnfachen Reihenverdünnung des linearen Plasmids erstellt, das ein Fragment von DENV-2 über die Nukleotide 9937–10.113 enthielt, gemäß veröffentlichten Verfahren [25]. Jede Probe wurde dreifach analysiert. Nachdem die Spezifität der PCR-Produkte anhand der Schmelzkurve überprüft wurde, wurden die Kopienzahlen des viralen Genoms durch absolute Quantifizierung basierend auf Zyklusschwellenwerten (Ct) und Standardkurven bestimmt.

Mit AaeDV infizierte oder nicht infizierte C6/36-Zellen (106) wurden einen Tag vor der DENV-2-Infektion in einer Platte mit 12 Vertiefungen vorgesät. Die C6/36-Zellmonoschichten wurden mit PBS gewaschen und mit DENV-2 bei einer MOI von 1 infiziert. Die Platten wurden zur Adsorption 15 Minuten lang leicht bei Raumtemperatur geschüttelt und 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden einzelne Vertiefungen mit C6/36-Zellen dreimal mit PBS gewaschen und frisches Medium hinzugefügt. Die Infektion wurde 12, 24, 48, 72, 96 und 120 Stunden lang bei 28 °C durchgeführt und durch Immunfluoreszenzassay und qRT-PCR bestätigt.

Die Einzelheiten der Produktion eines polyklonalen Kaninchen-Antikörpers gegen AaeDV NS1 wurden beschrieben [6]. Monoklonale Maus-Anti-DENV-Virus-E2-Hüllglykoprotein-Antikörper wurden von Abcam (Cambridge, MA, USA) bezogen. Die verwendeten Sekundärantikörper, Esel-Anti-Kaninchen-IgG-Alexa Fluor-594 und Ziegen-Anti-Maus-IgG-Alexa Fluor-488, wurden von Thermo Fisher Scientific (MA, USA) erworben.

C6/36-Zellen wurden auf Glasdeckgläsern gezüchtet, mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, mit einer Mischung aus Aceton und absolutem Alkohol (3:2) fixiert und mit 1 % BSA + 0,05 % PBST-Lösung 2 Stunden lang bei 37 °C blockiert C und mit PBST gewaschen. Nach der Inkubation mit den primären Antikörpern wurden die Deckgläser mit PBS gewaschen und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit Alexa Fluor 594-konjugiertem Esel-Anti-Kaninchen-IgG und/oder Alexa Fluor 488 Hoechst-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-Färbemittel gefärbt. Für die Kernfärbung wurde DAPI verwendet. Die Bilder wurden unter einem 100-fachen Ölobjektiv unter Verwendung eines konfokalen FluoView 1000-Mikroskops (Olympus, Tokio, Japan) sichtbar gemacht. Die Analyse der Bilder und die Berechnung der positiven Signale der Immunfluoreszenz wurden mit der ImageJ-Software (1,49 V, NIH, USA) durchgeführt [26].

Zwei Tage alte Ae. weibliche Erwachsene des Typs albopictus wurden durch intrathorakale Injektion mit AaeDV infiziert. Kurz gesagt, Erwachsene wurden auf Eis anästhesiert und etwa 69 nl AaeDV-Stamm (1011 GE/ml) wurden unter einem Mikroskop in den Thorax injiziert, wie zuvor beschrieben [27, 28]. Nach der Injektion wurden die erwachsenen Mücken sofort in kleine Plastikbecher (1000 ml, 11 cm Durchmesser oben) überführt, über getränkte Baumwolldochte mit einer 10-prozentigen Glucoselösung gefüttert und konnten sich erholen. Den Mücken wurde RPMI 1640-Medium nur als scheininfizierte Kontrollen injiziert. Für jede Behandlung wurden drei unabhängige biologische Replikate einbezogen (n = 30 pro Replikat).

Um die Interferenz zwischen DENV-2 und AaeDV in Aedes-Mückenzellen zu untersuchen, wurden stabile und persistente AaeDV-infizierte C6/36-Zellen mit DENV bei einer MOI von 1 superinfiziert. Genomkopien von DENV-2 und AaeDV wurden in Zelllysaten und Überständen gemessen qPCR und der Prozentsatz der DENV-2- und AaeDV-positiven/negativen Zellen wurden 12, 24, 48, 72, 96 und 120 Stunden nach der Superinfektion (hpi) berechnet. Um die Auswirkung einer Superinfektion auf den Prozentsatz viruspositiver C6/36-Zellen zu bestimmen, führten wir eine Immunfluoreszenzmikroskopie in monoinfizierten und superinfizierten C6/36-Zellen durch und quantifizierten die Fluoreszenzintensität mithilfe der ImageJ-Software (1,49 V, NIH, USA) [26]. .

Injizierte Mücken konnten sich unter Standardaufzuchtbedingungen erholen. Vier Tage nach der Injektion, Ae. Weibliche Albopictus-Mücken wurden 2 Stunden lang infektiösen Blutmahlzeiten ausgesetzt, wobei eine blutgetränkte Pledget-Technik in drei unabhängigen Wiederholungen zum Einsatz kam [29]. Jede Blutmahlzeit bestand aus frischem Virus, verdünnt in handelsüblichem defibriniertem Schafsblut und 1 % Saccharose, um einen endgültigen Virustiter von etwa 107 TCID50/ml DENV-2 zu ergeben. Nach der Fütterung wurden vollständig vollgestopfte Weibchen ausgewählt und in die Standardaufzucht zurückgeführt. Um die Einflüsse einer AaeDV-Infektion auf die Anfälligkeit für Ae zu bewerten. albopictus zur DENV-Infektion wurden erwachsene weibliche Mücken zunächst mit AaeDV [106 Genomäquivalente (geq)/pro Mücke] über eine Thoraxinjektion infiziert und dann künstlich mit einer Blutmischung mit etwa 109 RNA-Kopien/ml DENV gefüttert, wie in beschrieben Abschnitt Methoden. IR, DR und SGIR wurden ausgewertet und ein monoinfizierter Erwachsener als Kontrolle verwendet. Der Arbeitsablauf ist in Abb. 5A und B dargestellt.

0, 5, 10 und 15 Tage nach der DENV-2-Infektion (dpi) wurden überlebende Mücken mit CO2 anästhesiert und auf einem vorgekühlten Glasobjektträger für Vektoranfälligkeitstests präpariert. Mit Einweg-Insekten-Mikronadeln wurden der Mitteldarm, die Eierstöcke und die Speicheldrüsen jeder Mücke unter einem Präpariermikroskop abgetrennt. Die Proben wurden dreimal in PBS gewaschen und dann vor der TRIzol-Zugabe mit einem motorbetriebenen Gewebezerkleinerer homogenisiert, und virale Nukleinsäure wurde mit dem MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver. extrahiert. 5.0 (TaKaRa, Japan) gemäß dem Protokoll des Herstellers. Die Erststrang-cDNA-Synthese und die RT-PCR-Amplifikation wurden nach Methoden durchgeführt, die zuvor ausführlich beschrieben wurden (30). Die verwendeten Primersequenzen und PCR-Bedingungen sind in der Zusatzdatei 3: Tabelle S3 aufgeführt.

Vektoranfälligkeit von Ae. Albopictus gegen DENV-2 wurde durch Berechnung der Mitteldarminfektionsrate (MIR; Anzahl der infizierten Mitteldärme/Anzahl der getesteten Mitteldärme), der Verbreitungsrate (DR; Anzahl der infizierten Eierstöcke/Anzahl der infizierten Mitteldärme) und der Speicheldrüse bewertet Infektionsrate (SGIR; Anzahl infizierter Speicheldrüsen/Anzahl getesteter Mücken) [31, 32]. Genomkopien von AaeDV wurden in allen Mitteldärmen, Eierstöcken und Speicheldrüsen quantifiziert, und Genomkopien wurden in DENV2-positiven Geweben durch absolute qRT-PCR weiter bestimmt.

In dieser Studie wurde die Vektorkompetenz von Ae mithilfe der logistischen Regression untersucht. albopictus für DENV-2. IR, DR und SGIR wurden zu verschiedenen Zeitpunkten getrennt verglichen und der P-Wert wurde durch Bonferroni-Anpassungen korrigiert. Chi-Quadrat-Tests (und exakte Fisher-Tests) wurden verwendet, um den Unterschied in der Vektorkompetenz zwischen der AaeDV-infizierten Gruppe und der negativen Gruppe zu bestimmen. Tukeys LSD-Varianztests wurden post hoc auf den DENV-2-Spiegeln in den Geweben jeder Gruppe nach der logarithmischen Transformation durchgeführt. Zu jedem Zeitpunkt wurde der Student-t-Test verwendet, um DENV-2-RNA-Kopien zwischen der AaeDV-infizierten und der negativen Gruppe zu vergleichen. Ein AP-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen (*), wobei ein P-Wert < 0,01 eine starke statistische Signifikanz darstellte (**). Statistische Analysen wurden mit SPSS 20.0 (IBM, Chicago, IL, USA) durchgeführt.

Wir haben die Prävalenz von MDV bei 30.034 Mücken in 29 Pools charakterisiert, die vier Mückenarten aus fünf PLADs (Yunnan, Shaanxi, Gansu, Ningxia und Guangdong) repräsentieren. Nach der Qualitätskontrolle wurden insgesamt 309.695.245 saubere Paired-End-Lesevorgänge mit einem Durchschnitt von etwa 5,16 M Lesevorgängen pro 500 Mücken (0,85–114,43 M Lesevorgänge pro 500 Mücken) beibehalten und für die anschließende Pipeline zur MDV-Identifizierungsanalyse verwendet. Unter ihnen wurden 3.014.183 Lesevorgänge als virale Lesevorgänge identifiziert, was 0,12 % (355.113/309.695.245) aller sauberen Lesevorgänge ausmacht und auf eine reiche Vielfalt an MDVs schließen lässt, die von Mücken beherbergt werden. Unter Ausschluss von sechs Bibliotheken aus Shanxi (keine Lesetreffer) betrugen die MDV-positiven Leseraten 66,67 % (2/3), 40,00 % (2/5), 18,18 % (2/11) und 25,00 % (1/4). in Yunnan, Gansu, Ningxia und Guangdong (Abb. 1, Zusatzdatei 4: Abb. S1). Der CPM der MDVs lag zwischen 1,39 und 46.862,13 (Zusatzdatei 1: Tabelle S1). Die jeweiligen Mindestinfektionsraten in Shanxi, Yunnan, Gansu, Ningxia und Guangdong betrugen 0 %, 0,03 %, 0,05 %, 0,02 % und 0,10 % (Zusatzdatei 1: Tabelle S1). Die Ergebnisse legen nahe, dass die natürliche Mückenpopulation häufig unterschiedliche Mengen an MDVs in sich trägt.

DNA-Proben von insgesamt 300 einzelnen Mücken, die zwischen Mai und Juli 2022 an drei verschiedenen Standorten (SMU für Stadt, Dengcun für Land und Liangtian für Vorort) gesammelt wurden, wurden einem PCR-basierten Diagnosetest und einem MDV-spezifischen Satz von Tests unterzogen Primer wurden entwickelt, um 655 bp (von 899 auf 1554) zu amplifizieren (Zusatzdatei 3: Tabelle S3 für Primer und PCR-Protokolle, Abb. 1, Zusatzdatei 4: Abb. S1), die sich im hochkonservierten NS1-ORF befinden. Als Ergebnis waren 83,00 %, 79,00 % und 68,00 % der Proben MDV-positiv (Abb. 1) in der SMU, Liangtian und Dengcun (Zusatzdatei 4: Abb. S1, Zusatzdatei 5: Abb. S2).

C6/36-Zellen wurden dauerhaft mit AaeDV infiziert, ohne einen erkennbaren zytopathischen Effekt (CPE) zu verursachen, und wuchsen im Vergleich zu nicht infizierten C6/36-Zellen normal. Die Genomkopienzahl von AaeDV wurde am Ende jeder Passage mithilfe eines quantitativen PCR-Assays quantifiziert. Wie in Abb. 2A gezeigt, wurden die AaeDV-DNA-Moleküle aus infizierten Zellen über zehn Passagen hinweg auf einem relativ konstanten Niveau gehalten. Darüber hinaus wurde der Gesamtprozentsatz der AaeDV-positiven Zellen am Ende der ersten, fünften und zehnten Passage mit einem Anti-NS1-Antikörper über IFA nachgewiesen (Abb. 2B). Die Raten infizierter C6/36-Zellen blieben bei etwa 16 % (Abb. 2C). Die obigen Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine stabile und anhaltende AaeDV-Infektion in C6/36-Zellen etabliert wurde.

Bestimmung einer stabilen und persistierenden AaeDV-Infektion in C6/36-Zellen. Eine Quantifizierung der genomischen AaeDV-DNA aus infizierten Zellen am Ende jeder Passage bis zur zehnten Passage. B-Zellen wurden mit einer Mischung aus Aceton und absolutem Alkohol fixiert und permeabilisiert und mit einem Anti-NS1-Primärantikörper und einem Alexa Fluor 594-konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (rote, infizierte Zellen) sondiert. Zellkerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt und konfokale Bilder aufgenommen. Die Einschübe oben rechts zeigen ein vergrößertes Bild von Zellen, die AaeDV beherbergen, und das AaeDV-NS1-Protein befindet sich überwiegend im Zellkern von C6/36-Zellen. C Der Prozentsatz der AaeDV-positiven/negativen Zellen wurde mit der ImageJ-Software gemäß Abbildung B berechnet. Alle Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. n = 3

Wie in Abb. 3A gezeigt, wurden AaeDV-infizierte Zelllysate gesammelt, gefolgt von einer DENV-2-Superinfektion bei 12, 24, 48, 72 und 96 hpi, ohne signifikanten Unterschied in den DENV-2-Kopien zwischen den superinfizierten Zellen und einzelnen DENV -2-infizierte Zellen (12 hpi, P = 0,442; 24 hpi, P = 0,768; 48 hpi, P = 0,374; 72 hpi, P = 0,643; 96 hpi, P = 0,065). Allerdings stieg der DENV-2-RNA-Spiegel im Vergleich zu einzelnen DENV-2-Infektionsbehandlungen bei 120 hpi leicht an. Umgekehrt zeigte die intrazelluläre AaeDV-Replikation bei der Superinfektionsbehandlung zu keinem Zeitpunkt nach der Superinfektion einen signifikanten Unterschied zu der bei der AaeDV-Monoinfektion (12 hpi, P = 0,855; 24 hpi, P = 0,880; 48 hpi, P = 0,460; 72 hpi, P = 0,538; 96 hpi, P = 0,540; 120 hpi, P = 0,371) (Abb. 3B).

Wachstumseigenschaften von DENV-2 und AaeDV bei Monoinfektions- und Superinfektionsbehandlungen. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion wurden RNA- und DNA-Proben aus Zellen und Kulturüberstand hergestellt und qPCR-Assays wurden verwendet, um die Konzentrationen von DENV-2-RNA und AaeDV-DNA zu messen. Intrazelluläre Spiegel von DENV-2 (A) und AaeDV (B) bei Monoinfektions- bzw. Superinfektionsbehandlungen. Die intrazellulären Spiegel von DENV-2 und AaeDV wurden in derselben Probe auf rps7-mRNA normalisiert. Relative Konzentrationen von DENV-2 (C) und AaeDV (D) im Überstand von Monoinfektions- und Superinfektionsbehandlungen. Der relative Wert bei 12 hpi wurde auf 1 festgelegt. Die dargestellten Daten stammen aus einem repräsentativen Experiment, das dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt wurde. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar

Im Gegensatz dazu war die Kopienzahl der Dengue-Virus-RNA im Überstand 120 Stunden nach der DENV-2-Superinfektion im Vergleich zur DENV-2-Monoinfektion unterdrückt (1,02 ± 0,05 und 1,25 ± 0,09). Im Gegensatz dazu war die Anzahl der genomischen AaeDV-Kopien 48 Stunden nach der DENV-2-Superinfektion im Vergleich zur AaeDV-Monoinfektion signifikant erhöht, und die fördernde Wirkung von DENV-2 auf die AaeDV-Replikation nahm mit der Zeit zu (48 hpi, 1,16 ± 0,06 und 1,00 ± 0,03; 72). hpi, 1,22 ± 0,05 und 0,97 ± 0,03; 96 hpi, 1,39 ± 0,10 und 1,05 ± 0,02; 120 hpi, 1,46 ± 0,09 und 1,04 ± 0,04). Insgesamt stieg die relative Menge des AaeDV-Genoms bei der Superinfektionsbehandlung im Vergleich zur AaeDV-Monoinfektion bei 120 hpi um fast das 0,42-fache (Abb. 3C und D).

Das spezifische intrazelluläre Fluoreszenzsignal für das DENV-E2-Hüllglykoprotein in C6/36-Zellen war in DENV-2-E2-Hüllglykoprotein-positiven Zellen um etwa 38 % bzw. 63 % bei 96 hpi bzw. 120 hpi im Vergleich zur Monoinfektionskontrolle verringert . Allerdings wurde bei der Superinfektionsbehandlung eine signifikant erhöhte Rate an Zellen mit AaeDV-NS1-spezifischen Signalen beobachtet (72 hpi, P = 0,015; 96 hpi, P = 0,007; 120 hpi, P = 0,001), was auf eine DENV-2-Infektion schließen lässt tatsächlich förderte die Replikation von AaeDV in C6/36-Zellen (Abb. 4A und C). Darüber hinaus zeigte die konfokale Bildgebung das Vorhandensein von DENV-2- und AaeDV-Proteinen in derselben Zelle in weniger als 2 % der Zellen bei 96 hpi und 120 hpi (Abb. 4B).

Immunfluoreszenzbildgebung von C6/36-Zellen, die mit AaeDV und DENV-2 monoinfiziert oder superinfiziert sind. A-C6/36-Zellen wurden einer AaeDV-Infektion unterzogen und dann 12, 24, 48, 72, 96 und 120 Stunden lang mit DENV-2 superinfiziert. Als Kontrollen wurden AaeDV- und DENV-2-Monoinfektionsbehandlungen verwendet. Die Zellen wurden zu den jeweiligen Zeitpunkten nach der Infektion mit einer Mischung aus Aceton und absolutem Alkohol fixiert und permeabilisiert und auf DENV (grün, AF488) und AaeDV (rot, AF594) immungefärbt. Die Bilder wurden unter einem Mikroskop aufgenommen. DAPI wurde zur Färbung des Zellkerns (blau) verwendet. B Die Einschübe oben rechts zeigen ein vergrößertes Bild von Zellen, die beide Viren beherbergen. Das CA-Balkendiagramm zeigt den Prozentsatz der mit AaeDV und DENV infizierten C6/36-Zellen bei Monoinfektion im Vergleich zur Superinfektion. Die angegebenen Werte sind der Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Replikaten. *, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001

Für die Präparation des Mitteldarms, der Speicheldrüsen und des Eierstockgewebes bei 0, 5, 10 und 15 dpi nach Exposition gegenüber DENV-2 wurden nur vollgestopfte Weibchen verwendet. Bis zu 15 dpi zeigten erwachsene Mücken, denen AaeDV injiziert wurde, keinen signifikanten Anstieg der Mortalität. Bei 0 dpi lagen die IRs der Mücken bei den Superinfektions- und Monoinfektionsbehandlungen bei 100 %, was darauf hinweist, dass alle Mücken die Blutmahlzeit mit DENV-2 aufgenommen haben (Abb. 5C). Nachdem die infektiöse Blutmahlzeit verdaut war, wurden die IRs von Ae. Albopictus waren bei 5 dpi im Vergleich zu 0 dpi signifikant reduziert (z = 10,329, P = 0,001; z = 4,149, P = 0,0042; z = 4,565, P = 0,003) und nahmen dann bei 10 hpi und 15 dpi allmählich zu (Abb. 5C). ). Es gab jedoch zu keinem Zeitpunkt einen signifikanten Unterschied in der IR zwischen superinfizierten und monoinfizierten Mücken (5 dpi, P = 0,774; 10 dpi, P = 0,739; 15 dpi, P = 0,685) (Abb. 5C). Bei superinfizierten Mücken wurde DENV-2 bereits bei der monoinfizierten Kontrolle mit 10 dpi in die Eierstöcke verbreitet. Die DRs nahmen bei 10 dpi und 15 dpi tendenziell leicht ab; Die Änderung war jedoch nicht signifikant (10 dpi, P = 0,442; 15 dpi, P = 0,397) (Abb. 5D).

Vektoranfälligkeit von Ae. albopictus oral mit DENV-2 infiziert bei monoinfizierten oder superinfizierten erwachsenen Weibchen. Ein Diagramm des Arbeitsablaufs zum Nachweis von DENV-2 in verschiedenen Geweben von Ae. albopictus. Die Mitteldärme, Eierstöcke und Speicheldrüsen von Mücken bei Monoinfizierten oder Superinfizierten wurden 0, 5, 10 und 15 Tage nach der Infektion präpariert und durch PCR nachgewiesen. B Schematische Darstellung der Ereignisse nach der Einnahme von DENV-2-infiziertem Blutmehl bis zur anschließenden Übertragung. Das Virus infiziert Epithelzellen des Mitteldarms, indem es die Infektionsbarriere des Mitteldarms überschreitet. Das Virus breitet sich dann in alle Organe aus, einschließlich der Eierstöcke und Speicheldrüsen. Eine Infektion der Speicheldrüsen wird durch das Überschreiten der Speicheldrüsen-Infektionsbarriere (SGIBs) festgestellt. Mitteldarminfektionsrate (MIR) = Anzahl der infizierten Mitteldärme/Anzahl der getesteten Mitteldärme. Verbreitungsrate (DR) = Anzahl infizierter Eierstöcke/Anzahl infizierter positiver Mitteldärme. Speicheldrüseninfektionsrate (SGIR) = Anzahl der infizierten Speicheldrüsen/Gesamtzahl der getesteten Mücken. C DENV-2 MIR bei monoinfizierten oder superinfizierten Mücken. D DENV-2 DR bei monoinfizierten oder superinfizierten Mücken. E DENV-2 SGIR bei monoinfizierten oder superinfizierten Mücken. Die Ergebnisse stammen aus drei unabhängigen Experimenten (n = 29–30 pro Gruppe), und Fehlerbalken geben die Standardabweichung an

DENV-2 in den Speicheldrüsen wurde erstmals bei 10 dpi sowohl bei monoinfizierten als auch bei superinfizierten erwachsenen Frauen nachgewiesen, und der SGIR stieg im Laufe der Zeit allmählich an (Abb. 5E). Bei 15 dpi war der SGIR bei der Superinfektionsbehandlung im Vergleich zu dem bei der monoinfizierten Kontrolle signifikant um fast das 0,6-fache verringert (P = 0,045) (Abb. 5E).

Die Mengen an DENV-2 im Mitteldarm, den Eierstöcken und den Speicheldrüsen von Ae. albopictus wurden weiter mittels qRT-PCR gemessen. AaeDV wurde auch durch qPCR im Mitteldarm, in den Eierstöcken und in der Speicheldrüse aller Proben beurteilt, um eine Infektion zu bestätigen (Abb. 6 und Zusatzdatei 6: Abb. S3).

Kopienzahlen des DENV-2-Genoms in verschiedenen Geweben monoinfizierter oder superinfizierter Ae. Albopictus erwachsene Weibchen. DENV-2-RNA-Kopienzahlen in positiven Geweben von Ae. Albopictus-Erwachsene wurde durch qRT‒PCR quantifiziert. Ein Mitteldarm; B Eierstöcke; C Speicheldrüsen. Horizontale schwarze Linien zeigen den Mittelwert der DENV-2-RNA-Kopienzahlen (log10) und Fehlerbalken geben die Standardabweichung an

Sowohl bei Monoinfektions- als auch bei Superinfektionsbehandlungen sanken die DENV-2-Kopien (log10) im Mitteldarm deutlich von 0 (7,28 ± 0,12 und 7,35 ± 0,15) auf 5 dpi (6,81 ± 0,34 und 6,93 ± 0,69) und stiegen dann im Laufe der Zeit langsam an. Der DENV-2-Wert erreichte seinen Höhepunkt bei 15 dpi (7,66 ± 0,77 und 7,62 ± 0,80). Allerdings zeigten die DENV-2-RNA-Kopien zu allen untersuchten Zeitpunkten keine signifikanten Unterschiede zwischen monoinfizierten oder superinfizierten erwachsenen Weibchen (0 dpi, P = 0,177; 5 dpi, P = 0,448; 10 dpi, P = 0,743; 15 dpi, P =). 0,835) (Abb. 6A).

In den Eierstöcken stieg die Virustitration von Monoinfektions- und Superinfektionsbehandlungen von 10 dpi (6,42 ± 0,90 und 6,37 ± 0,86) auf 15 dpi (7,16 ± 0,36 und 6,84 ± 0,39) (Abb. 6B). Bemerkenswerterweise waren die DENV-2-RNA-Kopien bei den Superinfektionsbehandlungen im Vergleich zu denen bei den Monoinfektionsbehandlungen bei 15 dpi (P = 0,016) signifikant verringert (Abb. 6B).

Der Variationstrend bei den DENV-2-RNA-Kopien in den Speicheldrüsen war ähnlich dem in den Eierstöcken (Abb. 6C). DENV-2-RNA-Kopien in den Speicheldrüsen waren bei Monoinfektionsbehandlungen bei 15 dpi höher als bei 10 dpi, wohingegen DENV-2-Kopien bei Superinfektionsbehandlungen keine signifikante Veränderung zwischen den beiden Zeitpunkten zeigten (P = 0,708). Darüber hinaus wurden DENV-2-RNA-Kopien bei den Superinfektionsbehandlungen im Vergleich zu denen bei den Monoinfektionsbehandlungen bei 15 dpi (P = 0,020) signifikant unterdrückt (Abb. 6C).

Insektenspezifische Viren (ISVs) sind eine vielfältige Gruppe, die ausschließlich Insektenwirte infizieren und keine Wirbeltiere infizieren [33]. Die meisten Mücken-ISVs gehören zu den Flaviviridae, während andere zu den Familien Peribunyaviridae, Reoviridae, Birnaviridae und anderen Taxa gehören [34] und aufgrund ihrer weiten Verbreitung und ihres Mückenwirtsbereichs eine entscheidende Rolle im Mückenmikrobiom spielen [35,36]. ,37,38]. Von Mücken übertragene Viren (MBVs) sind Arboviren, die zwischen Mücken und Wirbeltieren übertragen werden können und beim Menschen Krankheiten wie das Zika-Virus (ZIKV), das Dengue-Virus (DENV), das Chikungunya-Virus (CHIKV) und das Mayaro-Virus (MAYV) verursachen erhebliche Probleme der öffentlichen Gesundheit und wirtschaftliche Belastungen weltweit [39]. Da sowohl ISVs als auch MBVs Mückenvektoren infizieren und sich in ihnen replizieren, ist die Interaktion der mikrobiellen Gemeinschaft zwischen den ISVs und MBVs in Mücken unvermeidlich. Der Einfluss von ISVs auf MBVs, sogar auf die Vektorkompetenz von Mücken, wird zweifellos zu einem wichtigen Forschungsthema bei Wirt-Pathogen-Vektor-Interaktionen (40, 41).

Die vorherrschenden Muster mehrfacher Infektionen von ISVs und MBVs lassen sich in zwei große Kategorien einteilen: Koinfektion und Superinfektion. Es bleibt jedoch unklar, ob eine Koinfektion oder eine Superinfektion auftritt und welcher sequentielle Infektionsmodus der Superinfektion in natürlichen Mückenpopulationen am häufigsten vorkommt. Tatsächlich kann es auf der geografischen Verteilung der Fläschchen, der Infektionsrate der Vektorpopulation, ökologischen Faktoren und anderen damit verbundenen epidemiologischen Merkmalen des MBV-Wirts basieren.

Guangdong ist ein Hochrisikogebiet für Dengue-Fieber in China. Vor der weltweiten COVID-19-Pandemie wurden in Guangdong fast jährlich Ausbrüche von Dengue-Fieber gemeldet, insbesondere in Guangzhou, die mehr als die Hälfte der DENV-Fälle auf dem chinesischen Festland ausmachten. Einige Studien haben gezeigt, dass lokale Ae. Albopictus-Mücken sind kompetente Überträger für DENV [42,43,44] und führen theoretisch zu autochthonen Dengue-Ausbrüchen in der Provinz Guangdong. Nur wenige Studien haben über DENV-positive Ae berichtet. Albopictus-Nachweis mittels RT-PCR während der Dengue-Epidemie in Guangzhou [45]. Darüber hinaus wurde im Epidemiegebiet von Guangzhou kein DENV aus Mücken isoliert. Die bisherigen Erkenntnisse stützen auch die Theorie, dass sich Dengue-Fieber in Guangdong noch nicht zu einer endemischen Arbovirus-Krankheit entwickelt hat.

Für ISVs und MBVs gibt es immer mehr Hinweise darauf, dass Interaktionen zwischen ISVs und MBVs und komplexen Virusgemeinschaften einen erheblichen Einfluss auf die Vektorbiologie und sogar potenzielle Vektorkompetenz bei der Aufrechterhaltung und Übertragung von MBV haben. Koinfektion und Superinfektion von ISVs und MBVs werden seit vielen Jahren in vitro und in vivo untersucht, und es wurden auch Interaktionsbeziehungen zwischen bestimmten ISVs und MBVs beobachtet. Obwohl ISVs weit verbreitet sind und in natürlichen Mückenpopulationen fortbestehen, wurde in einigen Regionen, beispielsweise in Guangdong, noch keine nennenswerte Persistenz von MBVs in wilden Mückenpopulationen festgestellt. Daher konzentriert sich die aktuelle Forschung mehr auf die MBV-Superinfektion in ISV-resistenten Zellen und Mücken. Beispielsweise hat das Anopheles gambiae densovirus (AgDV) einen negativen Einfluss auf die Infektion mit dem Mayaro-Virus in beiden An. Gambiae-Zellen und Mücken [27]. Das Cell-Fusing-Agent-Virus (CFAV) reduziert die Verbreitung von DENV-1 und ZIKV in Ae. aegypti [46]. Persistentes Culex-Flavivirus (CxFV) kann die WNV-Replikation in Cx hemmen. pipiens [47] und unterdrücken auch den Titer von DENV-1 und ZIKV im Kopfgewebe von Ae. aegypti [46], was zu einer verminderten MBV-Verbreitung bei Mücken führt. Eine Superinfektion mit dem Espirito-Santo-Virus (ESV) mit DENV unterdrückt die DENV-2-Replikation und behindert die Vektorkompetenz von Ae. aegypti für DENV-2 [48]. Das Vorhandensein des Phasi-Charoen-ähnlichen Virus (PCLV) führt zu einer Störung des ZIKV-Wachstums in Ae. aegypti Aag2-Zellen [49]. Es wurde gezeigt, dass eine Infektion mit einem insektenspezifischen Flavivirus, dem Nhumirim-Virus (NHUV), die Infektion und Übertragung von ZIKV bei Ae einschränkt. aegypti [50]. Ein insektenspezifisches Alphavirus, das Eilat-Virus (EILV), zeigt homologe und heterologe Interferenzen gegen das Sindbis-Virus (SINV), das Venezolanische Pferdeenzephalitis-Virus (VEEV), das Östliche Pferdeenzephalitis-Virus (EEEV), das Westliche Pferdeenzephalitis-Virus (WEEV) und CHIKV in Ae. albopictus C7/10-Zellen und verzögert die Verbreitung von CHIKV in Ae. aegypti [51].

MDVs sind mückenspezifische Parvoviren. Als eine Art ISV mit einem sehr engen Wirtsbereich muss die Prävalenz von MDVs in natürlichen Populationen noch umfassend erforscht werden, insbesondere in MBV-endemischen Regionen, was den Grundstein für weitere heterologe Interferenzanalysen legen wird, die näher an der tatsächlichen Umweltsituation sind . Unsere Studie bietet einen kurzen Überblick über die MDVs in Feldmücken Chinas anhand einer NGS-Datenanalyse. Die Ergebnisse zeigten, dass MDVs in wilden Mückenpopulationen von fünf PLADs, einschließlich Ae, relativ weit verbreitet sind. albopictus, Cx. pipiens, Cx. tritaeniorhyncus und An. siniens. Anschließend konzentrierten wir uns auf den weiteren Nachweis von MDV in Ae. Albopictus-Populationen in Guangzhou mit der traditionellen PCR-Methode, und die Ergebnisse zeigten eine unerwartet hohe MDV-Positivitätsrate in der Wildpopulation in Guangzhou. Tatsächlich lag die MDV-Positivrate in den Populationen aller drei verschiedenen Lebensräume bei über 65 % und war damit höher als zuvor berichtet [52]. Daher konzentrierte sich unsere Forschung auf die DENV-Superinfektion bei Ae. Albopictus-Zellen und Erwachsene mit persistierenden MDVs. In vitro wurden AaeDV-persistente C6/36-Zellen mit DENV-2 superinfiziert und die Genkopienzahlen wurden sowohl in Zellpellets als auch in Überständen zu verschiedenen Zeitpunkten quantifiziert. Obwohl für DENV-2 zu den meisten Zeitpunkten kein signifikanter Unterschied beobachtet wurde, wurde bei 120 hpi ein verringerter DENV-2-RNA-Spiegel in DENV-2-Monoinfektionszellen beobachtet. Bei der Superinfektionsbehandlung waren die DENV-2-RNA-Kopien in den Zellen erhöht, im Überstand jedoch verringert. Daher haben wir den Prozentsatz der viruspositiven Zellen durch IFA weiter bestimmt, und die DENV-2 E2-Hüllglycoprotein-positiven Zellen waren bei 96 hpi bzw. 120 hpi relativ um etwa 38 % bzw. 63 % zurückgegangen. Die Mechanismen dieses Phänomens sind weiterhin unbekannt. Wir können nicht ausschließen, dass DENV-2-E2-Hüll-Glykoprotein-negative Zellen nicht infiziert waren, da sie möglicherweise nur virales Genommaterial enthielten. Die Ergebnisse deuteten jedoch darauf hin, dass eine AaeDV-Infektion die DENV-2-Replikation in Zellen möglicherweise nicht wesentlich beeinflusst hat, sondern eher die Translation von DENV-2, was zu einer Verringerung der DENV-Kopien im Überstand und des Prozentsatzes der DENV-2-E2-Hüllglycoprotein-positiven Zellen führt. Unter Berücksichtigung von In-vivo-Studien, die die natürlichen MBV-Übertragungseinstellungen genau nachbilden, haben wir den Einfluss einer AaeDV-Infektion auf die Vektorkompetenz von Ae weiter bestimmt. Albopictus-Erwachsene für DENV-2. Die SIE wurde offensichtlich in vivo beobachtet und die Infektionsrate der Speicheldrüsen war bei superinfizierten Mücken signifikant verringert. Allerdings spiegelt die Infektionsrate der Speicheldrüsen nicht unbedingt die Veränderungen bei der Übertragung wider, da das Virus in den Speicheldrüsen nicht direkt mit dem im Speichel korreliert [53]. Darüber hinaus deutete die Verringerung der Kopienzahl des SIG- und DENV-2-Genoms in Eierstöcken und Speicheldrüsen auf eine beeinträchtigte Anfälligkeit und Vektorkompetenz für DENV-2 bei Ae hin. albopictus. Weitere Beweise sind erforderlich, um festzustellen, ob diese Verringerung der DENV-2-Replikation bei Mücken zu einer Verringerung der Übertragung führt.

Unsere Ergebnisse liefern Hinweise darauf, dass die heterologe MDV-Interferenz die Mückenvektorkompetenz für DENV beeinflusst. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um festzustellen, ob die Verringerung der DENV-2-Replikation und die positive Rate in den Speicheldrüsen letztendlich zu einer verringerten DENV-2-Übertragung führen. Darüber hinaus ist es von entscheidender Bedeutung, den zugrunde liegenden Mechanismus zu klären und die konsistenten und widersprüchlichen Beobachtungen verschiedener Forschungsteams in Einklang zu bringen [54,55,56,57], die die große Vielfalt an Zelllinien, Mückenarten, geografischen Stämmen und genetischen Hintergründen widerspiegeln können , Virusstämme und experimentelle Methoden. Letztendlich belegen diese Daten die komplexen Wechselwirkungen, die auftreten, wenn MDV und DENV denselben Vektorwirt teilen, verbessern vorgeschlagene Strategien für die Entwicklung von MDVs als Biokontrollmittel gegen MBVs und weisen auf ein potenzielles neues Instrument zur Bekämpfung von durch Mücken übertragenen Krankheiten hin.

Obwohl die vorliegende Studie Hinweise darauf liefert, dass eine AaeDV-Infektion die Anfälligkeit von Mückenvektoren gegenüber DENV-2 sowohl in vitro als auch in vivo beeinflussen kann. Es ist jedoch wichtig anzuerkennen, dass die erzielten Ergebnisse durch die jeweilige Mückenpopulation und das in den Experimenten verwendete Virusisolat eingeschränkt sein können.

MDV ist in natürlichen Mückenpopulationen weit verbreitet und die Replikation von DENV-2 ist in MDV-infizierten Ae unterdrückt. Albopictus, wodurch die Anfälligkeit des Vektors für DENV-2 verringert wird. Unsere Studie stützt die Hypothese, dass MDV zur Verringerung der Übertragung von DENV beitragen kann und bietet eine alternative Strategie zur Bekämpfung von durch Mücken übertragenen Krankheiten.

Die in dieser Studie verwendeten Daten stehen bei Bedarf zur Verfügung; Bitte wenden Sie sich an den Erstautor (LK) oder den korrespondierenden Autor (JBG).

Dengue-Virus

Moskito-Densovirus

Aedes aegypti Densovirus

Mittlere Infektionsdosis der Gewebekultur

Über dem Meeresspiegel

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

Indirekter Immunfluoreszenztest

Fetales Kälberserum

Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion

Quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion

Ribonukleinsäure

Komplementäre Desoxyribonukleinsäure

Nichtstrukturelles Protein 1

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Die Autoren danken den Kollegen der Southern Medical University für ihre Ratschläge, Experimente und wertvolle Unterstützung.

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (81871688) an JB.G., dem National Key Research and Development Program of China (2020YFC1200100) und XG.C., der National Natural Science Foundation of China (82002167) unterstützt ) an PW.L.

Schlüssellabor der Provinz Guangdong für Tropenkrankheitsforschung, Abteilung für Pathogenbiologie, School of Public Health, Southern Medical University, Guangzhou, 510515, Guangdong, China

Ling Kong, Jie Xiao, Lu Yang, Peiwen Liu, Xiao-Guang Chen und Jinbao Gu

Brown School, Washington University, St. Louis, MO, 63130, USA

Yuan Sui

Nationales Institut für parasitäre Krankheiten, Chinesisches Zentrum für Krankheitskontrolle und Prävention, Shanghai, 200025, China

Duoquan Wang

Shenzhen Aiming Pest Control Operation Service Company Limited, Shenzhen, Guangdong, China

Shaoqiang Chen

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Alle Autoren haben wesentlich zu dieser Studie beigetragen. JG, XC, PL, LK, JX, DW und SC konzipierten die Studie und koordinierten ihre Umsetzung. LK und JX führten die Experimente durch. PL analysierte die Daten. JG, PL, LK und LY haben das Manuskript verfasst. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Peiwen Liu, Xiao-Guang Chen oder Jinbao Gu.

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

: Tabelle S1. Illumina-Sequenzierungsdatensätze von im Feld gefangenen Mücken, die für die Prävalenzanalyse des Mücken-Densovirus verwendet werden.

: Tabelle S2. Zugangsnummer der Mücken-Densovirus-Referenz.

: Tabelle S3. In der Studie verwendete Primer.

: Abbildung S1. Mücken-Densovirus-Infektion in natürlichen Mückenpopulationen. Die positiven Leseraten von Mücken-Densovirus-Metagenomdaten von Feldmücken aus fünf Verwaltungsbezirken auf Provinzebene. NX, Autonome Region Ningxia der Hui; SX, Provinz Shanxi; GS, Provinz Gansu; YN, Provinz Yunnan; GD, Provinz Guangdong. MDV-Positivrate in natürlichen Mückenpopulationen in Guangzhou. Die Region Guangzhou ist auf der Chinakarte hellgelb markiert. Der vergrößerte Ausschnitt zeigt eine Vergrößerung des Gebiets von Guangzhou und verschiedene Farben kennzeichnen die verschiedenen Bezirke in Guangzhou. Die Punkte zeigen die Standorte der Mückensammelstellen an. Die Kreisdiagramme in der Abbildung zeigen die MDV-Positivrate in natürlichen Mückenpopulationen an jeder Sammelstelle. Die Basisebene dieser modifizierten Karte stammt vom National Earth System Science Data Center, National Science & Technology Infrastructure of China.

: Abbildung S2. Nachweis von MDV-positiven Raten in natürlichen Mückenpopulationen in Guangzhou.

: Abbildung S3. AaeDV-DNA-Kopien im Mitteldarm, in den Eierstöcken und in der Speicheldrüse von AaeDV-infiziertem Aedes albopictus an verschiedenen Tagen nach der Infektion.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kong, L., Xiao, J., Yang, L. et al. Das Mosquito-Densovirus reduziert die Vektoranfälligkeit gegenüber dem Dengue-Virus Serotyp 2 bei Aedes albopictus-Mücken (Diptera: Culicidae) erheblich. Infect Dis Poverty 12, 48 (2023). https://doi.org/10.1186/s40249-023-01099-8

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Eingegangen: 11. November 2022

Angenommen: 28. April 2023

Veröffentlicht: 09. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s40249-023-01099-8

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