MicroRNA

Parasites & Vectors Band 16, Artikelnummer: 184 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Schistosomiasis ist eine schwere, aber vernachlässigte parasitäre Erkrankung des Menschen, die zu Leberfibrose und zum Tod führen kann. Aktivierte hepatische Sternzellen (HSCs) sind die Haupteffektoren, die die Akkumulation von Proteinen der extrazellulären Matrix (ECM) während der Leberfibrose fördern. Eine fehlerhafte microRNA-29-Expression ist an der Entstehung fibrotischer Erkrankungen beteiligt. Über die Rolle von miR-29 bei der durch Schistosoma japonicum (S. japonicum) induzierten Leberfibrose ist jedoch weniger bekannt.

Die Konzentrationen von microRNA-29a-3p (miR-29a-3p) und Roundabout-Homolog 1 (Robo1) wurden in Lebergeweben während einer S. japonicum-Infektion untersucht. Die mögliche Beteiligung des miR-29a-3p-Robo1-Signalwegs wurde ermittelt. Wir verwendeten MIR29A-bedingte Knock-in-Mäuse und Mäuse, denen ein miR-29a-3p-Agomir injiziert wurde, um die Rolle von miR-29a-3p bei Bilharziose-induzierter Leberfibrose zu untersuchen. Die funktionellen Beiträge der miR-29a-3p-Robo1-Signalübertragung bei Leberfibrose und HSC-Aktivierung wurden unter Verwendung primärer Maus-HSCs und der menschlichen HSC-Zelllinie LX-2 untersucht.

MiR-29a-3p war bei Menschen und Mäusen mit Schistosomen-induzierter Fibrose herunterreguliert, und Robo1 war in Lebergeweben hochreguliert. Der miR-29a-3p zielte auf Robo1 und regulierte dessen Expression negativ. Darüber hinaus korrelierte das Expressionsniveau von miR-29a-3p bei Schistosomiasis-Patienten stark mit dem Durchmesser der Pfortader und der Milzdicke, die den Schweregrad der Fibrose darstellen. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass eine effiziente und anhaltende Erhöhung von miR-29a-3p die durch Schistosomen verursachte Leberfibrose umkehrte. Insbesondere haben wir gezeigt, dass miR-29a-3p auf Robo1 in HSCs abzielt, um die Aktivierung von HSCs während der Infektion zu verhindern.

Unsere Ergebnisse liefern experimentelle und klinische Beweise dafür, dass der miR-29a-3p-Robo1-Signalweg in HSCs eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Leberfibrose spielt. Daher unterstreicht unsere Studie das Potenzial von miR-29a-3p als therapeutische Intervention bei Bilharziose und anderen fibrotischen Erkrankungen.

Schistosomiasis ist eine der häufigsten, aber vernachlässigten tropischen Infektionskrankheiten und betrifft mehr als 230 Millionen Menschen in 78 Ländern, darunter Kinder und junge Erwachsene [1]. Die beiden wichtigsten Arten, die beim Menschen Lebererkrankungen verursachen, sind Schistosoma mansoni und Schistosoma japonicum (S. japonicum) [2]. Die primäre Pathologie der S. japonicum-induzierten Schistosomiasis ist die eiinduzierte Granulombildung und Fibrose. Weibliche erwachsene Würmer, die in den Mesenterialvenen des Wirts leben, legen zahlreiche Eier, von denen die meisten über das Pfortadersystem im Lebergewebe eingeschlossen werden und eine granulomatöse Reaktion und Fibrose verursachen [3]. Leberfibrose und die daraus resultierende portale Hypertonie sind die Haupttodesursachen im Zusammenhang mit dieser chronischen Erkrankung [4]. Die Aufklärung der Mechanismen, die zur Leberfibrose führen, könnte zu wirksameren Interventionsstrategien für Schistosomiasis und eine Vielzahl fibrotischer Erkrankungen führen.

Hepatische Sternzellen (HSCs) sind die Haupteffektoren verschiedener Arten von Leberfibrose [5], einschließlich der durch eine Schistosomeninfektion verursachten Leberfibrose [6]. Ruhende HSCs sind residente perisinusoidale Zellen, die sich im subendothelialen Raum zwischen Hepatozyten und sinusoidalen Endothelzellen befinden. Diese Zellen sind durch das Vorhandensein von zytoplasmatischen Vitamin-A-Tröpfchen gekennzeichnet [7]. Bei der Aktivierung verwandeln sich HSCs allmählich in proliferative, kontraktile und fibrogene Myofibroblasten [8]. Eine Leberschädigung stimuliert eine Vielzahl von Zytokinen und Wachstumsfaktoren, die HSCs aktivieren, um α-Smooth Muscle Actin (α-SMA) zu produzieren und überschüssige extrazelluläre Matrix (ECM) abzusondern, was zu Leberfibrose führt [9, 10]. Es wurde gezeigt, dass eine Schistosomeninfektion HSCs aktiviert, die in der Peripherie von eiinduzierten Granulomen verteilt sind [11]. Frühere Studien legten nahe, dass der transformierende Wachstumsfaktor β1 (TGF-β1) das Effektorzytokin der Schistosomen-induzierten Leberfibrose war und nach wie vor das klassische fibrogene Zytokin ist, das die Aktivierung von HSCs vorantreibt [12, 13, 14]. Die Blockierung der Aktivierung von HSCs ist zu einer der wichtigsten Strategien für therapeutische Interventionen bei Leberfibrose geworden [15].

MicroRNAs (miRNAs) sind endogene, kleine nichtkodierende RNAs, die die Genexpression durch Basenpaarung mit der 3′-untranslatierten Region ihrer Ziel-Messenger-RNA (mRNA) negativ regulieren [16, 17]. Zunehmende Beweise haben gezeigt, dass miRNAs eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase unter normalen und erkrankten Bedingungen spielen [18]. Die Fehlregulation der miRNA-Expression ist an der Fibrose in mehreren Organsystemen beteiligt, einschließlich des Gefäßsystems (Lungenfibrose), der Leber und der Niere [19,20,21,22]. Mehrere Studien zeigten, dass miRNAs eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der Leberfibrose spielen und nützliche therapeutische Ziele sein könnten [23, 24]. Unsere früheren Ergebnisse deuteten darauf hin, dass eine erhöhte Expression von miR-182 die HSC-Aktivierung durch gezieltes Angreifen von FOXO1 förderte, was zur Induktion von Leberfibrose führte [25]. Die miR-29-Familie besteht aus miR-29a, miR-29b und miR-29c, die in fibrotischen Lebern signifikant verringert waren, wie bei menschlicher Leberfibrose und zwei verschiedenen Modellen von Leberschäden durch Gallengangsligatur (BDL) gezeigt wurde Tetrachlorkohlenstoff (CCl4) [22, 26, 27]. Es gibt jedoch keine experimentellen Beweise dafür, dass miR-29a am Auftreten oder Fortschreiten einer durch eine Schistosomeninfektion verursachten Leberfibrose beteiligt ist.

Roundabout-Homolog 1 (Robo1) ist ein Mitglied der Molekülfamilie der neuronalen Zelladhäsionsrezeptoren und wird in verschiedenen Zelltypen exprimiert [28, 29]. Robo1 ist ein entscheidender Regulator in mehreren biologischen Prozessen, einschließlich Zellproliferation, -differenzierung und -migration (30, 31). Robo1 steht im Zusammenhang mit verschiedenen Krebsarten [32, 33] und chronischen Erkrankungen, darunter Nierenerkrankungen [34] und Leberfibrose [35]. Unsere früheren Ergebnisse zeigten, dass microRNA-29a-3p (miR-29a-3p) die Expression von Robo1 herunterregulierte, um die Proliferation, Migration, Invasion, Tumorprogression und Metastasierung hepatozellulärer Karzinomzellen zu hemmen [36]. Angesichts dieser Ergebnisse stellten wir die Hypothese auf, dass miR-29a-3p und Robo1 entscheidend an der durch Schistosomiasis verursachten Leberfibrose beteiligt sind. In der vorliegenden Studie wurde S. japonicum bei Menschen und Mäusen verwendet, um die Rolle von miR-29a-3p und Robo1 zu untersuchen. Wir verwendeten MIR29A-bedingte Knock-in-Mäuse und Mäuse, denen ein miR-29a-3p-Agomir injiziert wurde, um unsere Hypothese zu untersuchen und die molekularen Pathogenesewege von miR-29a-3p und Robo1 bei den fibrotischen Veränderungen der Lebern von Menschen und Mäusen bei Exposition gegenüber Schistosomen aufzuklären Infektion.

Leberbiopsien wurden zwischen September 2015 und August 2019 im Tongji-Krankenhaus des Tongji Medical College der Huazhong University of Science and Technology entnommen. Keilbiopsien aus normalen Teilen der Leber wurden von sieben Patienten ohne metastasiertes Leberkarzinom (drei Kolonkarzinome und) entnommen 4 Magenkarzinome) als Kontrollen. Von neun Patienten mit chronischer Schistosomiasis wurden fibrotische Leberproben entnommen. Der Krankheitszustand des Gewebes wurde durch histopathologische Diagnose bestätigt. Ausschlusskriterien für die Studie waren Patienten mit anderen Arten von Hepatitis und Lebererkrankungen im Zusammenhang mit Drogen- oder Alkoholkonsum. Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die n-Werte auf die Anzahl der Patienten, von denen Gewebe gewonnen wurde. Aufgrund der begrenzten Anzahl an Gewebeproben wurden nicht alle Proben in jedes Studienprotokoll einbezogen. Die demografischen Merkmale der eingeschlossenen Patienten sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Die Erzeugung der humanen bedingten Knock-in-Mauslinie MIR29A durch CRISPR/Cas9 wurde an Cyagen Biosciences (Suzhou, China) ausgelagert. Die Mäuse wurden auf dem genetischen Hintergrund C57BL/6J geschaffen. Die gRNA (5′-GAACACTAGTGCACTTATCCTGG-3′) zum Hipp11 (H11)-Locus, der Donorvektor, der die Kassette „CAG-loxP-Stop-loxP-human MIR29A-polyA“ enthält, und Cas9-mRNA wurden in befruchtete Mäuse gemeinsam injiziert Eier, um gezielt bedingte Knock-in-Nachkommen zu erzeugen. Eine schematische Darstellung der Targeting-Strategie finden Sie in der Zusatzdatei 1: Abb. S1.

In dieser Studie wurden sechs Wochen alte weibliche Mäuse verwendet. Wildtyp (WT) C57BL/6J-Mäuse wurden von Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Peking, China) erhalten. Menschliche MIR29A-Mäuse mit bedingtem Knock-in wurden von Cyagen konstruiert. Alle Tiere wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten, wobei standardmäßiges Laborfutter und Wasser nach Belieben zur Verfügung standen. Um eine Infektion auszulösen, wurden sieben 6 Wochen alte weibliche MIR29A-Mäuse und sieben gleichaltrige weibliche WT-C57BL/6J-Mäuse perkutan 16 ± 1 S. japonicum cercariae (Stamm vom chinesischen Festland) ausgesetzt, der aus infizierten Oncomelania hupensis-Schnecken stammt, die vom Nanjing Institute gekauft wurden für Bilharziose-Prävention und -Kontrolle (Nanjing, China). Als Kontrollen dienten sieben nicht infizierte Mäuse gleichen Alters und Geschlechts.

Um festzustellen, ob miR-29a-3p ausreichte, um die durch Eier verursachte Leberfibrose umzukehren, wurde ein miR-29a-3p-Agomir (RiboBio, Guangzhou, China) verwendet. Das miR-29a-3p-Agomir und das Negativkontroll-Agomir (NC) wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers in Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) gelöst und in PBS auf eine endgültige Badkonzentration von 10 nmol/500 μl verdünnt. Die infizierten Mäuse wurden an zwei aufeinanderfolgenden Tagen oral mit 300 mg/kg Praziquantel behandelt, um die Parasiten 6 Wochen nach der Infektion abzutöten, und die Mäuse erhielten miR-29a-3p-Agomir oder NC-Agomir in einer Dosis von 10 nmol pro Maus oder 500 μl PBS über die Schwanzvene alle 4 Tage für 28 Tage. Die Mäuse wurden 10 Wochen nach der Infektion zur weiteren Analyse geerntet.

Um die Eibelastung abzuschätzen, wurden 0,2 g jeder Leber über Nacht mit 20 ml 4 %iger Kaliumhydroxidlösung verdaut und die Anzahl der Eier unter einem Mikroskop gezählt. Die Gesamtzahl der Eier pro Gramm in der Leber wurde mit der folgenden Formel berechnet: Anzahl der berechneten Eier × 5. Der Leber- oder Milzindex wurde mit der folgenden Formel berechnet: (Gesamtgewicht der Leber oder Milz der Maus/Gesamtgewicht des Mäusekörpers) × 100 % [12, 37, 38]. Die Größe der Eigranulome wurde in Mayers H&E-Schnitten mit einem kalibrierten Messokular gemessen und das Ausmaß der Fibrose wurde durch Massons Trichrom-Färbung der Schnitte bewertet, wie zuvor beschrieben [12]. Der Gesamtfibrose-Score wurde durch Multiplikation der Dichte und Fläche jedes Granuloms ermittelt (für einen maximalen Score von 16). Der Hydroxyprolingehalt in der Leber wurde mit einem kolorimetrischen Assay-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) nachgewiesen.

Ungefähr 1 ml Blut wurde Mäusen durch Augapfelexstirpation entnommen. Das Blut wurde 4 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, um eine Gerinnselbildung zu ermöglichen, und dann zentrifugiert (3500 U/min, 10 Minuten), um das Serum vom Gerinnsel zu trennen. Die Serumspiegel von Alaninaminotransferase (ALT) und Aspartataminotransferase (AST) wurden mit einem automatischen Analysegerät Siemens Advia 1650 gemessen.

Die Leber wurde zunächst in situ mit 0,05 % Kollagenase Typ IV bei 37 °C unter Badschütteln für 30 Minuten verdaut. Hepatozyten wurden durch 3-minütige Zentrifugation der resultierenden Zellsuspension bei 50 × g isoliert und durch 2-minütige Zentrifugation bei 50 × g gereinigt. Nachdem die Hepatozyten pelletiert waren, wurde der Überstand, der nichtparenchymale Zellen enthielt, 8 Minuten lang bei 450 × g zentrifugiert. HSCs wurden aus nichtparenchymalen Zellen unter Verwendung eines Iodixanol-Gradienten mit 15 % (Gew./Vol.) und 11,5 % (Gew./Vol.) (OptiPrep; Stemcell Technologies, Vancouver, British Columbia, Kanada) bei 1450 × g für 20 Minuten isoliert. Um HSCs weiter zu reinigen, haben wir HSCs von Kupffer-Zellen (KCs) mithilfe eines Biotin-konjugierten Anti-CD271-Antikörpers (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland) und Anti-Biotin-MicroBeads (Miltenyi Biotec) abgereichert. Die Reinheit betrug > 97 % und die Lebensfähigkeit > 95 %. Repräsentative Ergebnisse für die Reinigung von HSCs sind in der Zusatzdatei 2: Abb. S2 dargestellt.

LX-2 ist eine gut charakterisierte Zelllinie, die von menschlichen HSCs abgeleitet ist. Diese Zellen wurden vom Cell Collection Center der Universität Wuhan (China) erworben. Primäre HSCs und LX-2-Zellen wurden in Kunststoffplatten ausgesät und in DMEM (Gibco, Gaithersburg, MD, USA) kultiviert, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS; Gibco, Gaithersburg, MD, USA) und 100 μg/ml Penicillin/ Streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Die Zellkulturen wurden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 gehalten.

LX-2-Zellen (2,5 × 105 Zellen/Vertiefung) wurden in Platten mit sechs Vertiefungen mit oder ohne Anwesenheit von rekombinantem TGF-β1 (PeproTech) ausplattiert. Um die Wirkung von miR-29a-3p in vitro zu bestimmen, wurden LX-2-Zellen mit exogenem hsa-miR-29a-3p (miRBase: MIMAT0000086) transfiziert. Die Zellen wurden mit 50 nM miR-29a-3p-Mimetika, 100 nM miR-29a-3p-Inhibitoren oder deren Negativkontrollen unter Verwendung eines riboFECT™ CP-Transfektionskits (RiboBio, Guangzhou, China) wie zuvor beschrieben transfiziert (39). Kurz gesagt, 10 × riboFECT™ CP-Puffer wurde auf 1 × verdünnt. Das Transfektionssystem war die Mischung aus 1 × riboFECT™ CP-Puffer, riboFECT™ CP-Reagenz und Mimetikum (50 nM) oder Inhibitoren (100 nM), und die Mischung wurde in LX-2-Zellen transfiziert; 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen jeder Versuchsgruppe erneut suspendiert, gesammelt und nachfolgenden Experimenten unterzogen.

Leberproben von Menschen und Mäusen wurden 24 Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet und in 4 µm dicke Schnitte geschnitten. Für die Immunhistochemie wurden mit Meerrettichperoxidase (HRP) konjugierte Sekundärantikörper (PeproTech Inc., USA) zur Immunfärbung mit den folgenden Primärantikörpern verwendet: polyklonaler Kaninchen-Anti-Robo1 (1:50, ab7279, Abcam, Cambridge, MA, USA), polyklonales Kaninchen-Anti-Kollagen I (1:100, 14695-1-AP, ProteinTech, Chicago, IL, USA) und monoklonales Kaninchen-Anti-α-SMA (1:500, ab108424, Abcam). Zur Immunfluoreszenzfärbung wurden Gewebeschnitte mit Primärantikörpern gegen Robo1 (1:50, ab7279, Abcam), α-SMA (1:200, BM0002, Boster Biological Technology, Wuhan, China) und Desmin (1:100, ab227651) inkubiert , Abcam), gefolgt von der Inkubation mit Alexa Fluor 594- und Alexa Fluor 488-konjugierten Sekundärantikörpern (1:200, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Alle Schnitte wurden mit 1 μg/ml 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI; Sigma-Aldrich) gefärbt, um Zellkerne sichtbar zu machen. In jeder Gruppe wurden mindestens drei Leberschnitte eingeschlossen. Die gefärbten Schnitte wurden unter einem Mikroskop (Nikon Eclipse Ci) betrachtet und die Bilder wurden mit einer hochauflösenden Digitalkamera (Nikon Digital Sight DS-FI2) aufgenommen.

Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von TRIzol-Reagenz (Invitrogen) gemäß dem Protokoll des Herstellers isoliert. Die quantitative Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (qPCR) wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (40). Die Expressionsniveaus von Robo1, Col1α1, Col3α1, α-SMA und TGF-β1 wurden mit dem SYBR Green Master Mix Kit (Takara, Kusatsu, Japan) bestimmt. Das Expressionsniveau von miR-29a-3p wurde mit einem Bulge-Loop miRNA qRT-PCR Starter Kit (RiboBio, Guangzhou, China) gemäß dem Protokoll des Herstellers bestimmt. Sequenzspezifische Primer für U6 und miR-29a-3p wurden von RiboBio (Guangzhou, China) synthetisiert. Die endogenen Kontrollen in dieser Studie waren U6-snRNA und GAPDH, und die 2−ΔΔCt-Methode wurde verwendet, um die Faltungsänderung in der Expression aller mRNAs und miR-29a-3p zu berechnen. Die Primersequenzen von Mensch und Maus sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Das gesamte Zellprotein wurde auf Eis mit RIPA-Lysepuffer (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) in Gegenwart von frisch zugesetzten Proteaseinhibitoren (Boster Biological Technology, Wuhan, China) extrahiert und durch BCA-Assay (Pierce, Cramlington, UK) quantifiziert. Insgesamt 30 μg/Spur-Proteinextrakt wurden über 10 % PAGE (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) abgetrennt, gefolgt von der Übertragung auf eine PVDF-Membran (Millipore Corp., Billerica, MA, USA). Die unspezifische Bindung wurde mit 5 % fettfreier Milch in TBST blockiert. Die Membran wurde mit Kaninchen-Anti-Robo1 (1:1000, ab7279, Abcam, Cambridge, MA) über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Membranen wurden weiter mit HRP-konjugierten Anti-Kaninchen-Sekundärantikörpern inkubiert und mittels verstärkter Chemilumineszenz (ECL; Abbkine, Redlands, CA, USA) nachgewiesen. Als interner Standard wurde Kaninchen-Anti-GAPDH (1:2000, 10494-1-AP, ProteinTech, Chicago, USA) verwendet. Die Densitometrie wurde mit der ImageJ-Software durchgeführt.

Die experimentellen Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt. Die statistische Signifikanz zwischen Versuchsgruppen wurde mithilfe des zweiseitigen Student-t-Tests und einer einfaktoriellen ANOVA mit Tukey-Korrektur bewertet. Die klinischen Ergebnisse der Patienten werden als Medianwert und Interquartilbereich ausgedrückt. Aufgrund der verzerrten Verteilung der meisten Patientenvariablen wurden der Mann-Whitney-U-Test und der Kruskal-Wallis-Posttest mit Mehrfachvergleichen nach Dunn angewendet. Für kategoriale Daten wurde der χ2-Test oder der exakte Fisher-Test durchgeführt, um Unterschiede zwischen Gruppen zu bestimmen. Für Korrelationen wurde der Rangtest nach Spearman verwendet. Alle statistischen Analysen wurden mit GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) oder SPSS 25.0 (SPSS, Chicago, IL) durchgeführt. P-Werte < 0,05 wurden als signifikant angesehen.

Um die Expression von miR-29a-3p und Robo1 in Leberproben zu untersuchen, wurde eine Leberbiopsie bei Patienten mit chronischer Schistosomiasis und bei Kontrollpatienten durchgeführt. Das fibrotische Lebergewebe hatte größere fibrotische Bereiche und mehr Kollagenablagerungen, und in den Leberprobenabschnitten von Patienten mit Schistosomiasis wurden S. japonicum-Eier beobachtet (Abb. 1A). Der miR-29a-3p-Spiegel in der fibrotischen Gruppe war deutlich niedriger als in der Kontrollgruppe, und der Robo1-mRNA-Spiegel war erhöht (Abb. 1B, C). Immunblots wurden analysiert und der Grad der Robo1-Transkription bestätigt (Abb. 1D, E). Um die funktionellen Auswirkungen von Robo1 weiter zu bewerten, haben wir Robo1 in Lebergeweben mittels Immunhistochemie analysiert. Die fibrotischen Gewebe zeigten eine stärkere Robo1-Färbung als die Kontrolllebergewebe, und die Robo1-positiven Zellen waren hauptsächlich in Bereichen mit Entzündung und Fibrose lokalisiert (Abb. 1F). Mittels Immunfluoreszenzfärbung wurde die Expression von Robo1 und das Vorhandensein von HSCs nachgewiesen, die die Haupteffektorzellen bei verschiedenen Arten von Leberfibrose sind und eine wichtige Rolle bei der Verknüpfung von Leberentzündungen mit der Fibrogenese spielen. Die Kolokalisation von Robo1 und HSCs wurde insbesondere in der Leber von Patienten mit Schistosomiasis beobachtet (Abb. 1F). Darüber hinaus fanden wir bei Patienten mit Schistosomiasis signifikante Korrelationen zwischen den Spiegeln von miR-29a-3p und Robo1 sowie dem Durchmesser der Pfortader und der Milzdicke (Abb. 1G – J). Diese Daten legen nahe, dass miR-29a-3p und Robo1 am Fortschreiten der Schistosomen-induzierten Leberfibrose beteiligt sein könnten.

Verminderte miR-29a-3p-Expression und erhöhte Robo1-Expression im Lebergewebe von Patienten mit Schistosomiasis. In Paraffin eingebettete Schnitte von Lebergewebe von Patienten wurden mit H&E, Masson-Trichrom und Sirius-Rot gefärbt. Maßstabsbalken, 200 μm. B, C Gesamt-RNA wurde für die qPCR-Analyse der Expressionsniveaus von miR-29a-3p und Robo1 extrahiert. Kontrolle (n = 7), Fibrose (n = 9). D, E Die Expression von Robo1 wurde durch Western Blot bestimmt. Die Bilddichte wurde mit ImageJ quantifiziert und auf GAPDH normalisiert. F Es wurde eine repräsentative immunhistochemische Färbung von Robo1 und eine Immunfluoreszenzfärbung von Robo1 (grün) durch Kolokalisation mit α-SMA (rot) in Leberschnitten nachgewiesen. Gelbe Pfeile kennzeichnen positive Zellen. Maßstabsbalken, 50 μm. G–J Korrelationen zwischen den mRNA-Spiegeln von miR-29a-3p und Robo1 und dem Pfortaderdurchmesser und der Milzdicke bei Patienten mit Schistosomiasis (n = 9). I Der größere Punkt zeigt Daten von zwei Patienten. Die Daten werden als Median und Interquartilbereich (B, C und E) dargestellt. Alle Daten sind repräsentativ für mindestens zwei unabhängige Experimente. Die Signifikanz wurde mithilfe des Mann-Whitney-U-Tests (B, C und E) oder des Spearman-Rangtests (G–J) berechnet. *P < 0,05, ***P < 0,001. miR-29a-3p: microRNA-29a-3p; Robo1: Kreisverkehr-Homolog 1

Es wurden Leberproben von Mäusen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion mit S. japonicum gesammelt. Robo1 ist ein potenzielles Ziel von miR-29a-3p, wie von der TargetScan-Datenbank (www.targetscan.org) vorhergesagt. Um die Beziehung zwischen miR-29a-3p und Robo1 zu analysieren, haben wir deren Expression während des Fortschreitens der hepatischen Schistosomiasis bewertet. Wir fanden heraus, dass die Expression von miR-29a-3p in der Leber 6 Wochen nach der Infektion abzunehmen begann und ihren niedrigsten Wert in den Wochen 8 und 12 erreichte (Abb. 2A). Im Gegensatz dazu war das Expressionsniveau von Robo1 8 Wochen nach der Infektion signifikant erhöht (Abb. 2B – D). Darüber hinaus wurde eine Herunterregulierung von miR-29a-3p hauptsächlich in isolierten Hepatozyten und HSCs infizierter Mäuse beobachtet (Abb. 2E). Wir analysierten auch die relative Expression von miR-29a-3p in verschiedenen Leberzelltypen mittels qPCR und stellten fest, dass miR-29a-3p hauptsächlich in isolierten primären HSCs und nicht in Hepatozyten oder KCs nicht infizierter Lebern vorhanden war. Das miR-29a-3p-Expressionsniveau war in HSCs aus infizierten Lebern im Vergleich zu Hepatozyten und KCs signifikant herunterreguliert (Abb. 2F). Wir führten auch eine immunchemische Färbung für Robo1 durch und stellten fest, dass sich Robo1-produzierende Zellen hauptsächlich in der Peripherie von Eigranulomen befanden (Abb. 2G). Die Doppelfärbung durch Immunfluoreszenz ergab die Kolokalisation von Robo1 und α-SMA (Abb. 2G), was darauf hinweist, dass aktivierte HSCs Robo1 in vivo exprimierten. Die Expression von miR-29-3p in HSCs begann 6 Wochen nach der Infektion abzunehmen, aber der Spiegel der Robo1-mRNA war zu diesem Zeitpunkt erhöht (Abb. 2H, I). Darüber hinaus wurde durch Spearmans Korrelationsanalyse eine negative Korrelation zwischen miR-29a-3p und Robo1-Expression beobachtet (R = – 0,8301, P <0,0001; Abb. 2J). Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass die aktivierten HSCs in infizierten Lebern eine Quelle von Robo1 sind und Robo1 ein potenzielles Ziel von miR-29a-3p in HSCs ist.

Analyse der miR-29a-3p- und Robo1-Expression bei muriner Bilharziose. A, B Die Expression von miR-29a-3p und Robo1 in Leberproben während der Infektion wurde durch qPCR nachgewiesen (n = 4–5). C, D Robo1-Protein wurde durch Western Blot bestimmt, mit ImageJ quantifiziert und auf GAPDH normalisiert (n = 6). E, F Primäre Hepatozyten (Heps), Kupffer-Zellen (KCs) und hepatische Sternzellen (HSCs) wurden aus nicht infizierten und infizierten (8 Wochen nach der Infektion) Lebern isoliert und der Spiegel von miR-29-3p wurde durch qPCR bestimmt (n = 3). G Es wurden eine repräsentative immunhistochemische Färbung von Robo1 und eine Immunfluoreszenzfärbung von Robo1 (grün) durch Kolokalisation mit α-SMA (rot) in Leberschnitten festgestellt. Gelbe Pfeile kennzeichnen positive Zellen. Maßstabsbalken, 50 μm. H, I Primäre HSCs wurden aus Lebergewebe isoliert und die Expression von miR-29a-3p und Robo1 in HSCs wurde durch qPCR nachgewiesen (n = 4). J Korrelationen zwischen den mRNA-Spiegeln von Robo1 und miR-29a-3p in den HSCs von Mäusen (n = 20). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung aus zwei unabhängigen Experimenten dargestellt. Die Signifikanz wurde durch den zweiseitigen Student-t-Test (A, B, D, E, H und I) oder eine einfaktorielle ANOVA mit Tukey-Korrektur für Vergleiche zwischen zwei Gruppen (F) oder Spearmans Rangtest (J) bestimmt. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001, verglichen mit 0W-Proben (A, B, D, H und I). miR-29a-3p: microRNA-29a-3p; Robo1: Kreisverkehr-Homolog 1; Heps: Hepatozyten; KCs: Kupffer-Zellen; HSCs: hepatische Sternzellen; ns: nicht signifikant

Unsere vorherige Studie verwendete einen Dual-Luciferase-Reportergen-Assay, um zu zeigen, dass Robo1 ein direktes Ziel von miR-29a-3p war [36]. Die vorliegende Studie zeigte, dass die Stimulation von LX-2-Zellen mit TGF-β1, einem typischen profibrotischen Gen beim Fortschreiten der Leberfibrose, die mRNA-Expression von miR-29a-3p herunterregulierte und den Spiegel der Robo1-mRNA hochregulierte (Abb. 3A). , B). Darüber hinaus haben wir miR-29a-3p-Mimetika oder Inhibitoren in LX-2-Zellen transfiziert und die Spiegel von miR-29a-3p und Robo1 durch qPCR und Western Blot quantifiziert. Wie erwartet war miR-29a-3p in der miR-Mimic-Gruppe erhöht und in der miR-Inhibitor-Gruppe reduziert (Abb. 3C). Sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene verringerte die Erhöhung von miR-29a-3p die Expression von Robo1 deutlich, und die Abreicherung von miR-29a-3p erhöhte die Expression von Robo1 signifikant (Abb. 3D – F). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass Robo1 ein direktes Ziel von miR-29a-3p in HSCs ist.

Validierung der Beziehung zwischen miR-29a-3p und Robo1. A, B LX-2-Zellen wurden 48 Stunden lang 10 ng/ml TGF-β1 ausgesetzt und die Expression von miR-29a-3p und Robo1 wurde durch qPCR nachgewiesen (n = 3). CF-LX-2-Zellen wurden auf einer Kunststoffplatte kultiviert und 48 Stunden lang mit 50 nM miR-29a-3p-Mimetika, 100 nM miR-29a-3p-Inhibitoren oder ihren Negativkontrollen (NC) transfiziert. Die Expression von miR-29a-3p und Robo1 wurde durch qPCR (n = 3) (C, D) und Western Blot (n = 3–4) (E, F) bestimmt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Alle Daten sind repräsentativ für mindestens drei unabhängige Experimente. Die Signifikanz wurde durch den zweiseitigen Student-t-Test (A–D, F) bestimmt. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. miR-29a-3p: microRNA-29a-3p; Robo1: Kreisverkehr-Homolog 1

Um die Auswirkungen der miR-29a-3p-Robo1-Signalübertragung auf die Pathogenese der Leberfibrose zu bewerten, haben wir ein Modell der durch S. japonicum induzierten Leberfibrogenese in menschlichen MIR29A-bedingten Knock-in-Mäusen erstellt. WT-Mäuse wurden der gleichen Behandlung unterzogen wie die Kontrollen. Im Vergleich zu WT-Mäusen zeigten MIR29A-Mäuse einen höheren miR-29a-3p-Spiegel im Herzen (ungefähr 2,0-fach), Leber (ungefähr 1,8-fach), Milz (ungefähr 3,2-fach) und Niere (ungefähr 2,2-fach). ) (Zusatzdatei 3: Abb. S3). Morphologische Veränderungen in Leber- und Milzproben zeigten bei den mit S. japonicum infizierten MIR29A-Mäusen im Vergleich zu den infizierten WT-Mäusen eine moderate granulomatöse Reaktion und Splenomegalie (Abb. 4A). Diese Ergebnisse wurden durch die verringerten Konzentrationen von Alaninaminotransferase (ALT) und Aspartataminotransferase (AST) im Mäuseserum bestätigt und durch die Leber- und Milzindizes weiter bestätigt (Abb. 4B – E). Bemerkenswerterweise zeigten die mit S. japonicum infizierten MIR29A-Mäuse eine signifikante Verringerung der ECM-Ablagerungen, wie durch Hydroxyprolin-Quantifizierung (Abb. 4F), Massons Trichrom-Färbung und Sirius-Rot-Färbung (Abb. 4A, G und H) gezeigt wurde, und eine ausgeprägte Verringerung der Größe von Lebergranulomen, sichtbar durch H&E-Färbung (Abb. 4A, I). Eine Verringerung der Fibrose wurde außerdem durch immunhistochemische Färbung und qPCR-basierte Quantifizierung der Fibrose-assoziierten Genexpression in den Lebern infizierter Mäuse bestätigt. Die immunhistochemische Färbung für Kollagen I und α-SMA sowie die Mengen an Col1α1-, Col3α1-, α-SMA- und TGF-β1-mRNA waren bei den mit S. japonicum infizierten MIR29A-Mäusen im Vergleich zu den infizierten WT-Mäusen deutlich verringert (Abb. 4A, J -M). Es gab jedoch keine signifikante Veränderung der Eilast zwischen den beiden infizierten Gruppen, was darauf hindeutet, dass die Behandlung mit miR-29a keinen Einfluss auf die Reproduktion und das Überleben der Parasiten hatte (Zusatzdatei 4: Abb. S4A).

MIR29A-Mäuse entwickelten während einer Schistosomeninfektion seltener Leberschäden und Fibrose. MIR29A-Mäuse und WT-Mäuse wurden perkutan mit 16 Schistosoma japonicum cercariae infiziert oder blieben nicht infiziert. Leber- und Milzproben wurden 10 Wochen nach der Infektion entnommen. Eine Makroaufnahme von Lebern und Milzen von MIR29A-Mäusen und WT-Mäusen sowohl in der nicht infizierten als auch in der infizierten Gruppe. Maßstabsleiste, 1 cm. H&E-, Masson-Trichrom- und Sirius-Rot-Färbung von Leberschnitten sowie immunhistochemische Färbung für Kollagen I und α-SMA. Maßstabsbalken, 50 μm. B, C Leber- und Milzindizes wurden bestimmt (n = 7). D, E Serum-ALT- und AST-Spiegel wurden gemessen (n = 7). F Kollagengehalt in Lebern, bestimmt als Hydroxyprolingehalt (n = 7). G-Fibrose-Scores, gemessen anhand der Masson-Trichrom-Färbung von Leberschnitten (n = 7). H-Bereiche, die für die Sirius-Rot-Färbung positiv waren, wurden mit der IPP-Software gemessen (n = 7). Die Granulomgröße wurde anhand von H&E-gefärbten Leberschnitten gemessen (n = 7). J–M Die Expression von Col1α1, Col3α1, α-SMA und TGF-β1 in Lebern während der Infektion wurde durch qPCR nachgewiesen (n = 7). Die Daten werden als Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Experimenten dargestellt. Mehrere Vergleiche wurden mittels einfaktorieller ANOVA mit Tukey-Korrektur für Vergleiche zwischen zwei Gruppen (BM) durchgeführt. **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001, verglichen mit infizierten WT-Proben. miR-29a-3p: microRNA-29a-3p; Robo1: Kreisverkehr-Homolog 1; ALT: Alanin-Aminotransferase; AST: Aspartataminotransferase

Als nächstes untersuchten wir den Robo1-Spiegel in diesen Mäusen. Die Robo1-mRNA-Expression war im Lebergewebe von MIR29A-Mäusen signifikant geringer als bei WT-Mäusen in der nicht infizierten und der infizierten Gruppe (Abb. 5A). Das Robo1-Protein war im Lebergewebe von S. japonicum-infizierten MIR29A-Mäusen im Vergleich zu infizierten WT-Mäusen verringert, wie durch Western Blot festgestellt wurde. Obwohl die nicht infizierte MIR29A-Mausgruppe im Vergleich zur nicht infizierten WT-Mausgruppe eine leichte Verringerung der Robo1-Expression aufwies, war der Unterschied statistisch nicht signifikant (Abb. 5B, C). Als nächstes untersuchten wir, ob die Überexpression von miR-29a die Bilharziose-induzierte HSC-Aktivierung verhinderte. Wir isolierten primäre HSCs aus Mäusen und stellten anhand der Immunfluoreszenzfärbung fest, dass HSCs in infizierten Lebergeweben von Mäusen Robo1 in vivo exprimierten. Darüber hinaus war die Fluoreszenzintensität von Robo1 bei den infizierten MIR29A-Mäusen im Vergleich zu den infizierten WT-Mäusen verringert (Abb. 5D). Die Mengen an Col1α1-, Col3α1-, α-SMA- und TGF-β1-mRNA waren in den infizierten HSCs von MIR29A-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen deutlich verringert (Abb. 5E – H). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Überexpression von miR-29a die Expression von Robo1 reduzierte und die durch Schistosomiasis induzierte HSC-Aktivierung verhinderte.

MIR29A-Mäuse konnten die HSC-Aktivierung während einer Schistosomeninfektion besser verhindern. A Das Expressionsniveau von Robo1 in Lebern wurde durch qPCR bestimmt (n = 7). B, C Robo1-Protein wurde durch Western Blot bestimmt, mit ImageJ quantifiziert und auf GAPDH normalisiert (n = 6). D–H Primäre HSCs wurden aus dem Lebergewebe von Mäusen isoliert. D Es wurde eine repräsentative Immunfluoreszenzfärbung der Kolokalisierung von Robo1 (grün) mit α-SMA (rot) in primären HSCs nachgewiesen. Einschübe zeigen eine stärkere Vergrößerung des umrissenen Bereichs. Maßstabsbalken, 50 μm. E–H Die Expression von Col1α1, Col3α1, α-SMA und TGF-β1 in primären HSCs während der Infektion wurde durch qPCR nachgewiesen (n = 7). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung aus zwei unabhängigen Experimenten dargestellt. Die Signifikanz wurde durch eine einfache ANOVA mit Tukey-Korrektur für Vergleiche zwischen zwei Gruppen (A, C, E–H) bestimmt. ##P < 0,01, verglichen mit nicht infizierten WT-Proben. **P < 0,01, ****P < 0,0001, verglichen mit infizierten WT-Proben. miR-29a-3p: microRNA-29a-3p; Robo1: Kreisverkehr-Homolog 1

Um zu überprüfen, ob miR-29a-3p zur Umkehrung der durch Eier verursachten Leberfibrose beitrug, wurden Mäuse mit einer moderaten Dosis Parasiten infiziert. Sechs Wochen nach der Infektion, als sich eine Leberfibrose deutlich manifestierte, wurden alle infizierten Mäuse mit Praziquantel behandelt, um den Parasiten abzutöten. Anschließend wurde ihnen 28 Tage lang alle 4 Tage miR-29a-3p-Agomir, NC-Agomir oder PBS injiziert und anschließend eine Autopsie durchgeführt 10 Wochen nach der Infektion (Abb. 6A). Leber- und Milzproben aus der mit miR-29a-3p-Agomir behandelten Gruppe zeigten eine mäßige granulomatöse Reaktion und Splenomegalie (Abb. 6B). Die Antifibrosebehandlung reduzierte die Leber- und Milzindizes signifikant (Abb. 6C, D). Darüber hinaus zeigten die mit dem miR-29a-3p-Agomir behandelten Mäuse eine signifikante Verringerung der zirkulierenden ALT- und AST-Spiegel, was darauf hindeutet, dass die Behandlung hepatozelluläre Schäden linderte (Abb. 6E, F). Mäuse, die das miR-29a-3p-Agomir erhielten, zeigten eine signifikante Verringerung der ECM-Ablagerung, wie durch Hydroxyprolin-Quantifizierung (Abb. 6G), Massons Trichrom-Färbung und Sirius-Rot-Färbung (Abb. 6B, H und I) gezeigt wurde, und eine markierte Verringerung der Größe von Lebergranulomen, sichtbar durch H&E-Färbung (Abb. 6B, J). Die Lebern zeigten jedoch keine signifikante Veränderung der Eilast bei den drei infizierten Gruppen (Zusatzdatei 4: Abb. S4B). Durchgängig zeigten repräsentative immunhistochemische Färbungen und qPCR-Analysen verringerte Expressionsniveaus von Fibrosemarkern in den Lebern von Mäusen, die mit dem miR-29a-3p-Agomir behandelt wurden (Abb. 6B, K – N).

Die miR-29a-3p-Agomir-vermittelte Erhöhung von miR-29a-3p kehrte die durch Schistosomen induzierte Leberfibrose teilweise um. Mäuse wurden perkutan mit 16 Schistosoma japonicum cercariae infiziert oder blieben nicht infiziert. Sechs Wochen nach der Infektion wurden die infizierten Mäuse mit Praziquantel behandelt, um die Parasiten abzutöten, und erhielten dann 28 Tage lang alle 4 Tage miR-29a-3p-Agomir, NC-Agomir oder PBS. Mäuse wurden 10 Wochen nach der Infektion obduziert. Ein Zeitplan für die Parasiteninfektion und die Verabreichung eines Antiparasitenmedikaments oder miR-29a-3p-Agomir sowie die Probenentnahme. B Makroaufnahmen von Lebern und Milzen von nicht infizierten Mäusen, infizierten Mäusen und infizierten Mäusen, die mit miR-29a-3p-Agomir behandelt wurden. Maßstabsleiste, 1 cm. H&E-, Masson-Trichrom- und Sirius-Rot-Färbung von Leberschnitten sowie immunhistochemische Färbung für Kollagen I und α-SMA. Maßstabsbalken, 50 μm. C-, D-Leber- und Milzindizes wurden bestimmt (n = 3–5). E, F Serum-ALT- und AST-Spiegel wurden gemessen (n = 5). G Der Kollagengehalt in der Leber wurde anhand des Hydroxyprolingehalts bestimmt (n = 4–5). H-Fibrose-Scores, gemessen anhand der Masson-Trichrom-Färbung von Leberschnitten (n = 5). I Bereiche, die für die Sirius-Rot-Färbung positiv waren, wurden mit der IPP-Software gemessen (n = 5). J Granulomgröße gemessen aus H&E-gefärbten Leberschnitten (n = 5). K–N Die Expression von Col1α1, Col3α1, α-SMA und TGF-β1 in Lebern während der Infektion wurde durch qPCR nachgewiesen (n = 4). Die Daten werden als Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Experimenten dargestellt. Für Vergleiche zwischen zwei Gruppen (C–N) wurden mehrere Vergleiche mittels einfaktorieller ANOVA mit Tukey-Korrektur durchgeführt. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. miR-29a-3p: microRNA-29a-3p; Robo1: Kreisverkehr-Homolog 1; ALT: Alanin-Aminotransferase; AST: Aspartataminotransferase

Wie erwartet wurde bei den infizierten Mäusen, die mit miR-29a-3p-Agomir behandelt wurden, im Vergleich zu den NC-Agomir- und PBS-Gruppen eine signifikant erhöhte miR-29a-3p-Expression beobachtet (7,2- bis 9,9-fach) (Abb. 7A), was dazu führte deutlich verringerte Robo1-Expression, wie durch qPCR und Western Blot bestimmt (Abb. 7B – D). Ähnlich wie bei MIR29A-Mäusen wurde in der Leber infizierter Mäuse eine Kolokalisation von Robo1- und α-SMA+-HSCs festgestellt. Unterdessen war die Robo1-Expression in HSCs infizierter Mäuse, die mit miR-29a-3p-Agomir behandelt wurden, geringer als bei infizierten Mäusen, die mit NC-Agomir oder PBS behandelt wurden (Abb. 7E). Die mRNA-Spiegel von Col1α1, Col3α1, α-SMA und TGF-β1 waren auch in den infizierten HSCs von Mäusen, die mit dem miR-29a-3p-Agomir behandelt wurden, herunterreguliert (Abb. 7F – I). Zusammengenommen zeigten diese Daten, dass die Hochregulierung von miR-29a-3p die Robo1-Expression reduzierte und die Bilharziose-induzierte HSC-Aktivierung verhinderte.

Die miR-29a-3p-Agomir-vermittelte Erhöhung von miR-29a-3p verhinderte die HSC-Aktivierung während einer Schistosomeninfektion. A, B miR-29a-3p- und Robo1-Expressionsniveaus in Lebern wurden durch qPCR bestimmt (n = 3–4). C, D Robo1-Protein wurde durch Western Blot bestimmt, mit ImageJ quantifiziert und auf GAPDH normalisiert (n = 3). E–I Primäre HSCs wurden aus dem Lebergewebe von Mäusen isoliert. E Repräsentative Immunfluoreszenzfärbung der Kolokalisierung von Robo1 (grün) mit α-SMA (rot) in primären HSCs. Maßstabsbalken, 100 μm. F–I Die Expression von Col1α1, Col3α1, α-SMA und TGF-β1 in primären HSCs während der Infektion wurde durch qPCR nachgewiesen (n = 3–4). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung aus zwei unabhängigen Experimenten dargestellt. Die Signifikanz wurde durch eine einfache ANOVA mit Tukey-Korrektur für Vergleiche zwischen zwei Gruppen (A, B, D, F–I) bestimmt. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. miR-29a-3p: microRNA-29a-3p; Robo1: Kreisverkehr-Homolog 1

Als nächstes untersuchten wir, ob miR-29a-3p die TGF-β1-induzierte HSC-Aktivierung verhinderte. Unter Verwendung einer gut validierten immortalisierten menschlichen HSC-Zelllinie (LX-2) fanden wir heraus, dass die Überexpression von miR-29a-3p die mRNA-Spiegel von Col1α1, Col3α1, α-SMA und TGF-β1 in LX-2-Zellen signifikant abschwächte in Gegenwart von TGF-β1 (Abb. 8A – D). Darüber hinaus imitiert miR-29a-3p das deutlich herunterregulierte Robo1 in LX-2-Zellen in Gegenwart von TGF-β1 (Abb. 8E, F). Diese Ergebnisse zeigten, dass die Überexpression von miR-29a-3p die HSC-Aktivierung durch Hemmung der Robo1-Signalwege sowohl in vivo als auch in vitro abschwächte.

Die Überexpression von miR-29a-3p schwächte die HSC-Aktivierung durch Hemmung der Robo1-Signalwege ab. LX-2-Zellen wurden 6 Stunden lang mit 50 nM miR-29a-3p-Mimetika oder deren Negativkontrollen vorbehandelt, TGF-β1 (10 ng/ml) wurde dem Medium zugesetzt und anschließend wurden die Expressionsniveaus von Fibrosemarkern und Robo1 bestimmt 48 Stunden Inkubation. A–E Die Expression von Col1α1, Col3α1, α-SMA, TGF-β1 und Robo1 in LX-2-Zellen wurde durch qPCR nachgewiesen (n = 3–6). Das F Robo1-Protein wurde durch Western Blot bestimmt, mit ImageJ quantifiziert und auf GAPDH normalisiert (n = 4). Die Daten werden als Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Experimenten dargestellt. Für Vergleiche zwischen zwei Gruppen (A–F) wurden mehrere Vergleiche mittels einfaktorieller ANOVA mit Tukey-Korrektur durchgeführt. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. miR-29a-3p: microRNA-29a-3p; Robo1: Kreisverkehr-Homolog 1

Es wurde bereits vermutet, dass die Regulation und Funktion von miRNAs stark organ- und zelltypspezifisch ist [41]. HSCs sind die Hauptquelle für Myofibroblasten in der Leber [5]. Unsere Ergebnisse liefern Hinweise auf eine funktionelle Rolle von miR-29a-3p bei der durch Schistosomeninfektionen verursachten Leberfibrose bei Menschen und Mäusen. Unsere Daten zeigten, dass miR-29a-3p in HSCs während der Leberfibrose herunterreguliert und Robo1 hochreguliert wurde. Insbesondere legen unsere Ergebnisse nahe, dass miR-29a-3p die Schistosomen-induzierte Leberfibrose teilweise umkehrt, indem es auf Robo1 abzielt, um die Bilharziose-induzierte HSC-Aktivierung während der Infektion zu verhindern.

Mitglieder der MiR-29-Familie gelten als FibromiRs und es wurde gezeigt, dass sie während des Fibroseprozesses in mehreren Organen fehlreguliert sind [42]. Diese Moleküle regulieren mehrere Kollagenisoformen und andere ECM-Komponenten [43]. Im Allgemeinen ist eine verminderte Expression von Mitgliedern der miR-29-Familie mit einer erhöhten ECM-Ablagerung und Fibrose in verschiedenen Geweben verbunden. Die Rolle der miR-29-Spezies wurde umfassend in Tiermodellen und Patientenbiopsien von Leberfibrose untersucht [17, 26, 27]. Bisher hat jedoch keine Studie die Rolle von miR-29 bei der durch Schistosomiasis verursachten Leberfibrose untersucht. In der vorliegenden Studie stellten wir fest, dass miR-29a-3p in Lebergeweben mit Bilharziose-induzierter Leberfibrose verringert war. Frühere Studien ergaben, dass Robo1 als potenzielles Ziel von miR-29a-3p ein TGF-β1-Zielgen in Brustzellen ist [44], was darauf hindeutet, dass Robo1 möglicherweise am Fortschreiten der Leberfibrose beteiligt ist. In der Zwischenzeit untersuchten wir die Expression von Robo1 bei Kontroll- und Bilharziose-Patienten. Unsere Ergebnisse zeigten, dass das Expressionsniveau von Robo1 in Lebergeweben mit Leberfibrose signifikant höher war. Darüber hinaus standen die mRNA-Spiegel von miR-29a-3p und Robo1 im Lebergewebe von Fibrosepatienten im Zusammenhang mit dem Pfortaderdurchmesser und der Milzdicke, die parallel zum Ausmaß der Leberfibrose zunahmen [45, 46]. Noch wichtiger ist, dass wir gezeigt haben, dass Robo1-produzierende Zellen hauptsächlich in HSCs lokalisiert waren. Wir fanden außerdem heraus, dass die Robo1-Expression in HSCs nach der Infektion signifikant erhöht war. Diese Ergebnisse legen nahe, dass miR-29a-3p und Robo1 an der Pathogenese der Leberfibrose über HSCs während einer Schistosomeninfektion beteiligt sind.

Um die Rolle von miR-29a-3p und Robo1 in vivo weiter zu bestätigen, haben wir basierend auf Informationen aus früheren Studien ein Mausmodell der S. japonicum-Infektion erstellt (6, 47). Im Vergleich zur nicht infizierten Gruppe zeigten die mit Schistosomen infizierten Mäuse eine geringere miR-29a-3p- und eine höhere Robo1-Expression im Lebergewebe, und diese Expressionsniveaus waren mit dem fortgeschrittenen Stadium der Leberfibrose verbunden. Darüber hinaus war das miR-29a-3p-Expressionsniveau in HSCs infizierter Mäuse im Vergleich zu Hepatozyten und KCs signifikant herunterreguliert. Unsere Daten zeigten übereinstimmend auch, dass die Robo1-Produktion während einer Schistosomeninfektion hauptsächlich zusammen mit HSCs lokalisiert war. Darüber hinaus wurde die Targeting-Beziehung zwischen miR-29a-3p und Robo1 anhand primärer Maus-HSCs und der menschlichen HSC-Zelllinie LX-2 bestätigt. Diese Ergebnisse stützen unsere funktionellen Daten zur Rolle der miR-29a-3p-Robo1-Signalübertragung in HSCs und legen nahe, dass diese Signalübertragung an der Pathogenese der Leberfibrose über HSCs während einer Schistosomeninfektion beteiligt ist.

Die abnormale Aktivierung von HSCs gilt seit langem als kritisches Ereignis bei der Pathogenese der Leberfibrose [5]. Frühere Studien zeigten das Vorhandensein aktivierter HSCs in der Peripherie von S. japonicum-Eigranulomen bei murinen und menschlichen Infektionen. Bei diesen Zellen handelt es sich wahrscheinlich um Effektorzellen, die zur Granulom-assoziierten Fibrose beitragen, was die Bedeutung von Sternzellmodulatoren für das Fortschreiten unterstreicht hepatische Schistosomiasis [6]. Zunehmende Hinweise deuten darauf hin, dass miR-29a eine antifibrotische Aktivität besitzt. Huang et al. berichteten, dass miR-29a-überexprimierende transgene Mäuse die Leberfibrose verbesserten, indem sie den profibrogenen Phänotyp von HSCs nach BDL oder einer fettreichen Diät modulierten (48, 49). Eine vielversprechende Studie zeigte eine beschleunigte Erholung von CCl4-induzierter Leberfibrose nach der Verabreichung von miR-29a über die Schwanzvene [50]. Unsere Studie zeigte, dass die Überexpression von miR-29a-3p in mit Schistosomen infizierten Mäusen hepatozelluläre Schäden und Leberfibrose deutlich verhinderte. Darüber hinaus reduzierte die Überexpression von miR-29a-3p die Robo1-Expression in aktivierten HSCs signifikant und verringerte die Bilharziose-induzierte HSC-Aktivierung. TGF-β1 ist das stärkste profibrogene Zytokin [51]. Frühere Studien ergaben, dass TGF-β1 eine wichtige Rolle bei der Pathogenese der Bilharziose spielt [52]. Um die Wechselwirkung zwischen miR-29a-3p und Robo1 und die Auswirkung dieser Wechselwirkung auf die HSC-Aktivierung zu untersuchen, haben wir ein miR-29a-3p-Agomir in LX-2-Zellen transfiziert und anschließend TGF-β1 ausgesetzt. Wie erwartet stellten wir fest, dass die Überexpression von miR-29a-3p die TGF-β1-induzierte Robo1- und Kollagenexpression signifikant verringerte. Diese Daten zeigten insgesamt, dass die miR-29a-3p-Robo1-Signalisierung in HSCs die Pathogenese der Leberfibrose vermittelte und die Überexpression von miR-29a-3p einen positiven Effekt auf die Schistosomen-induzierte Leberfibrose hatte, indem sie die Robo1-Expression reduzierte und die HSC-Aktivierung während der Infektion verhinderte.

Wie oben dargestellt, liefern unsere Ergebnisse sowohl experimentelle als auch klinische Beweise dafür, dass der miR-29a-3p-Robo1-Signalweg in HSCs eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Leberfibrose spielt, und weisen stark darauf hin, dass die Überexpression von miR-29a-3p die Schistosomen-induzierte Umkehrung umkehren kann Leberfibrose durch Unterdrückung der HSC-Aktivierung während der Infektion. Obwohl Praziquantel wirksam auf Schistosomen abzielen und diese abtöten kann, bleibt das Fortschreiten der Leberfibrose bestehen [53]. Bisher gibt es keine zugelassenen antifibrotischen Therapien. Unsere Daten zeigten deutlich, dass die Überexpression von miR-29a-3p eine solche Leberfibrose durch Unterdrückung der HSC-Aktivierung linderte. Daher stellt miR-29a-3p einen vielversprechenden Kandidaten für die Entwicklung therapeutischer Instrumente zur Vorbeugung oder Behandlung von Leberfibrose dar. Weitere Studien sind jedoch eindeutig erforderlich.

Unsere Ergebnisse zeigten, dass die miR-29a-3p-Robo1-Signalisierung in HSCs die Pathogenese der Leberfibrose vermittelte und eine Überexpression von miR-29a-3p einen positiven Effekt auf die Schistosomen-induzierte Leberfibrose hatte, indem sie die Expression von Robo1 reduzierte und die Aktivierung verhinderte HSCs während der Infektion. Daher liefert unsere Studie Einblicke in die Mechanismen der miR-29a-3p-Regulation der hepatischen Fibrose bei Schistosomiasis und unterstreicht das Potenzial von miR-29a-3p als therapeutische Intervention bei fibrotischen Erkrankungen.

Alle Daten, die die Schlussfolgerungen dieser Studie stützen, sind im Artikel enthalten.

Alanin-Aminotransferase

Aspartataminotransferase

α-Aktin der glatten Muskulatur

Gallengangligatur

Tetrachlorkohlenstoff

Extrazelluläre Matrix

Fetales Kälberserum

Hepatozyten

Hepatische Sternzellen

Kupffer-Zellen

MicroRNAs

MicroRNA-29a-3p

Messenger RNA PBS Phosphatpuffer-Kochsalzlösung

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

Kreisverkehr-Homolog 1

Schistosoma japonicum

Transformierender Wachstumsfaktor-β1

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Wir danken den Mitarbeitern der Abteilung für Parasitologie, School of Basic Medicine, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, für ihre Hilfe bei Parasiteninfektionen.

Diese Studie wurde vom National Science and Technology Major Project (Nr. 2014ZX10005001; Nr. 2018ZX10302204-001) und dem wissenschaftlichen Forschungsprojekt der Gesundheitskommission der Provinz Hubei (Nr. WJ2021M20) unterstützt. Die Geldgeber hatten keinen Einfluss auf das Studiendesign, die Datenerhebung und -analyse, die Entscheidung zur Veröffentlichung oder die Erstellung des Manuskripts.

Abteilung und Institut für Infektionskrankheiten, Tongji-Krankenhaus, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, China

Hongkong, Dandan Xiang, Shuaiwen Huang, Xin Xu, Jinan He, Lanyue Pan, Ran Tao, Haijing Yu und Jiaquan Huang

Krebsinstitut, Shenzhen Key Laboratory of Gastrointestinal Cancer Translational Research, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen Peking University – Medizinisches Zentrum der Hong Kong University of Science and Technology (PKU-HKUST), Institut für Krebsforschung, Shenzhen Bay Laboratory, Shenzhen, China

Qiqin-Lied

Abteilung für Gastroenterologie, Volkskrankenhaus Jianshi, Enshi, China

Wenjiang Hu

Abteilung für Pädiatrie, Tongji-Krankenhaus, Tongji Medical College, Huazhong-Universität für Wissenschaft und Technologie, Wuhan, China

Shusen Guo

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HK, QS und JH haben die Studie entworfen. HK, QS, WH, SG, DX, SH, XX, JH, LP, RT und HY haben die experimentellen Daten erfasst. HK und JH trugen zur Datenanalyse bei und verfassten das Manuskript. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Jiaquan Huang.

Die Humanstudie wurde von der Ethikkommission des Tongji-Krankenhauses des Tongji Medical College der Huazhong-Universität für Wissenschaft und Technologie genehmigt (Genehmigungsnummer: 20150103). Die Studien wurden gemäß der Deklaration von Helsinki und mit schriftlicher Einverständniserklärung jedes Patienten durchgeführt. Alle Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Tongji Medical College der Huazhong University of Science and Technology genehmigt (IACUC Nr. 629).

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Schematische Darstellung der MIR29A-Mauskonstruktion. Der Hipp11 (H11)-Locus befindet sich in einer intergenen Region zwischen den Genen Eif4enif1 und Drg1 auf Mauschromosom 11. Das menschliche MIR29A-Gen (NCBI-Referenzsequenz: NR_029503.1) befindet sich auf menschlichem Chromosom 7. Für das bedingte Knock-in-Modell: Die Kassette „CAG-loxP-Stop-loxP-human MIR29A-polyA“ wurde in den H11-Locus eingefügt (~ 0,7 kb 5' des Eif4enif1-Gens und ~ 4,5 kb 3' des Drg1-Gens). Cas9 und gRNA wurden zusammen mit einem Targeting-Vektor für die Mausproduktion in befruchtete Eier injiziert. Die Genotypisierung der Welpen erfolgte mittels PCR und anschließender Sequenzierungsanalyse.

Reinheit isolierter HSCs. (A, B) Repräsentative Ergebnisse für die HSC-Reinigung mittels Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz. Einschübe zeigen eine stärkere Vergrößerung des umrissenen Bereichs. Maßstabsbalken, 50 μm.

MIR29A-Mäuse wiesen in verschiedenen Organen höhere Mengen an miR-29a-3p auf. Die miR-29a-3p-Expressionsniveaus in verschiedenen Organen von WT-Mäusen und MIR29A-Mäusen wurden durch qPCR bestimmt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Experimenten dargestellt. Die Signifikanz wurde durch den zweiseitigen Student-t-Test bestimmt. ***P < 0,001, ****P < 0,0001. miR-29a-3p: microRNA-29a-3p.

Veränderung der Parasitenlast in den verschiedenen Gruppen während einer Schistosomeninfektion. Veränderung der Parasitenlast bei den infizierten WT-Mäusen und MIR29A-Mäusen. Veränderung der Parasitenlast nach Verabreichung des miR-29a-3p-Agomirs. Die Daten werden als Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Experimenten dargestellt. Die Signifikanz wurde durch den zweiseitigen Student-t-Test (A) oder eine einfaktorielle ANOVA mit Tukey-Korrektur für Vergleiche zwischen zwei Gruppen (B) bestimmt. miR-29a-3p: microRNA-29a-3p.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kong, H., Song, Q., Hu, W. et al. MicroRNA-29a-3p verhindert die durch Schistosoma japonicum induzierte Leberfibrose, indem es auf das Roundabout-Homolog 1 in hepatischen Sternzellen abzielt. Parasites Vectors 16, 184 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05791-4

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Eingegangen: 26. Januar 2023

Angenommen: 27. April 2023

Veröffentlicht: 06. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05791-4

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