Entwicklung von Mikrosauerstofffabriken, um das Fortschreiten des Tumors durch hyperoxische Mikroumgebungen zu verlangsamen

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 4495 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Während Hypoxie die Karzinogenese, Tumoraggressivität, Metastasierung und Resistenz gegen onkologische Behandlungen fördert, werden die Auswirkungen von Hyperoxie auf Tumore selten erforscht, da die Bereitstellung einer dauerhaften Sauerstoffversorgung in vivo eine große Herausforderung darstellt. Hierin konstruieren wir Mikrosauerstofffabriken, nämlich Photosynthese-Mikrokapseln (PMCs), durch Einkapselung erworbener Cyanobakterien und Upconversion-Nanopartikel in Alginat-Mikrokapseln. Dieses System ermöglicht eine langanhaltende Sauerstoffversorgung durch die Umwandlung externer Strahlung in rotwellige Emissionen für die Photosynthese in Cyanobakterien. Die PMC-Behandlung unterdrückt den NF-kB-Signalweg, die HIF-1α-Produktion und die Krebszellproliferation. Die durch ein In-vivo-PMC-Implantat erzeugte hyperoxische Mikroumgebung hemmt das Wachstum und die Metastasierung von Hepatokarzinomen und hat zusammen mit Anti-PD-1 synergistische Wirkungen bei Brustkrebs. Die technischen Sauerstofffabriken bieten Potenzial für tumorbiologische Studien in hyperoxischen Mikroumgebungen und inspirieren die Erforschung onkologischer Behandlungen.

Hypoxie ist das am weitesten verbreitete Merkmal der Mikroumgebung solider Tumore1,2 und entsteht durch ein Ungleichgewicht zwischen unzureichender Sauerstoffversorgung und erhöhtem Sauerstoffverbrauch durch sich schnell vermehrende Krebszellen. Folglich greifen Krebszellen auf mehrere adaptive Wege und genomische Veränderungen zurück, um in hypoxischen Umgebungen zu überleben3. Der Transkriptionsfaktor Hypoxie-induzierbarer Faktor 1α (HIF-1α), der bekannteste Mediator hypoxischer Reaktionen, spielt eine zentrale Rolle bei der Stimulierung der Neovaskularisation in Tumoren, um die Sauerstoff- und Nährstoffversorgung zu verbessern4. Paradoxerweise sind diese Gefäße oft unregelmäßig organisiert (z. B. verdrehte, hyperpermeable und blind endende Strukturen) und weisen Defekte in der Sauerstoffdiffusion oder -perfusion auf5, was zu einer Ausdehnung hypoxischer Regionen in Tumoren führt. Gleichzeitig wurde berichtet, dass die hypoxische Mikroumgebung, ein Kennzeichen bösartiger Tumoren, nicht nur die primäre Barriere ist, die den Tumor vor verschiedenen Therapien schützt, indem sie eine immunsupprimierende Umgebung6 schafft, den DNA-Reparaturweg7 aktiviert und den autophagischen Fluss ermöglicht8, sondern auch ein Förderer der Karzinogenese9 ist , Tumorinvasivität und Metastasierung1,2. Diese Erkenntnisse inspirierten die Erforschung von Technologien zur Umwandlung hypoxischer Mikroumgebungen in hyperoxische Mikroumgebungen für Tumorbiologie- oder Therapiestudien.

Aufgrund des Mangels an konstanten und biokompatiblen Sauerstoffquellen ist es eine große Herausforderung, in Tumoren eine dauerhaft hyperoxische Mikroumgebung zu schaffen. Angesichts der Tatsache, dass Algenmikroben die Hauptlieferanten von O2 auf der Erde sind, könnte die Photosynthese in Algenchloroplasten möglicherweise für die O2-Ergänzung bei Tumoren untersucht werden. Die Photosynthesemaschinerie erfordert eine angepasste Lichtquelle, die Photonen mit einer Wellenlänge von 650–700 nm emittiert. Da auf seltenen Erden basierende Upconversion-Nanopartikel (UCNPs) eine außergewöhnliche Fähigkeit gezeigt haben, biotransparente Nahinfrarotlaser (NIR) in sichtbares Licht umzuwandeln10, könnten diese Materialien genutzt werden, um verfügbare Photonen in der Photosynthese bereitzustellen. Wir stellten daher die Hypothese auf, dass durch den rationalen Aufbau von Algenmikroben und UCNPs eine langanhaltende hyperoxische Mikroumgebung geschaffen werden könnte.

In dieser Studie entwickeln wir eine Photosynthese-Mikrokapsel (PMC), indem wir Cyanobakterien und UCNPs in Alginat-Mikrokapseln (MCs) einkapseln, die durch eine elektrostatische Tröpfchentechnik hergestellt werden können. Vier Cyanobakterienstämme wurden einer Akklimatisierungsselektion unterzogen, um einen geeigneten Stamm für die Anpassung an physiologische Bedingungen zu erhalten. Wir untersuchen umfassend die Auswirkungen von NIR-Strahlung, Zellpopulation und UCNP-Dosis auf die O2-Produktion, um eine optimierte Formel von PMCs zu entwickeln. Die Auswirkungen hyperoxischer Mikroumgebungen, die durch PMCs erzeugt werden, werden in neun Krebszelllinien und zwei Tumormodellen untersucht, darunter orthotopischer Brustkrebs bei Mäusen und transplantiertes Hepatokarzinom bei Kaninchen.

Um unsere Hypothese zu demonstrieren, haben wir zunächst versucht, das vorgeschlagene PMC-System zu konstruieren, einschließlich der Auswahl von an physiologische Bedingungen akklimatisierten Algenmikroben, der Synthese von mit der Photosynthese kompatiblen UCNPs und der Einkapselung von Algenmikroben und UCNPs in MCs. Vier übergeordnete Algenmikroben, nämlich die kugelförmige Synechocystis sp. 6803 (S. sp. 6803), Chlorella ellipsoidea (C. ellipsoidea), der stäbchenförmige Synechococcus elongates 7942 (S. elongate. 7942) und der bootförmige Scenedesmus obliquus (S. obliquus) wurden in dieser Forschung ausgewählt (Ergänzende Abbildung 1). Da diese in BG11-Medien bei 25 °C gezüchteten Algenmikroben in Säugetierzellkulturmedien (z. B. DMEM) bei 37 °C nicht überleben können, wurden sie einem Akklimatisierungsverfahren unterzogen, das es den Zellen ermöglichte, unter physiologischen Bedingungen durch schrittweise Temperaturwechsel zu wachsen ( 25 bis 37 °C) und mittlerer Zusammensetzung (BG11-Medium bis DMEM). Die Akklimatisierung konnte durch Beurteilung der Zelldichte anhand der Absorption von Chlorophyll α bei 650–700 nm11 beurteilt werden. Wie in der ergänzenden Abbildung 2 gezeigt, wurde die Proliferation von S. obliquus und C. ellipsoidea bei Temperaturen> 32 ° C signifikant gehemmt, S. sp. 6803 und S. verlängern. 7942 konnten sich an die Temperaturschwankungen gewöhnen. Der schrittweise Wechsel vom BG11-Medium zu DMEM ermöglichte uns den Erwerb eines weiterentwickelten S. sp. Stamm 6803 (eS. sp. 6803), der seine Aktivität bei 37 ° C in DMEM beibehielt (ergänzende Abbildung 3). Dieser Stamm wurde daher für die PMC-Konstruktion ausgewählt. Anschließend haben wir mithilfe der Kristallwachstumsmethode eine Reihe von UCNPs mit unterschiedlichen Emissionen synthetisiert10. Es wurde festgestellt, dass ein Er3+- und Yb3+-dotierter NaYF4-Nanostab (15,3 × 30,2 nm) eine starke Fluoreszenz bei 660 nm emittiert, die perfekt mit der Absorption von Chlorophyll α übereinstimmt (Ergänzungsabbildung 4 und Ergänzungsabbildung 5), der Hauptkomponente, die dafür verantwortlich ist für die Photosynthese. Als nächstes konstruierten wir die PMCs, indem wir Algenmikroben und UCNPs in den Alginat-Kalzium-Mikrokügelchen unter einem elektrostatischen Feld über ein elektrostatisches Tröpfchenerzeugungssystem einkapselten. Wie in Abb. 1 dargestellt, umfasst der gesamte Prozess vier Schritte: (i) homogenes Mischen von Algenmikroben mit UCNPs in Alginat-Natrium; (ii) Dispergieren der Alginat-Natriumlösung in gleichmäßige Tröpfchen unter einem elektrostatischen Feld; (iii) Einkapselung von UCNPs und Mikroben durch vernetztes Alginat-Kalzium in CaCl2-Lösungen; und (iv) Beschichtung von Alginat-Kalzium-Mikrokügelchen mit Poly-L-Lysin (PLL), einem wasserlöslichen Polykation, das gegen enzymatischen Abbau resistent ist und das Austreten von Mikroben verhindern kann (ergänzende Abbildung 6). Die resultierenden PMCs wurden mittels Upconversion-Lumineszenzmikroskopie untersucht. Während leere MCs und in Algen eingekapselte MCs keine Fluoreszenzsignale aufwiesen, emittierten PMCs bei 980-nm-Anregung eine starke rote Fluoreszenz (Abb. 2a). Diese Ergebnisse zeigten, dass die eingekapselten UCNPs ihre optischen Eigenschaften vollständig beibehielten. Wir untersuchten umfassend die Auswirkungen der Mikrobendichte und der UCNP-Konzentration auf die photosynthetische Aktivität von PMCs (Abb. 2b). Für eine effiziente Sauerstoffproduktion (1,6 μg/min) wurde eine optimierte Formel von PMCs (3 × 103 Algenzellen und 0,67 μg UCNPs pro MC) erworben. Die Sauerstofferzeugung der ausgewiesenen PMCs hing von der Intensität und Einwirkungszeit der NIR-Strahlung ab, was auf eine kontrollierbare Sauerstoffversorgung hinweist (ergänzende Abbildung 7). Die in PMCs eingekapselten Algenmikroben überlebten in DMEM über einen Monat (ergänzende Abbildung 8).

(i) homogenes Mischen von Algenmikroben mit UCNPs in Alginat-Natrium; (ii) Dispergieren der Alginat-Natriumlösung in gleichmäßige Tröpfchen unter einem elektrostatischen Feld; (iii) Einkapselung von UCNPs und Mikroben durch vernetztes Alginat-Kalzium in CaCl2-Lösungen; und (iv) Beschichtung von Alginat-Kalzium-Mikrokügelchen mit Poly-L-Lysin (PLL).

a Bildgebung konstruierter PMCs. Die leeren MCs, MCs mit Algenzellen (eS. sp. 6803@MCs) und vollständig konstruierte PMCs wurden einer Bildgebung durch Upconversion-Lumineszenzmikroskopie bei 980 nm unterzogen. Der Rand von MCs wird durch eine weiße Umrandung beschrieben. b Eine Heatmap, die die O2-Produktion von PMCs mit unterschiedlichen Formulierungen darstellt. Algenzellen mit 107–1011 Zellen/ml, UCNPs mit 0–100 mg/ml und 1 ml Alginatnatrium wurden gemischt, um mithilfe eines elektrostatischen Tröpfchenerzeugungssystems verschiedene PMC-Formulierungen herzustellen. Die resultierenden PMCs wurden 20 Minuten lang einer NIR-Strahlung von 900 mW/cm2 ausgesetzt, um den O2-Gehalt mit einem tragbaren Messgerät für gelösten Sauerstoff zu messen. c Visualisierung synthetisierter Sauerstoffspezies in PMCs durch DCFH-Färbung. PMCs, eS. sp. 12 Stunden lang im Dunkeln kultivierte 6803@MCs und UCNP@MCs wurden 10 Minuten lang mit 10 μg/ml DCFH inkubiert und dann 0, 1, 3 und 10 Minuten lang 300 mW/cm2 980 nm NIR-Strahlung ausgesetzt. Die behandelten Mikrokügelchen wurden sofort durch konfokale Mikroskopie bei 488 nm Anregung sichtbar gemacht. Der Rand von MCs wird durch eine weiße Umrandung beschrieben. d Schematische Darstellung zur Darstellung des pO2-Nachweises in Tumoren. e Messungen des Sauerstoffpartialdrucks (pO2) im Kern von Tumoren zu verschiedenen Zeitpunkten. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt, abgeleitet von drei Tumoren. f visuelle Darstellung des pO2 in Tumoren. Eine Clark-Sauerstoffelektrode wurde zur Messung des pO2 in Brusttumoren von Mäusen verwendet, die mit Kochsalzlösung, PMC, NIR, hyperbarem Sauerstoff (60 %) und NIR-PMC behandelt wurden. Die pO2-Werte wurden in Tumoren in 5 mm Tiefe über 7 Tage oder in unterschiedlichen Tumortiefen 1 Stunde nach der NIR-PMC-Behandlung aufgezeichnet. Die pO2-Werte am größten Tumorquerschnitt wurden von Python für die Erstellung der Heatmaps integriert. Der Rand des Tumors wird durch einen schwarzen Umriss dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Anschließend untersuchten wir die Sauerstoffversorgungsfähigkeit von PMCs in physiologischen Lösungen sowie in Tumoren. PMCs wurden zunächst in DMEM bei 37 °C inkubiert. Sauerstoff entsteht häufig zusammen mit anderen Sauerstoffspezies bei der Photosynthese von Chloroplasten12. Die Produktion oxidativer Radikale in PMCs wurde durch 2′,7′-Dichlordihydrofluorescein (DCFH)-Färbung13 untersucht, um die photosynthetische Aktivität zu beurteilen. Nichtfluoreszierendes DCFH könnte zu 2′,7′-Dichlorfluorescein (DCF) oxidiert werden und unter hyperoxischen Bedingungen grüne Fluoreszenz emittieren. Wie in Abb. 2c gezeigt, wurden in vollständig konstruierten PMCs intensive Fluoreszenzsignale nachgewiesen, wohingegen algenfreie und UCNP-freie PMCs begrenzte Signale zeigten. Der freigesetzte Sauerstoff im Medium wurde 24 Stunden lang kontinuierlich überwacht. Wie in der ergänzenden Abbildung 9 gezeigt, konnten die PMCs stabil Sauerstoff synthetisieren, der 1 Stunde nach der NIR-Exposition 6,2 ± 0,5 mg/L erreichte und innerhalb von 24 Stunden langsam auf 3,0 ± 0,3 mg/ml abfiel. Angesichts des interstitiellen Drucks von 20–40 mmHg in soliden Tumoren14,15,16 wurden ihre Auswirkungen auf die Photosynthese von PMCs untersucht. Wie in der ergänzenden Abbildung 10 gezeigt, haben wir ein Gerät entwickelt, das aus einer versiegelten 10-ml-Spritze, kalibrierten Gewichten und Clark-Elektroden zur dynamischen Erfassung des Sauerstoffpartialdrucks (pO2) bei verschiedenen Drücken besteht. Während der pO2 in DMEM bei normalem Atmosphärendruck 105,7 ± 6,1 mmHg erreichte, hatte der zusätzliche Druck kaum Auswirkungen auf die Oxygenierungsprofile von PMCs. Darüber hinaus wurde die Sauerstoffversorgung von PMCs bei Brusttumoren beurteilt. Wie in Abb. 2d, e gezeigt, erreichte der pO2 im Kern (~5 mm bis zur äußeren Schicht) von Tumoren 1 Stunde nach der NIR-Exposition Spitzenwerte (27,2–35,4 mmHg) und sank langsam auf Grundwerte von 10,8–12,3 mmHg um 24 Uhr. Die Oxygenierungskurven zeigten in sieben Zyklen der NIR-Exposition ähnliche Muster, was auf eine stabile photosynthetische Aktivität von PMCs in Tumoren hinweist. Im Vergleich zu hyperbarem Sauerstoff erreichte der pO2 in Tumorkernen bei der NIR-PMC-Behandlung 6,7-fach höhere Werte. Zur visuellen Beurteilung des pO2 von der äußeren Tumorschicht bis zum inneren Kern wurden Heatmaps erstellt (Abb. 2f). Während bei unbehandelten Tumoren (Kontrolle) in tiefen Tumoren eine schwere Hypoxie auftrat, deuteten gelblich-grüne Farben bei NIR-PMC-behandelten Tumoren auf einen signifikanten Anstieg des Sauerstoffgehalts hin. Diese Ergebnisse dokumentierten ausführlich die Sauerstoffanreicherungsfähigkeit von PMCs in vitro und in vivo.

Wir fragten uns dann, ob die O2-Versorgung durch PMCs die Proliferation von Krebszellen beeinflussen könnte. Die Auswirkungen von PMCs wurden in neun Krebszelllinien untersucht, darunter Brust (MCF-7, 4T1), Lunge (A549), Leber (HepG2, VX2), Darm (HCT116), Bauchspeicheldrüse (PANC-1), Magen (MGC-1). 803) und Gebärmutterhalszellen (HeLa) in drei Säugetierarten (Mensch, Maus und Kaninchen) und drei primären Zelllinien (embryonale Fibroblasten der Maus (MEFs), Herz- und Nierenzellen). Die Zellstoffwechselaktivitäten wurden anhand eines kolorimetrischen Substrats in einem MTS-Assay untersucht. Um die zytotoxischen Wirkungen von Wärme bei NIR-Strahlung zu verhindern, wurde die NIR-Expositionsdosis für 20 Minuten auf 300 mW/cm2 eingestellt (ergänzende Abbildung 11). Drei Intervalle NIR-Strahlung wurden auf PMCs in einer 24-Stunden-Kultur angewendet, um einen hyperoxischen Biokontext mit Sauerstoffwerten von 1,8–5,3 mg/L zu erzeugen. Wie in Abb. 3a und der ergänzenden Abb. 12 gezeigt, hatten mit NIR gekoppelte PMCs (NIR-PMCs) in drei normalen Zelllinien eine geringe Zytotoxizität, hemmten jedoch die Proliferation von acht Krebszelllinien. Bemerkenswerterweise unterdrückten die sauerstoffreichen Medien die Duplikationen von HCT116-, HepG2-, MCF-7- und 4T1-Zellen vollständig. Wir haben die Auswirkungen von PMC-Integrationen, einschließlich MCs, Algen und UCNPs, auf MCF-7- und HepG2-Zellen mit oder ohne NIR-Strahlung ausführlich untersucht. Infolgedessen wurde der Unterdrückungseffekt hauptsächlich in Zellen unter NIR-PMC-Behandlung festgestellt (Abb. 3b und ergänzende Abb. 13). Um diesen Punkt weiter zu verdeutlichen, haben wir die neuen Tochterkrebszellen mit einem BeyoClick-iT® EdU-594-Proliferationsassay-Kit visualisiert, das aus EdU (5-Ethinyl-2′-desoxyuridin) besteht, das in neu synthetisierte DNA eingebaut und durch fluoreszierend markiert werden konnte eine bestimmte Klickreaktion17. Wie in Abb. 3c gezeigt, unterdrückte die NIR-PMC-Behandlung den Anteil der aus Brustkrebs- (MCF-7) und Hepatokarzinomzellen (HepG2) abgespaltenen Tochterzellen signifikant, was durch die Verringerung der EdU-positiven Zellen (rot) belegt wird. Bemerkenswerterweise wurden die Hyperoxie-Medien ungültig, sobald der gelöste Sauerstoff durch N2-Spülung entfernt wurde (ergänzende Abbildung 14), was darauf hindeutet, dass Sauerstoff und nicht Metaboliten aus Algenzellen für die Unterdrückungswirkung von NIR-PMCs verantwortlich waren. Die durchflusszytometrische Analyse zeigte wenige apoptotische Zelltode (ergänzende Abbildung 15).

a Bewertung der Zellproliferation. HCT116-, 4T1-, HepG2-, VX2-, MCF-7-, PANC-1-, MGC-803-, HeLa- und A549-Zellen, die mit oder ohne PMCs (25 μl, 3,6 × 104/ml) inkubiert wurden, wurden drei Mal einer NIR-Strahlung von 300 mW/cm2 ausgesetzt Intervalle. Nach 24 Stunden wurde die Lebensfähigkeit der Zellen durch MTS-Assays untersucht (n = 6). Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. ***p < 0,001 im Vergleich zu Kontrollzellen gemäß zweiseitigem Student-t-Test. b Auswirkungen der Integration in PMCs. HepG2-Zellen wurden zusammen mit MCs, UCNP@MCs, e-synechocystis@MCs und PMCs in Gegenwart oder Abwesenheit von NIR-Strahlung zur Beurteilung der Zelllebensfähigkeit inkubiert (n = 6). Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. ***p < 0,001 und **p < 0,01 im Vergleich zur Kontrollgruppe gemäß zweiseitigem Student-t-Test. c Konfokale Visualisierung neuer Tochterzellen. HepG2- und MCF-7-Zellen wurden nach der NIR-PMC-Behandlung mit einem BeyoClick-iT® EdU-594-Assay-Kit (Maßstab: 20 μm) für die konfokale Bildgebung gefärbt. d Die zellulären Auswirkungen von NIR-PMCs auf den NF-κB-Signalweg. HepG2-Zellen wurden mit NIR-PMCs (300 mW/cm2 NIR-Strahlung für drei Intervalle) vorbehandelt. Nach 24 Stunden wurden alle Zellen 2 Stunden lang mit 20 nM BMS und 2 µL Dimethylsulfoxid (DMSO) (leer) vorbehandelt, bevor sie 10 Minuten lang mit 200 ng/ml TNFα stimuliert wurden. Zelllysate wurden gesammelt und einer Western-Blot-Analyse von IκBα und phosphoryliertem IκBα unterzogen (n = 3, die Proben stammen aus demselben Experiment und die Blots wurden parallel verarbeitet). Die Verhältnisse von p-IκBα zu β-Actin wurden mit ImageJ 1.51 bestimmt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. *p < 0,05 im Vergleich zu Kontrollzellen gemäß zweiseitigem Student-t-Test. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Da NIR-PMCs eine begrenzte Wirkung auf Primärzellen hatten, aber die Proliferation von Krebszellen deutlich unterdrückten, spekulierten wir, dass Hyperoxie speziell die Signale in Karzinogenesewegen beeinflussen könnte. Angesichts der Tatsache, dass der Kernfaktor Kappa B (NF-κB), die Phosphoinositol-3'-Kinase (PI3K), die Proteinkinase B (AKT), das Säugetierziel von Rapamycin (mTOR), die mitogenaktivierte Proteinkinase (MAPK) und die extrazelluläre signalregulierte Kinase ( ERK) spielen eine entscheidende Rolle für das Überleben und die Proliferation von Krebszellen18,19,20,21. Sie wurden in HepG2-Zellen durch Immunblotting untersucht. Endothelialer Wachstumsfaktor (EGF), Insulin und TNF-α wurden als Induktoren genutzt22,23,24 und 3-Methyladenin (3-MA), MK-2206, Rapamycin, PD98059 und BMS-345541 (BMS) wurden als Inhibitoren einbezogen25, 26,27,28,29,30. Wie in Abb. 3d und der ergänzenden Abb. 16 gezeigt, wurde in PMC-behandelten Zellen eine signifikante Unterdrückung von phosphoryliertem IκBα (p-IκBα) festgestellt. Im Gegensatz dazu hatten NIR-PMCs kaum Einfluss auf die Expression von ERK, PI3K, AKT und mTOR. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Wirkung von NIR-PMCs auf die Hemmung der Proliferation hauptsächlich mit dem NF-κB-Signalweg zusammenhängt. Um die Rolle von NF-κB weiter zu bestätigen, haben wir versucht, die NF-κB-Aktivität in Gegenwart oder Abwesenheit von PMCs zu verändern, um die Zellproliferation durch Anfärben neuer Tochterzellen zu untersuchen (ergänzende Abbildung 17). Die Proliferation von Krebszellen könnte durch BMS gehemmt werden, in Abwesenheit von PMCs jedoch durch TNF-α verstärkt werden. Bemerkenswert ist, dass in Gegenwart von PMCs, während BMS eine stärkere hemmende Wirkung auf das Zellwachstum zeigte, TNF-α die Zellduplikationen nicht steigern konnte.

Umfangreiche Studien haben gezeigt, dass Hypoxie für die Immunsuppression der Tumormikroumgebung durch Hypoxie-induzierte HIF-1α- und Adenosinfreisetzung in Krebszellen und die Hemmung der Immunzellfunktion durch Erhöhung der Menge an Adenosin-A2A-Rezeptoren (A2ARs) verantwortlich ist31,32 ,33. Wir spekulierten, dass Hyperoxie durch NIR-PMCs die Immunaktivität steigern könnte, indem sie die Hypoxie/HIF-1α/Adenosin/A2AR-Achse eliminiert. Um diese Spekulation zu testen, untersuchten wir die Auswirkungen von NIR-PMCs in Krebszellsphäroiden, die durch Einkapselung von HepG2- oder MCF-7-Zellen in Matrigel hergestellt wurden. Zunächst wurde die Hypoxiesonde FITC-MAb1 verwendet, um den Hypoxiestatus in Krebszellsphäroiden zu beurteilen. Wie in Abb. 4a gezeigt, wurde bei unbehandelten Sphäroiden eine intensive grüne Fluoreszenz beobachtet, die auf eine schwere Hypoxie hinweist, wohingegen die NIR-PMC-Behandlung den Sauerstoffgehalt erhöhte und den Hypoxiestatus verbesserte. Die Quantifizierung des Hypoxie-induzierbaren Faktors 1α (HIF-1α) in Zelllysaten mittels ELISA zeigte, dass die NIR-PMC-Behandlung die HIF-1α-Spiegel dramatisch von 335,7 auf 148,3 pg/mg Protein in HepG-2-Zellsphäroiden und von 614,6 auf 107,9 reduzierte pg/mg Protein in MCF-7-Zellsphäroiden (Abb. 4b). Folglich kam es zu einem Rückgang der Adenosinproduktion um 42,9 % bzw. 71,7 % in MCF-7- und HepG-2-Zellsphäroiden (Abb. 4c). Die IFN-γ-Produktion34,35 wurde untersucht, um die Effektorfunktion von T-Zellen nach einer Hyperoxie-Behandlung zu beurteilen. Dabei wurde Phorbolmyristatacetat (PMA) als Induktor der T-Zell-Aktivierung einbezogen. Wie in Abb. 4d, e gezeigt, produzierten T-Zellen, die mit oder ohne NIR-PMCs vorbehandelt wurden, in Abwesenheit von PMA nur vernachlässigbare Mengen an IFN-γ. Im Gegensatz dazu war der Prozentsatz der IFN-γ-produzierenden T-Zellen in der NIR-PMC-Behandlungsgruppe in Gegenwart von PMA bemerkenswert auf 13,5 % erhöht, was etwa 2,6-fach höher war als ohne NIR-PMC-Vorbehandlung. Um die potenzielle Wirkung von NIR-PMCs auf die zytolytische Aktivität von NK-Zellen zu testen, wurde die MHC-freie Maus-Lymphomzelllinie Yac-1, die gegenüber NK-Zellen hochempfindlich ist, als Zielzellen verwendet36,37. Wie in Abb. 4f gezeigt, wurden nach 6-stündiger Kokultur bis zu 95,6 % der Yac-1-Zellen durch NK-Zellen in der NIR-PMC-Behandlung eliminiert, und im krassen Gegensatz dazu wurden nur 58,3 % der Yac-1-Zellen abgetötet in den Kontrollgruppen. Diese Ergebnisse deuten auf eine Wiederbelebung der Effektorfunktion von T- und NK-Zellen in einer durch NIR-PMCs erzeugten hyperoxischen Umgebung hin.

a Konfokale Bildgebung des hypoxischen Status. HepG2- und MCF-7-Zellen wurden in Matrigel eingebaut, um Sphäroide herzustellen. Nach 7-tägiger Inkubation wurden die konstruierten Sphäroide drei Intervallen lang 3600/ml PMCs ausgesetzt und erhielten 300 mW/cm2 NIR-Strahlung. Die behandelten Sphäroide wurden einer Färbung mit dem HypoxyprobeTM-1 Plus Kit (grün) und Hoechst 33342 (blau) unterzogen. b HIF-1α- und C-Adenosinproduktion in Krebszellsphäroiden (n = 3). Die Zellen in Sphäroiden wurden gesammelt und für den HIF-1α- oder Adenosin-Nachweis mittels ELISA bzw. LC-MS lysiert. d Repräsentative Bilder und e Quantifizierung der IFN-γ-Expression in T-Zellen mittels Durchflusszytometrie-Analyse (n = 3). T-Zellen wurden 18 Stunden lang mit 50 ng/ml PMA und 1 µL/ml Golgi-Inhibitor mit/ohne NIR-PMC über drei Intervalle behandelt. Die behandelten Zellen wurden fixiert, permeabilisiert und mit Anti-IFN-γ-FITC für die Durchflusszytometrieanalyse gefärbt. f Auswirkungen von Hyperoxie auf die zytolytische Aktivität von NK-Zellen (n = 3). Die sortierten NK-Zellen (2 × 105 Zellen/Vertiefung) wurden mit Yac-1-Zellen im Verhältnis 1:1 oder 2:1 in Platten mit 24 Vertiefungen gemischt und mit/ohne PMCs kokultiviert, gefolgt von drei Intervallen NIR-Belichtung. Nach 6-stündiger Inkubation wurden die Zellmischungen gesammelt, um Yac-1-Zellen zu lysieren. Die Lumineszenz von Zelllysaten wurde mit einem Mikroplatten-Lesegerät gemessen. Die Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. **p < 0,01 und ***p < 0,001 im Vergleich zu Strg-Zellen durch zweiseitigen Student-T-Test. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Als nächstes untersuchten wir die In-vivo-Auswirkungen von Sauerstoffpräparaten auf das Hepatokarzinom durch In-situ-Implantation von PMCs in die Leber von Kaninchen. Um eine sichere und wirksame Strahlungsdosis in vivo zu bestimmen, untersuchten wir die Auswirkungen von NIR-Strahlung auf pathologische Hautveränderungen sowie auf die Sauerstofferzeugung. Für die Tierbehandlung wurde eine NIR-Strahlungsdosis von 900 mW/cm2 für 20 Minuten gewählt, da dadurch eine hyperoxische Mikroumgebung (2,7–3,4 mg/l) geschaffen und eine durch Hyperthermie verursachte Gewebeschädigung verhindert wurde (ergänzende Abbildung 18). Mehr als 65 % der Cyanobakterien in PMCs überlebten in der Leber mindestens einen Monat lang (ergänzende Abbildung 19). Wie im Behandlungsschema (Abb. 5a) angegeben, wurden Kaninchen mit Hepatokarzinom, die eine intratumorale Injektion von PMCs (500 μl, 3,6 × 104/ml) erhielten, 42 Tage lang einer NIR-Strahlung von 980 nm ausgesetzt. Die NIR-PMC-Behandlung erzeugte eine langanhaltende hyperoxische Tumormikroumgebung, was sich in einer dramatischen Verringerung der HIF-1α-Expression zeigte (Abb. 5b). Folglich sind die nachgeschalteten Ziele von HIF-1α, einschließlich BCL2/Adenovirus E1B-Protein-interagierendes Protein 3 (BNIP-3), vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF), insulinähnlicher Wachstumsfaktor (IGF-2), Matrix-Metalloproteinase-2 ( MMP2) und transformierender Wachstumsfaktor Alpha (TGF-α) nahmen nach NIR-PMC-Behandlung signifikant ab (Ergänzungsabbildung 20 und Ergänzungstabelle 2). Diese Ziele spielen eine entscheidende Rolle für das Überleben, die Proliferation und die Metastasierung von Krebszellen, und ihr Rückgang bedeutet eine Unterdrückung des Tumorwachstums38,39,40,41.

a Illustration der NIR-PMC-Behandlung bei Kaninchen mit Hepatokarzinomtumor. 14 Tage nach der Tumorimplantation (die Tumorgröße beträgt etwa 1 cm3) wurden Kaninchen 500 µL PMCs (3,6 × 104/ml) intratumoral injiziert, gefolgt von 900 mW/cm2 NIR-Bestrahlung für 42 Tage. b Immunfärbung von HIF-1α in Lebertumoren. Nach 28 Tagen wurden die Kaninchen getötet, um Tumorgewebe zu sammeln. Die Gewebeproben wurden zur immunhistochemischen Färbung in 4 % Formalin fixiert. Die Verhältnisse der HIF-1α-positiven Zellen (linkes Feld) wurden mit einem digitalen Pathologiescanner (DMetrix) berechnet. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt, der aus drei Bildern unabhängiger Kaninchenlebertumoren abgeleitet wurde. **p < 0,01 im Vergleich zur Fahrzeugkontrolle gemäß zweiseitigem Student-t-Test. c Repräsentative axiale CT-Bilder des Tumorwachstums. Tumortragende Kaninchen wurden mit oder ohne NIR-PMCs behandelt. Gesunde, tumortragende und mit NIR-PMC behandelte Tiere wurden nach 0, 14, 28 und 42 Tagen einer CT-Bildgebung unterzogen. Die Form/Kante von Hepatokarzinomtumoren wird durch gelbe Umrisse beschrieben (Maßstabsbalken, 1 cm). d Messung der Tumorgröße anhand von CT-Bildern. Die Größe von Hepatokarzinomtumoren wurde mit Neusoft PACS/Ris V5.5 28 Tage nach der Behandlung gemessen (n = 3). Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. **p < 0,01 im Vergleich zu den Daten für unbehandelte Hepatokarzinom-tumortragende Kaninchen gemäß dem zweiseitigen Student-t-Test. e Repräsentative axiale CT-Bilder von Lungentumormetastasen. Die Tierlungen wurden 0, 14, 28 und 42 Tage nach der Behandlung mittels CT abgebildet. Die Knoten von Lungenmetastasen werden durch gelbe Pfeile beschrieben. f Die Anzahl der Lungenmetastasenknötchen in der Kaninchenlunge (n = 3). Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. *p < 0,05 im Vergleich zu unbehandelten Tieren gemäß zweiseitigem Student-t-Test. g Kaplan-Meier-Kurven, die die Überlebensraten der angegebenen Kaninchen nach 140 Tagen (n = 10) zeigen. Die Daten werden als *p < 0,05 dargestellt, verglichen mit den Daten für unbehandelte Kaninchen mit Hepatokarzinomtumor gemäß Log-Rank-Test der Software SPSS Statistics 17.0. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Das Tumorwachstum wurde 42 Tage lang mittels CT-Bildgebung untersucht (Abb. 5c). Während die Tumorgröße bei unbehandelten Kaninchen schnell auf 4 cm3 am 14. Tag und 16 cm3 am 28. Tag anstieg, hemmte die NIR-PMC-Behandlung das Tumorwachstum innerhalb von 14 Tagen vollständig und zeigte einen langsamen Anstieg der Tumorgröße auf 4 cm3 am 28. Tag (Abb. 5d). Da die Lunge das häufigste Zielorgan für die Metastasierung von Hepatokarzinomen ist42, haben wir dieses Organ auch mittels CT-Bildgebung untersucht. Wie in Abb. 5e gezeigt, konnten nach 14 Tagen deutliche Anzeichen von Metastasen in der Lunge unbehandelter tumortragender Kaninchen unterschieden werden, und am 28. Tag bildete sich eine große Anzahl von Tumorherden (51 ± 25/Lunge). Bemerkenswerterweise waren bei NIR-PMC-Behandlungen selbst am 42. Tag nur wenige Lungenmetastasen nachweisbar (Abb. 5f, ergänzende Abb. 21). Konsistent zeigten Leberschnitte von Kaninchen, die eine NIR-PMC-Behandlung erhielten, eine dramatische Verringerung des Tumormetastasen-Biomarkers Gefäßzelladhäsionsmolekül-1 (VCAM-1)43 (ergänzende Abbildung 22). Kaplan-Meier-Diagramme zum Vergleich der Überlebensraten wurden durch kontinuierliche tägliche Überwachung der Tiere zum Zeitpunkt des moribunden Status oder des spontanen Todes erstellt. Log-Rank-Tests zeigten einen statistisch signifikanten Überlebensvorteil (p < 0,05) für die NIR-PMC-Behandlung im Vergleich zur Vehikel-Kontrollbehandlung (Abb. 5g). Bemerkenswerterweise lebten zwei von zehn Kaninchen > 140 Tage und waren fast geheilt, da durch CT-Bildgebung und Ex-vivo-Untersuchung keine Tumorknötchen in Leber und Lunge nachweisbar waren (ergänzende Abbildung 23). Zu unserer Überraschung konnten in der Leber immer noch lumineszierende PMCs beobachtet werden, die ihre sphärische Morphologie beibehielten (ergänzende Abbildung 23). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die durch NIR-PMCs erzeugte hyperoxische Mikroumgebung das Fortschreiten des Tumors erheblich verlangsamen, die Tumormetastasierung hemmen und die Überlebensraten von Kaninchen mit Hepatokarzinomen verbessern kann.

Da vielfach über Sauerstoffspezies als Voraussetzungen für die Immunaktivierung berichtet wurde44, spekulierten wir, dass langanhaltende Sauerstoffergänzungen durch NIR-PMCs die Immuntherapie erleichtern könnten, indem sie adaptive Immunantworten in der Tumormikroumgebung aktivieren. Wir haben dies durch LC-MS-Analyse von Adenosin und Immunfärbung der CD4-, CD39-, CD206- und CD73-Expression in einem orthotopen Brusttumormodell verifiziert, indem wir mit Firefly-Luciferase transfizierte 4T1-Tumorzellen (fLuc-4T1) in die Brustpolster von BALB/c-Mäusen inokulierten . Wie in Abb. 6a, b gezeigt, verbesserte die NIR-PMC-Behandlung die HIF-1α- und Adenosinproduktion deutlich, steigerte die CD4-Expression und reduzierte die CD39-, CD206-, CD73- und A2AR-Expression in Tumorschnitten; Dies deutete darauf hin, dass T-Helferzellen, B-Zellen und NK-Zellen aktiviert wurden und dass eine Differenzierung von M1-Makrophagen in der Tumormikroumgebung stattfand45,46. Daher könnte bei einer kombinierten Behandlung von NIR-PMCs und Checkpoint-Inhibitoren ein synergistischer therapeutischer Effekt erwartet werden. Die mittels Biolumineszenzbildgebung (BLI) untersuchten tumortragenden Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in vier Gruppen eingeteilt: keine Behandlung (Vehikelkontrolle), NIR-PMC-Behandlung, Anti-PD-1-Behandlung (200 μg/Maus zweimal pro Woche) und gleichzeitige Behandlung mit NIR -PMCs und Anti-PD-1. Abbildung 6c zeigt das Schema der kombinierten Behandlung. Wie in Abb. 6d gezeigt, wurde ein schnelles Tumorwachstum bei unbehandelten tumortragenden Mäusen durch die intensive Lumineszenz von 4T1-Zellen sowie in den Hellfeldbildern festgestellt. Die schnelle Vermehrung von Brustkrebszellen führte zu Nährstoffmangel und Zellnekrose, was sich in der abnehmenden Lumineszenz in den Tumorkernen zeigte. Während die gleichzeitige Behandlung mit NIR-PMCs und Anti-PD-1 eine starke therapeutische Wirkung zeigte, unterdrückten NIR-PMC- und Anti-PD-1-Behandlungen lediglich das Tumorwachstum in den ersten zwei Wochen, wuchsen jedoch anschließend schnell. Dieses Ergebnis wurde durch die Tumorvolumendaten weiter bestätigt. Die Tumorgrößen bei gleichzeitiger Behandlung waren dreimal kleiner als bei der Anti-PD-1-Behandlung (Abb. 6e, ergänzende Abb. 24). Tumormetastasen wurden auch in Tierlungen untersucht. Wie in Abb. 6f gezeigt, hatte Anti-PD-1 zwar nur eine begrenzte Wirkung auf Tumormetastasen, die NIR-PMC-Behandlung reduzierte jedoch die Tumorknötchen in präparierten Lungen signifikant. Bemerkenswerterweise gab es in der Begleitgruppe keine nachweisbaren Lungentumormetastasen. Wir haben auch die Überlebensraten der Tiere in den verschiedenen Behandlungen verglichen (Abb. 6g). Alle unbehandelten tumortragenden Tiere waren innerhalb von 25 Tagen entweder tot oder erreichten den moribunden Status, wohingegen NIR-PMC- oder Anti-PD-1-Behandlungen das Überleben der Tiere signifikant verlängerten (+40 %). Interessanterweise wurden nach 50-tägiger gleichzeitiger Behandlung keine Todesfälle bei Tieren beobachtet und 8 von 10 Mäusen überlebten mehr als 60 Tage. Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass die Kombination von PMC-Implantaten mit Immun-Checkpoint-Inhibitoren einen starken synergistischen Effekt (CI = 0,23) bei Mäusen mit Brustkrebs zeigte.

a Repräsentative Bilder der immunhistochemischen Färbung (CD4, CD39, CD206, CD73 und A2AR) von Brusttumoren. b HIF-1α- und Adenosinproduktion bei orthotopen Brusttumoren. HIF-1α oder Adenosin in Tumorlysaten wurden durch ELISA bzw. LC-MS nachgewiesen (n = 6 und 3). Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. *p < 0,05, ***p < 0,001 im Vergleich zu unbehandelten Brustkrebsmäusen mittels zweiseitigem Student-t-Test. c Schematische Darstellung einer kombinierten Behandlung mit NIR-PMCs und Anti-PD-1. 7 Tage nach der Tumorimplantation (Tumorgröße ~100 mm3) wurden PMCs (25 μl, 3,6 × 104/ml) tumortragenden Mäusen intratumoral injiziert, woraufhin die Mäuse 28 Jahre lang einer NIR-Strahlung von 300 mW/cm2 ausgesetzt wurden Tage. Während der gesamten Tumorbehandlung wurde eine einzige PMC-Injektion verabreicht. Jede Maus erhielt zweimal pro Woche 10 mg/kg Anti-PD-1. d Biolumineszenzbild (BLI) und Hellfeldbilder (BF) von Brustkrebs tragenden Mäusen. Tiere, die verschiedene Therapeutika erhielten, wurden nach 0, 7, 14, 21 und 28 Tagen einer Biolumineszenz-Bildgebung mit einer Kamera und einem IVIS-Bildgebungsspektrumsystem unterzogen. e, Durchschnittliche Tumorwachstumskurven von Mäusen. Das Tumorvolumen einzelner Mäuse wurde 20 Tage lang alle zwei Tage mit einem Messschieber gemessen (n = 6). Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. ***p < 0,001 im Vergleich zu unbehandelten Brustkrebsmäusen gemäß zweiseitigem Student-t-Test. f Ex-vivo-Bildgebung von Lungenmetastasen. Die Tiere, die unterschiedliche Behandlungen erhielten, wurden nach 21 Tagen getötet, um metastatische Knötchen in der Lunge sichtbar zu machen. Die Knötchen von Lungenmetastasen werden durch eine schwarze Umrandung dargestellt. g Kaplan-Meier-Kurven, die die Überlebensraten der angegebenen Mäuse nach 60 Tagen (n = 10) zeigen. Die Daten werden als ***p < 0,001 dargestellt, verglichen mit den Daten für unbehandelte Kaninchen mit Hepatokarzinomtumor gemäß Log-Rank-Test der Software SPSS Statistics 17.0. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um die biologische Sicherheit von NIR-PMCs bei Tieren zu beurteilen, wurden gesunden Mäusen PMCs durch intraperitoneale oder subkutane Injektion verabreicht und NIR-Strahlung ausgesetzt. Die Tiergewebe wurden für histologische Untersuchungen gesammelt. Wie in der ergänzenden Abbildung 25 gezeigt, zeigte die H&E-Färbung vernachlässigbare pathologische Veränderungen in allen getesteten Organen, und die TUNEL-Färbung zeigte keinen nekrotischen Zelltod in Hautschnitten. Obwohl die Blutuntersuchungsergebnisse am ersten oder dritten Tag nach der Injektion nur begrenzte Veränderungen der Blutplättchen, Neutrophilen und Monozyten zeigten, erholten sich alle am achten Tag. Diese Ergebnisse zeigten deutlich die biologische Sicherheit von PMCs (Ergänzungstabelle 4 und Ergänzungstabelle 5).

Tumortherapeutische Strategien basieren auf unserem Verständnis der Karzinogenesemechanismen. Während die somatische Selektion häufig als Hauptursache der Karzinogenese anerkannt wird, zielen umfangreiche Forschungsarbeiten auf die Entdeckung von Chemotherapeutika oder Physiotherapeutika zur Eliminierung mutierter Zellen ab7,47. Obwohl Millionen von Krebspatienten ihr Leben durch die Abtötung von Tumoren erfolgreich verlängert haben, sind Nebenwirkungen, Arzneimittelresistenz48 und Tumormetastasen49 zu erheblichen Hindernissen geworden. Dies hat ein Überdenken der Krebstherapiestrategien erforderlich gemacht. Es wurden erhebliche Forschungsinteressen geweckt, um hypoxische Tumormikroumgebungen zu verbessern. Eine Überdruckkammer ist eine herkömmliche Einrichtung in Kliniken zur Erhöhung des Blutsauerstoffgehalts. Es wurde 1775 von Joseph Priestley entdeckt, die erste therapeutische Anwendung erfolgte jedoch 150 Jahre später bei der Dekompressionskrankheit50. Anschließend wurden diese Einrichtungen auch für Herzchirurgie51, Infektionskrankheiten52 und Tumortherapien53 genutzt. Allerdings schränken die geringe Spezifität für das Zielgewebe und die geringe Effizienz von hyperbarem Sauerstoff seine Anwendung bei Krebspatienten ein53. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden Wirkstoffträger erforscht, die gezielt Sauerstoff in Tumore transportieren. Beispielsweise haben Liang et al. entwickelten O2@PFOB@PGL-Nanopartikel, die als prominente Sauerstoffreservoirs fungieren und hypoxischen Tumoren effektiv Sauerstoff zuführen könnten, um die photodynamische Therapie zu verbessern54. Nanopartikel auf Platinbasis könnten mit endogenem H2O2 reagieren, um O2 innerhalb der Tumorstelle zu erzeugen und die hypoxische Mikroumgebung für eine Kombinationstherapie zu verbessern55,56. Perfluorkohlenstoffe (PFCs), synthetische Materialien mit einer hohen Sauerstoffaufnahmekapazität, waren in der Lage, Sauerstoff in einer hypoxischen Tumormikroumgebung freizusetzen57. Allerdings könnten diese Ansätze lediglich vorübergehende O2-Ergänzungen bereitstellen. Hier haben wir eine intelligente Mikro-Sauerstofffabrik durch die Einkapselung von UCNPs und Algen in Mikrokapseln aufgebaut. Im Gegensatz zur beschriebenen Strategie zur Sauerstoffzufuhr nutzten die resultierenden PMCs NIR-Laser, um die Photosynthese von Algen zu steuern und eine langanhaltende Sauerstoffergänzung zu ermöglichen. Obwohl die NIRs täglich an Tieren angewendet werden, erreichte der pO2 in Tumoren 1 Stunde nach der NIR-Exposition Spitzenwerte (27,2–35,4 mmHg) und kehrte innerhalb von 24 Stunden wieder in den hypoxischen Zustand (10 mmHg) zurück. Die regelmäßige Sauerstoffergänzung kann Auswirkungen auf das Stoffwechselnetzwerk und die Phänotypen von Krebszellen haben, was in Folgestudien berücksichtigt werden sollte. In dieser Hinsicht kann ein langanhaltender Antagonismus hypoxischer Mikroumgebungen in Tumoren die Zellverdoppelung unterdrücken und das Fortschreiten des Tumors verlangsamen. Unsere Ergebnisse bei Kaninchen mit Hepatokarzinom-Tumoren stützten diese Hypothese, da keine tumortötenden Wirkstoffe enthalten waren. Bemerkenswerterweise waren von allen zehn getesteten Tieren zwei Kaninchen krebsfrei, da sie fünfmal länger lebten (>140 Tage) als die unbehandelten Tiere (durchschnittliche Überlebenszeit ~27 Tage) und keine nachweisbaren Tumorknoten aufwiesen. Diese Ergebnisse erfordern jedoch möglicherweise eine stärkere Validierung in verschiedenen Tumormodellen.

Obwohl eine Operation für 30–40 % der Krebspatienten in jedem frühen (Stadium 0) oder frühen (Stadium I) Stadium die erste Wahl ist58,59, können PMCs allein verabreicht werden oder synergistisch mit den Wirkungen der transarteriellen Chemoembolisation (TACE) wirken interventionelle, immunologische und zielgerichtete Therapien bei Krebspatienten im mittleren oder späten Stadium (>Stadium II), um eine lokale Kontrolle und Linderung zu erreichen. Die PMCs wurden bewusst so konzipiert, dass sie das interventionelle Gerät aufnehmen können. Obwohl die intratumorale Injektion für die Verabreichung von PMCs bei Tieren ausgewählt wurde, könnten PMCs bei menschlichen Patienten durch Transkatheter-Arterien-Chemoembolisation angewendet werden. Um zukünftige klinische Anwendungen zu erleichtern, sollten die Dosis und die Dauer der NIR-Strahlung sorgfältig untersucht werden. Am Beispiel eines Hepatokarzinoms wurden Kaninchen 60 Minuten pro Tag mit NIR-Strahlung von 900 mW/cm2 und einer Wellenlänge von 980 nm bestrahlt. Da die Tiefe des Hepatokarzinoms bei Kaninchen 0,3–0,7 cm beträgt, wurde der Tumor nach dem Eindringen in den Tierbauch einer Strahlung von 300–500 mW/cm2 ausgesetzt60. Um bei menschlichen Patienten eine solche Anregungsintensität zu erreichen, muss die Strahlendosis auf 2000 mW/cm2 erhöht oder die Dauer auf 180 Minuten verlängert werden, da Hepatokarzinome bei menschlichen Patienten oft tiefer liegen als bei Kaninchen61,62,63 und weil Die Intensität der NIR-Strahlung bei 980 nm würde nach dem Eindringen in 0,7–1,0 cm dickes Bauchgewebe beim Menschen auf <30 % sinken. Diese Menge an NIR-Strahlung kann jedoch zu Hyperthermieschäden führen. Alternativ wäre NIR-II-Strahlung bei 1200–1700 nm besser für klinische Anwendungen geeignet, da NIR-II-Photonen eine viel tiefere Eindringfähigkeit haben als NIR-Laser bei 980 nm64. UCNPs mit Anregungen im NIR-II-Bereich könnten genutzt werden, um PMCs für potenzielle Anwendungen in Kliniken zu konstruieren. Da die interventionelle Therapie eine konventionelle Behandlung bei Hepatokarzinompatienten ist, sind PMCs ein vielversprechendes Implantat für klinische Anwendungen.

Zusätzlich zum Hepatokarzinommodell untersuchten wir die Auswirkungen von PMCs bei Mäusen, die Brustkrebs tragen. Die Auswirkungen verschiedener Bestandteile in PMCs wurden umfassend untersucht. In Übereinstimmung mit den In-vitro-Ergebnissen (Abb. 3b) wurden therapeutische Wirkungen hauptsächlich bei Tieren beobachtet, die eine NIR-PMC-Behandlung erhielten (Ergänzende Abb. 26 und Ergänzende Abb. 27). Die Bioverteilung von PMCs in Tumoren wurde durch visuelle Beobachtung der Lumineszenz untersucht und ihre Positionen wiesen kaum Veränderungen auf (ergänzende Abbildung 28). Es wurde berichtet, dass Sauerstoff antitumorale Immunantworten aktiviert, beispielsweise die Differenzierung von M2-tumorassoziierten Makrophagen (TAMs) zu M165 und die Aktivierung von T-Zellen66 und NK-Zellen durch die Synthese von Superoxidradikalen67. Hatfield et al. schlugen die Eliminierung der Hypoxie/HIF-1α/Adenosin/A2AR-Achse durch sauerstoffanreichernde Wirkstoffe vor, um die Krebsimmuntherapie zu verbessern oder andere onkologische Behandlungen zu synergieren31,44. Unsere Studie zeigte, dass NIR-PMCs den Hypoxiestatus signifikant verbessern und die HIF-1α- und Adenosinproduktion in Krebszellsphäroiden und Brusttumoren hemmen können. Darüber hinaus könnte Hyperoxie durch NIR-PMCs die Effektorfunktion von T- und NK-Zellen im Hinblick auf die IFN-γ-Produktion und die zytolytische Kapazität in vitro neu beleben. Mit NIR-PMC behandelte Tumoren zeigten eine geringere A2AR-Expression, aber eine erhöhte CD4-Expression, was auf das Auftreten einer verstärkten krebshemmenden Immunantwort bei Brusttumoren schließen lässt. Die Kombination von NIR-PMCs mit Immun-Checkpoint-Inhibitoren zeigte erhebliche Überlebensvorteile bei Mäusen mit Brusttumoren. Diese Ergebnisse unterstützten nachdrücklich die vorgeschlagene Therapiestrategie von Hatfield et al.

Die Tumormetastasierung ist ein komplexer Prozess, bei dem es zur Ausbreitung von Krebs kommt. epithelial-mesenchymaler Übergang; und Invasion durch kollektive Migration, Krebszellzirkulation, Interaktion mit Immunzellen, metastatische Kolonisierung usw. Kürzlich wurde festgestellt, dass einige Biomoleküle, darunter FAT168, ribosomale Proteine69, das Transmembranprotein CCDC2570, Nrf271 und E-Cadherin72, das Fortschreiten der Metastasierung regulieren. Darüber hinaus wurde berichtet, dass Hypoxie als starker Faktor der Mikroumgebung mehrere Schritte (z. B. Invasion, Migration, Intravasation und Extravasation) innerhalb der Metastasenkaskade fördert1. Obwohl Tumormetastasen die Hauptursache für Behandlungsversagen bei Krebspatienten sind und für 90 % der krebsbedingten Mortalität verantwortlich sind73, gibt es nur wenige klinische Interventionen. Die in dieser Studie errichtete In-vivo-Sauerstofffabrik könnte jedoch möglicherweise bei der Krebsbehandlung zur Unterdrückung der Tumormetastasierung genutzt werden. PMC-Implantate verhinderten die Tumormetastasierung bei Modellen mit orthotopem Brustkrebs und transplantiertem Hepatokarzinom erheblich. Die von NIR-PMCs erzeugten hyperoxischen Mikroumgebungen können die Invasion von Krebszellen blockieren, indem sie Metastasierungssignale antagonisieren74.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir erfolgreich Sauerstofffabriken (PMCs) aufgebaut haben, indem wir Cyanobakterien und UCNPs in Alginat-Polylysin-Mikrokapseln eingekapselt haben. PMCs ermöglichten die Photosynthese unter NIR-Strahlung und sorgten in biologischen Kontexten für eine langanhaltende und kontrollierbare Sauerstoffversorgung. Das durch PMCs ergänzte O2 hemmte die HIF-1α-Produktion und die NF-κB-Aktivierung in Krebszellen und verhinderte die Vervielfältigung von Krebszellen auf ungiftige Weise drastisch. In vivo wurden hyperoxische Mikroumgebungen durch Implantationen von PMCs in orthotope Hepatokarzinome und Brusttumoren geschaffen und hemmten das Tumorwachstum und die Metastasierung erheblich. Ein starker synergistischer Effekt wurde bei Brustkrebs von Mäusen nachgewiesen, die gleichzeitig mit PMC-Implantaten und einem Checkpoint-Inhibitor (Anti-PD-1) behandelt wurden. Insgesamt zeigten unsere Ergebnisse die unterdrückende Wirkung der hyperoxischen Mikroumgebung auf das Fortschreiten des Tumors.

Antikörper für den Western-Blot in dieser Studie, einschließlich Anti-Phospho-IκBα (Kat. 9246) und Anti-IκBα (Kat. 4814), wurden von Cell Signaling Technology Inc. (Boston, MA, USA) erworben. 3-Methylladenin (HY-19312), MK-2206 (HY-10358), Rapamycin (HY-10219) und PD98059 (HY-12028) und IL-2 (HY-P7077) wurden von MedChemExpress (New Jersey, USA) gekauft. . Poly-L-Lysin (MW: 15.000–30.000, P4832), BMS-345541 (Kat. 401480), PMA (P1585) und Anti-β-Actin-Antikörper (A2066) wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri) erworben , USA). Anti-PD-1 wurde von BioXCell (BE0146, Libanon, USA) gekauft. MTS-Assay-Kits wurden von Promega (Madison, WI, USA) gekauft. Penicillin, Streptomycin, Trypsin-EDTA und Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) sowie RPMI-1640-Medium wurden von Hyclone Laboratory (South Logan, Utah, USA) gekauft. Anti-AKT (bsm-33278M) wurde von Bioss (Peking, China) gekauft. Anti-PI3K (AF6241) und Anti-Phospho-PI3K (AF3242) wurden von Affinity Biosciences (USA) bezogen. Insulin, Hoechst 33342, RIPA-Lysat, DCF-H, SYBR Green-Assay-Kit, LIVE/DEAD-Färbekit und Click-iT®EdU-594-Assay-Kit wurden von Thermo Fisher Scientific (Grand Island, NY, USA) erworben. Rekombinantes TNF-α-Protein (ab9642), EGF (ab9697), Anti-Phospho-AKT (ab38449), Anti-mTOR (ab134903), Anti-Phospho-mTOR (ab109268), Anti-ERK (ab32537) und Anti-Phospho- ERK (ab214036) wurde von Abcam (Shanghai, China) gekauft. 5-FU (F100149) wurde von Aladdin (Shanghai, China) gekauft. Das HIF-1-Alpha-Färbekit wurde von R&D (Minnesota, USA) gekauft. Golgi-Inhibitor (Kat. 554724), Cytofix/Cytoperm-Puffer (Kat. 554722), Perm/Waschpuffer (Kat. 554723) und Anti-IFN-γ-FITC (Kat. 554411) wurden von BD (Biosciences, Bedford, MA) erworben ). Anti-Maus-CD28-Antikörper (Kat. 102102) und Anti-Maus-CD3-Antikörper (Kat. 100302) wurden von Biolegend (Shanghai, China) gekauft. Das HypoxyprobeTM-1 Plus Kit wurde von HPI Inc. (Burlington, MA, USA) erworben. Das Annexin V-FITC/PI-Testkit für den apoptotischen Zelltod (abs50001) stammt von Absin Bioscience Inc (Shanghai, China). IL-15 (CLY200-07AF) wurde von Cedarlane (Kanada) gekauft. Xylazinhydrochlorid wurde von Shengda Animal Products Co., Ltd (Jilin, China) gekauft. Die PC-Membran Transwell-24 (Kat. 3422) und die Matrigel-Matrix wurden von Corning (New York, USA) bezogen. Das Wachstumsmedium für Blaualgenzellen (BG-11) wurde vom Institut für Hydrobiologie (Wuhan, China) erworben. Natriumalginat (Molekulargewicht 460 kDa; Molverhältnis von Mannuronsäure zu Guluronsäure 2/1) wurde von Qingdao Bright Moon Seaweed Group Co., LTD (Qingdao, China) gekauft. Upconversion-Nanopartikel (NaYREF4, RE: Yb, Er@NaYF4) wurden gemäß einer beschriebenen Methode75 synthetisiert. Alle anderen Reagenzien waren analysenrein.

Natürliche Synechocystis sp. 6803 (Katalog-Nr. FACHB-898), Synechococcus elongates 7942 (Katalog-Nr. FACHB-805), Scenedesmus obliquus (Katalog-Nr. FACHB-417) und Chlorella ellipsoidea (Katalog-Nr. FACHB-40), erworben vom Institut für Hydrobiologie ( Wuhan, China) wurden einer selektiven Evolution zur Akklimatisierung physiologischer Bedingungen durch schrittweise Abwechslung der Wachstumsbedingungen einschließlich Temperatur (25–37 °C) und Mediumzusammensetzung (BG11 bis DMEM) unterzogen. Die Kulturtemperatur und die Medienzusammensetzung wurden schrittweise geändert, um die Entwicklung von Mikroben zum Überleben unter physiologischen Bedingungen zu ermöglichen76,77,78. Im Detail wurden 3 ml Algenmikroben in der stationären Phase (1,0 × 108 Zellen/ml) in 10 ml BG11-Medium in Kolben mit Schikanen und belüfteten Deckeln (Katalog-Nr. 4116-0125, Thermo Fisher Scientific Inc.) in einem Schüttler dispergiert schrittweise Änderung des Kulturzustands. Als Kontrolle dienten bei 25 °C kultivierte Algenmikroben. Die Zellproliferation wurde mit Gl. berechnet. (1) durch Erfassung des optischen Dichtewerts bei 660 nm (OD660):

Dabei sind VAT und VmT die OD660-Werte von Algenmikroben bzw. Kulturmedien unter getesteten Bedingungen; VA und VM sind die OD660-Werte von Algenmikroben bzw. BG11-Medium bei normalen Kulturbedingungen (25 °C).

Sobald sich die Zellen an die getestete Temperatur angepasst hatten und eine Zellproliferation von >85 % zeigten, erhöhten wir die Kulturtemperatur (1 °C). Ansonsten haben wir die Temperatur noch weitere 24 Stunden aufrechterhalten. Nach 30-tägiger Kultur wurden die entwickelten Algenmikroben erfasst und für nachfolgende Tests in BG11-Medium bei 37 °C konserviert. Als nächstes wiederholten wir das obige Verfahren, indem wir die Mediumzusammensetzung schrittweise von BG11 auf DMEM änderten. Die entwickelte Synechocystis sp. 6803, kultiviert bei 37 °C in DMEM, wurde als eS bezeichnet. sp. 6803.

es. sp. 6803 wurde durch 10-minütige Zentrifugation bei 1000 × g (Centrifuge 5810 R, Eppendorf) in 50-ml-Röhrchen gesammelt und zur PMC-Konstruktion in PBS resuspendiert. Die suspendierten Zellen wurden mit UCNPs in den gewünschten Konzentrationen in 1,5 Gew.-%igen Natriumalginatlösungen gemischt. Nach dem Vortexen wurde die Mischung mit einem elektrostatischen Tröpfchengenerator durch eine 0,5-mm-Nadel in eine 0,1 M CaCl2-Lösung (Gelierbad) extrudiert, um Alginat-Ca-Perlen herzustellen. Die Perlen wurden 10 Minuten lang in 0,05 Gew.-% Polylysinlösung (Volumenverhältnis 1:10) eingeweicht, um eine Polylysinbeschichtung zu bilden. Die beschichteten Mikrokapseln wurden in 5 ml PBS suspendiert und unter einem Mikroskop gezählt. Alle frisch hergestellten PMCs wurden zur weiteren Verwendung im Beleuchtungsbrutschrank (HerryTech KE-200, Shanghai, China) bei 37 ° C kultiviert.

Die Morphologie und Größe der PMCs wurden durch Mikroskopie bestimmt (FV1200, Olympus, Tokio, Japan). Leere MCs, eS. sp. 6803@MCs und PMCs mit 3600/ml wurden in eine Kammer mit acht Vertiefungen gegeben, um die Photolumineszenzaktivitäten durch ein konfokales Upconversion-Mikroskop mit einem 20-fachen Objektiv bei 980-nm-Laseranregung zu bewerten. Photolumineszenzspektren von UCNPs wurden mit einem fluorimetrischen Analysator Edingbour NanoSpectralyzer (Applied NanoFluoreszenz, FLS980) gemessen. Um das Sauerstofffreisetzungsprofil zu ermitteln, wurden frisch hergestellte PMCs bei 3600/ml in 10 ml sauerstofffreiem Wasser suspendiert, das einer einstündigen Vakuumextraktion (1,45 × 10−3 psi) mit CO2-Rückfluss unterzogen wurde. Die PMC-Suspensionen (10 ml) in transparenten Eppendorf-Röhrchen wurden 0–60 Minuten lang einer Strahlung von 980 nm bei 0, 100, 300, 900 mW/cm2 ausgesetzt. Zur Aufzeichnung der gelösten Sauerstoffkonzentrationen wurde ein tragbares Messgerät für gelösten Sauerstoff (JPB-70A-Sauerstoffsensor, Qiwei Instrument Co., Ltd. Hangzhou, China) eingesetzt. Suspensionen, die UCNP@MCs enthielten, wurden ebenfalls als Leerwert einbezogen.

HCT116-, HepG2-, VX2-, MCF-7-, PANC-1-, MGC-803-, 4T-1-, HeLa- und A549-Zellen wurden von ATCC (USA) bezogen. In unserer Studie wurde eine STR-Analyse durchgeführt, um HeLa-Zellen zu authentifizieren. STR-Loci werden mithilfe fluoreszierend markierter PCR-Primer verstärkt, die die hypervariablen Regionen flankieren. Das Ergebnis zeigte, dass die in unserer Studie verwendeten HeLa-Zellen mit HeLa in ATCC übereinstimmten (Ergänzungstabelle 6). Yac-1-Zellen wurden von der National Collection of Authenticated Cell Caltures (Shanghai, China) erworben. MEF-Zellen (embryonale Mausfibroblasten) wurden von Dr. Sudan He (Suzhou Institute of Systems Medicine, Chinese Academy of Medical Science, China) gespendet. Primäre Herz- und Nierenzellen wurden von BALB/c-Mäusen gewonnen. Im Detail wurden präparierte Mäuseherzen und -nieren in kleine Stücke (<3 mm) geschnitten, ausreichend mit kaltem PBS (4 °C) gewaschen, um Blutzellen zu entfernen, und in Dissoziationsröhrchen mit 5 ml Arbeitslösungen von Herz- oder Nierendissoziationskits überführt ( Bio-leader Inc, Jiangxi, China). Die Röhrchen wurden auf der Hülse eines Gewebedissoziators (Bio-leader Inc, Jiangxi, China) befestigt und 1 Minute lang bei 100 g gemahlen (30 Sekunden an, 30 Sekunden aus), gefolgt von einer 60-minütigen enzymatischen Verdauung bei 37 °C. Die Zellsuspensionen wurden durch Filtration (70 μm) gesammelt. Die Herz- und Nierenzellpellets wurden gezählt und in Zellkulturmedien resuspendiert. Alle Zelllinien wurden in DMEM-Medium oder RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (Gemini, Woodland, USA), 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin, bei 37 °C, 5 % CO2 oder hypoxischen Bedingungen kultiviert ( 2 % O2 und 5 % CO2).

Die getesteten Zellen wurden zur Inkubation über Nacht in 96-Well-Platten mit 5 × 103/Well ausgesät, gefolgt von der Zugabe von 25 μl PBS, leeren MCs, UCNP@MCs und PMCs (25 μl, 3,6 × 104/ml). Die Zellen und PMCs wurden in einer angefeuchteten hypoxischen Atmosphäre mit 2 % O2 und 5 % CO2 bei 37 °C für 24 Stunden mit oder ohne 300 mW/cm2 NIR-Strahlung für drei Intervalle kultiviert. Nach Entfernung der Überstände und restlichen PMCs wurden Aliquots von 120 μl verdünnter MTS-Arbeitslösung in jede Vertiefung gegeben und weitere 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Überstände wurden zur Absorptionsdetektion bei OD 490 nm mit einem Microplate Reader (Synergy NEO HTS, Biotek, USA) in neue Platten (100 μl/Well) überführt. Die Zelllebensfähigkeit wurde durch Gl. bestimmt. 2:

wobei AN, AC und AB die Absorption des MTS-Substrats bei 490 nm in behandelten, unbehandelten Zellen bzw. Blindproben darstellen.

Die sortierten NK-Zellen (2 × 105 Zellen/Well) wurden zusammen mit fLuc-Yac-1-Zellen (Mauslymphom) im Verhältnis 1:1 oder 2:1 in Gegenwart oder Abwesenheit von PMCs kultiviert, gefolgt von drei Intervallen der NIR-Exposition. Nach 6-stündiger Inkubation wurden die Zellmischungen gesammelt, um Yac-1-Zellen mit 100 μl Glo-Lysepuffer (Kat. E266A, Promega, WI, USA) zu lysieren. Danach wurden 50 μl/Well One-Lite® Luciferase Assay System (Kat. DD1203-01, Vazyme, Nanjing, China) hinzugefügt, um die Lumineszenz von Zelllysaten in einem Mikroplatten-Lesegerät zu messen. Die Lumineszenz von Yac-1-Zellen wurde gemessen, um den Prozentsatz des Zelltods zu bestimmen, der zur Beurteilung der zytolytischen Aktivität von NK-Zellen verwendet wurde79. Der Prozentsatz des Zelltods wurde durch Gleichung bestimmt. 3:

wobei Io und Ilysat die Lumineszenzintensität von Zelllysat in unbehandelten bzw. gemeinsam mit NK-Zellen kultivierten Zellen darstellen.

Matrigel-Matrix (1,5 ml) wurde in einem Eisbad bei 4 °C aufgetaut und mit 0,5 ml HepG2- oder MCF-7-Zellsuspensionen (4 × 106 Zellen/ml in vorgekühltem DMEM) gemischt. Die Lösungen wurden vorsichtig gemischt, um die Entstehung von Luftblasen zu vermeiden. Aliquots von 300 μl Suspensionen wurden in vorgekühlte 24-Well-Platten oder konfokale 35-mm-Schalen gegeben. Die Platten oder Schalen wurden 30 Minuten lang bei 37 °C kultiviert, um die Matrix zu polymerisieren, gefolgt von der Zugabe von 1 ml DMEM auf die Oberseite des Gels in jeder Vertiefung/Schale zur weiteren Kultivierung. Reife Krebszellsphäroide wurden nach einer 7–10-tägigen Kultur erworben, sobald die Größe der Zellagglomerate > 50 μm betrug.

Die behandelten Sphäroide in Platten mit 24 Vertiefungen wurden einer Verflüssigung auf Eis mit der Zellrückgewinnungslösung (BD Biosciences, Bedford, MA) unterzogen. Zellsphäroide wurden durch 5-minütige Zentrifugation bei 500 × g gesammelt, mit PBS gewaschen und in PBS (50 μl) durch drei wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen in flüssigem Stickstoff lysiert. Frische Tumoren wurden gewogen und 50-mg-Proben wurden in 100 μl PBS bei 4 °C mit einem Homogenisator (OSE-Y30, TIANGEN, China) dissoziiert. Die homogenisierten Gewebelösungen und Zelllysate wurden 5 Minuten lang bei 500 × g zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Die Proteinkonzentrationen in den Überständen wurden mittels Bradford-Assay nachgewiesen. Die Lysate wurden zur Adenosin- oder Zytokinanalyse bei –20 ° C gelagert.

Eine Laserausrüstung (Xi'an Lei Ze Electronics Tech Co., Ltd, Shanxi, China) wurde verwendet, um NIR-Strahlung zum Antreiben der Photosynthese in PMCs durch einen 980-nm-Laser bei 0–900 mW/cm2 bereitzustellen. PMCs in 10-ml-Medium (PBS, BG11 oder DMEM) wurden in transparente Eppendorf-Röhrchen gegeben und 0–60 Minuten lang einem NIR-Laser mit 100–900 mW/cm2 ausgesetzt. Zellen und Sphäroide, die in Platten mit mehreren Vertiefungen oder konfokalen Schalen gezüchtet wurden, wurden drei Intervallen lang einer NIR-Strahlung von 300 mW/cm2 ausgesetzt (20 Minuten für jedes Intervall, 15 Minuten ein und 5 Minuten aus). Tumortragende Mäuse und Kaninchen wurden täglich drei Intervallen (20 Minuten für jedes Intervall, 15 Minuten an und 5 Minuten aus) mit 300 mW/cm2 bzw. 900 mW/cm2 NIR-Strahlung ausgesetzt.

Um die Sauerstofferzeugung in PMCs sichtbar zu machen, wurde das DCFH-Färbekit verwendet, um die Sauerstofferzeugung sichtbar zu machen. PMCs, eS. sp. 6803@MCs und UCNP@MCs bei 1500/Well wurden in 1 ml DMEM-Medium in einer 35-mm-Konfokalschale 12 Stunden lang im Dunkeln bei 37 °C kultiviert. Anschließend wurden die behandelten PMCs 10 Minuten lang mit 10 μg/ml DCFH inkubiert und dann 0, 1, 3 und 10 Minuten lang 300 mW/cm2 980 nm NIR-Strahlung ausgesetzt. Die Fluoreszenz von DCF wurde sofort durch konfokale Mikroskopie bei 488 nm Anregung sichtbar gemacht.

Zur Beurteilung des Hypoxiestatus wurden reife HepG2- und MCF-7-Zellsphäroide in konfokalen 35-mm-Schalen mit 1 ml frischem DMEM mit oder ohne PMC-Suspensionen (4500/ml in DMEM) kultiviert. Anschließend wurden die Sphäroide drei Intervalle lang einer NIR-Strahlung von 300 mW/cm2 ausgesetzt. Anschließend wurden die Sphäroide 12 Stunden lang bei 37 °C mit 100 μM Pimonidazolhydrochlorid inkubiert, mit PBS gewaschen und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 4 % Paraformaldehyd fixiert. Die Zellen in Sphäroiden wurden 1 Stunde lang mit 0,5 % Triton in PBS bei Raumtemperatur für 30 Min. Die gefärbten Zellen wurden zur mikroskopischen Bildgebung bei Anregungswellenlängen von 405 nm und 488 nm dreimal mit PBS gewaschen.

Für die Bildgebung neuer Tochterzellen wurden mit oder ohne 4500/ml PMCs vorbehandelte HepG2- und MCF-7-Zellen drei Intervallen NIR-Strahlung ausgesetzt. Die behandelten Zellen wurden 12 Stunden lang mit 1 ng/ml TNF-α oder 12 Stunden lang mit 40 μM BMS inkubiert. Danach wurden die Überstände durch 500 μl EdU-Arbeitslösung (10 μM) in einem Click-iT®EdU-594-Assay-Kit ersetzt. Nach einer weiteren 2-stündigen Kultur bei 37 °C wurden die Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 4 % Formaldehyd fixiert und 20 Minuten lang in 0,5 % Triton X-100 in PBS permeabilisiert. Nach Entfernung der Überstände und dreimaligem Waschen mit 3 % BSA wurde der Click-Reaktionscocktail, der 860 μL Reaktionspuffer, 40 μL CuSO4, 2 μL Azid 594 und 100 μL Click-Additiv-Lösung enthielt, frisch zubereitet und in die permeabilisierten Zellen gegeben. Nach 30-minütiger Reaktion bei Raumtemperatur wurde der Reaktionscocktail entfernt. Die Zellen wurden zweimal mit 3 % BSA in PBS gewaschen und mit 0,5 ml Hoechst 33342 (10 μg/ml) zur Kernfärbung inkubiert. Nach 10-minütiger Inkubation wurden die markierten Zellproben durch konfokale Mikroskopie (FV1200, Olympus, Japan) sichtbar gemacht.

HepG2-Zellen wurden in Platten mit 6 Vertiefungen in einer Dichte von 6 × 105 Zellen/Vertiefung ausgesät. Nach der Inkubation über Nacht wurden die Zellen drei Intervall-NIR-Strahlungen in Gegenwart oder Abwesenheit von 1,2 × 104/ml PMCs ausgesetzt, gefolgt von Inkubationen mit TNF-a (200 ng/ml), EGF (200 ng/ml) und Insulin ( 100 nM) für 10 Min. Danach wurden die Überstände durch frische Medien oder Medien, die Inhibitoren enthielten, für weitere Inkubationen ersetzt, einschließlich 20 µM BMS für 2 Stunden, 2 mM 3-Methyladenin für 1 Stunde, 4 µM MK-2206 für 4 Stunden, 100 nM Rapamycin für 4 Stunden oder 100 μM PD98059 für 2 Stunden. Nach ausreichendem Waschen mit PBS wurden Zellpellets gesammelt und in Lysepuffer (10 % Glycerin, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM Na3VO4, 1 % Triton X-100, 25 mM β-Glycerin) suspendiert. Phosphat, 0,1 mM Phenylmethansulfonylfluorid) mit 2 % Cocktail-Phosphatase-Inhibitoren (Kat.: P5726, Sigma) und 5 % Protease-Inhibitoren (Kat.: P5147, Sigma). Die Zellsuspensionen wurden 10 Sekunden lang verwirbelt und anschließend 30 Minuten lang auf Eis inkubiert, gefolgt von einer 20-minütigen Zentrifugation bei 2000 × g. Die Proteinkonzentrationen in den Überständen wurden durch den Bradford-Assay bestimmt und angepasst. Die Proben wurden auf 8–15 % SDS-PAGE-Gel (Beyotime, Shanghai, China) unter Verwendung von Tris-Glycin-SDS-Puffer als Laufpuffer im Mini-PROTEAN Tetra System (Bio-Rad, CA, USA) bei 100 V aufgetrennt bei 300 mA auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Die Membranen wurden mit 5 % Milch (Biofrox, Einhausen, Deutschland) in 0,1 % Tween 20/PBS bei Raumtemperatur für 2 Stunden blockiert und dann mit IκBα (1:1000), phosphoryliertem IκBα (1:1000), PI3K ( 1:500), phosphoryliertes PI3K (1:500), AKT (1:1000), phosphoryliertes AKT (1:1000), mTOR (1:10000), phosphoryliertes mTOR (1:10000), ERK (1:1000), phosphorylierte ERK- (1:1000) und β-Actin- (1:5000) Antikörper über Nacht bei 4 °C. Nach dreimaligem Waschen mit 0,1 % v/v Tween 20 in TBS (Waschpuffer) und Inkubation mit HRP-konjugiertem Sekundärantikörper (1:5000) für 2 Stunden bei Raumtemperatur waren die Membranen ausreichend gewaschen. Die frisch zubereitete überempfindliche ECL-Chemilumineszenzlösung wurde verwendet, um die Membranen mit einem mehrfarbigen Fluoreszenz-Chemilumineszenz-Bildanalysesystem (FluorChem M, Alpha, USA) abzubilden.

Sphäroid- (50 μl) und Tumorprobenlysate (100 μl), bestehend aus 0,1–0,4 mg Proteinen, wurden mit 1 ml vorgekühltem Methanol gemischt und 16 Stunden lang bei –20 °C inkubiert. Die Mischung wurde 10 Minuten lang bei 4 °C und 20.000 × g zentrifugiert, um die Proteinniederschläge zu entfernen. Die Metaboliten in den Überständen wurden mit N2 unter einem Druckgas-Blaskonzentrator (VSD150-2, Woxin Instrument Manufacturing Co., China) getrocknet und in 150 μl Puffer A (0,1 % Ameisensäure in entionisiertem Wasser) wieder aufgelöst. Es wurden auch Adenosinstandards hergestellt, die in Puffer A bei 0–1000 nM gelöst waren. Aliquots von 5 μl Proben wurden injiziert und in einer C18-Umkehrphasensäule (2,1 mm × 150 mm, 100 Å, 3,5 μm) aufgetrennt. Die LC-MS-Analyse wurde auf einem Agilent 1100 Series LC-System (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) in Verbindung mit einem LTQXL-Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) durchgeführt. Die mobile Phase wurde durch ein isokratisches System programmiert, das aus 70 % Puffer A und 30 % Puffer B (100 % ACN) bestand. Die Flussrate wurde bei 300 μl/min gehalten. Die MRM-MS-Detektion wurde im positiven Ionisationsmodus durchgeführt, um Daten zu sammeln. Die MS-Detektion wurde bei einer Quellenspannung von 3 kV und einer Kapillartemperatur von 350 °C durchgeführt. Die Hüll- und Hilfsgasdurchflussraten wurden auf 55 Arb bzw. 15 Arb eingestellt. Die MS-Daten wurden mit der Xcalibur-Software analysiert. Die Konzentrationen von Adenosin in den getesteten Proben wurden anhand der Standardkurve bestimmt.

Um zu untersuchen, ob die NIR-PMC-Behandlung apoptotischen Zelltod verursachte, wurden HepG-2-Zellen (5 × 105 Zellen/Vertiefung) in Platten mit sechs Vertiefungen ausgesät und 16 Stunden lang in DMEM kultiviert. Dann wurden die Überstände durch frisches Medium oder DMEM mit 500 µg/ml 5-FU oder PMCs bei 3600/Well ersetzt und drei Intervalle lang NIR ausgesetzt. Nach 24-stündiger Inkubation wurden die Zellen gesammelt und vor der Durchflusszytometrieanalyse mit einem Annexin V-FITC/PI-Färbekit gemäß dem Protokoll des Herstellers gefärbt.

Ein intrazellulärer Färbetest wurde durchgeführt, um die Wirkung der NIR-PMC-Behandlung auf die IFN-γ-Produktion von T-Zellen zu untersuchen. Mit CD3- und CD28-Antikörpern voraktivierte Maus-T-Zellen wurden in RPMI-1640, ergänzt mit 10 % FBS, resuspendiert und dann in den unteren Kammern von 24-Transwell-Platten (2 × 106 Zellen/Well, 2 ml) mit 50 ng/ml ausgesät PMA und 1 µL/ml Golgi-Inhibitor. PMCs wurden in die obere Kammer (3600/Well) mit einer Porengröße von 8,0 µm auf PC-Membranen gegeben. Dann wurden die gesamten Kulturen drei Intervallen lang NIR-Strahlung ausgesetzt. Nach 18 Stunden wurden die Zellen 5 Minuten lang bei 700 g zentrifugiert und die pelletierten Zellen wurden 30 Minuten lang in BD Cytofix/Cytoperm-Puffer fixiert. Die fixierten Zellen wurden einmal mit BD Perm/Waschpuffer (Kat. 554723, BD Biosciences) gewaschen und dann wurden die Zellen in BD Perm/Waschpuffer mit 5 µL/Test Anti-IFN-γ-FITC (Kat. 554411, BD Biosciences) zur Inkubation bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Nach dreimaligem Waschen in BD Perm/Wash-Puffer wurden die resuspendierten Zellen einer Durchflusszytometrie-Analyse (FACSVerse, BD) unterzogen. Die Datenanalyse wurde mit der FlowJo-Software (Tree Star Inc.) durchgeführt.

Weibliche BALB/c-Mäuse (6–8 Wochen alt, ~20 g) wurden vom Experimental Animal Center der Gempharmatech Co. Ltd in Nanjing, China, bezogen. Weibliche weiße Neuseeland-Kaninchen (6 Monate alt, 2–2,5 kg schwer) wurden von Qingdao Kangda Rabbit Co., Ltd. (Qingdao, China) bezogen. Alle Tiere wurden in einer Tierhaltung unter gefilterten Luftbedingungen (22–25 °C), einem 12-stündigen Dunkel-/Hell-Zyklus (8:00–20:00 Uhr hell, 20:00–8:00 Uhr dunkel) und relativer Luftfeuchtigkeit ( 40–70 %) in Kunststoffkäfigen mit sterilisierten Holzspänen als Einstreu. Alle Tierversuche wurden streng nach den Richtlinien des Chinesischen Rates für Tierpflege durchgeführt, die vom Tierpflegeausschuss der Labortiere der Universität Soochow genehmigt wurden (Nr. ECSU-202109A0401). Die genehmigten humanen Endpunkte wurden auf die tumortragenden Tiere angewendet, sobald sie eines der folgenden Kriterien erfüllten: (i) der Tumordurchmesser beträgt >2 cm bei Mäusen oder das Tumorvolumen beträgt >80 cm3 bei Kaninchen; (ii) das Essen, Trinken oder die Bewegung von Tieren wird stark beeinträchtigt. Um die hepatischen VX2-Tumoren bei Kaninchen zu entwickeln, wurden VX2-Zellsuspensionen (2 × 106 Zellen, 200 μl) in die Oberschenkelmuskulatur von Spenderkaninchen implantiert. Sobald die Tumorgröße > 2 cm betrug (ca. 2 Wochen), wurden die Spenderkaninchen durch intravenöse Injektion einer tödlichen Dosis von 2 ml/kg Xylazinhydrochlorid zur Entnahme von Tumorgewebe betäubt. Jeder Tumor wurde unter sterilen Bedingungen mit einer Augenschere in 1 mm3 große Stücke zerkleinert. Die Empfängerkaninchen wurden durch intramuskuläre Injektion von Xylazinhydrochlorid (250 μl/kg) anästhesiert. Ein zerkleinertes Gewebefragment wurde durch perkutane Punktionstechnik unter Führung eines 16-Schicht-CT-Spiralscans (Brilliance-16, Phillips, USA) direkt perkutan in das subkapsuläre Parenchym des linken Leberlappens des Empfängerkaninchens eingeführt. Die Kaninchen wurden gehalten und mittels CT-Bildgebung untersucht, bis das Tumorvolumen etwa 1 cm3 erreichte. Die Hepatokarzinom-tragenden Kaninchen mit ähnlicher Tumorgröße wurden durch Würfeln in zwei Gruppen eingeteilt, einschließlich der Vehikelkontrolle (n = 13) und der NIR-PMC-Gruppe (n = 13). Die Kaninchen wurden nach 14 Tagen für eine einzelne intratumorale Injektion von PMC-Suspensionen (500 µL, 3,6 × 104/ml) anästhesiert. Die Tiere wurden täglich in drei Intervallen (jeweils 20 Minuten) NIR-Strahlung mit 900 mW/cm2 ausgesetzt. Die Tumorgröße wurde alle zwei Wochen durch CT-Scanning (MHCT-Brillanz 16, Philips, Holland) überwacht.

Von Dr. Zhimou Yang (Nankai-Universität, Tianjin, China) gespendete fLuc-4T1-Zellen wurden in 100 μl PBS mit 2 × 108 Zellen/ml suspendiert und in die Brustfettpolster jedes Tieres injiziert. Die Tumorvolumina wurden alle 2 Tage untersucht und nach Gl. berechnet. 4:

Die mit 4T-1-Zellen inokulierten Mäuse wurden für weitere Behandlungen gesammelt, sobald die Tumorgröße etwa 50 mm3 erreichte. Alle qualifizierten Tiere wurden durch Würfeln für die folgenden Behandlungen zufällig in vier Gruppen eingeteilt, einschließlich intratumoraler Injektion von 25 μl Kochsalzlösung (Vehikel-Control), intratumoraler Injektion von 3,6 × 104/ml PMCs in 25 μl Kochsalzlösung gekoppelt mit 300 mW/cm2 NIR -Bestrahlung für drei Intervalle (15 Minuten in jedem Intervall) pro Tag (NIR-PMC-Gruppe), intravenöse Injektion von 10 mg/kg Anti-PD-1 (100 μl, zweimal pro Woche) (Anti-PD-1-Gruppe), und gleichzeitige Behandlung durch NIR-PMC und Anti-PD-1 (gemeinsame Behandlungsgruppe). Bemerkenswert ist, dass den Tieren in PMC-, NIR-PMC- und Co-Treatment-Gruppen am 7. Tag lediglich intratumoral PMCs injiziert wurden. Für die kombinierte Behandlung von Brustkrebs durch PMC-Implantate und Immuntherapie bei Mäusen wurde das detaillierte Tierbehandlungsverfahren in Abb. 5b dargestellt. Der Kombinationsindex (CI) von hyperoxischem (300 mW/cm2 NIR für drei Intervalle) und 10 mg/kg Anti-PD-1 (100 μl, zweimal pro Woche) wurde gemäß einer angegebenen Formel berechnet:

Dabei sind AB, A und B die Tumorvolumina bei NIR-PMC, Anti-PD-1 bzw. Co-Behandlungen. CI > 1 weist auf Antagonismus hin, CI = 1 auf Additivität und CI < 1 auf Synergie. Die Tumore wurden mit dem IVIS-Bildgebungsspektrumsystem (PerkinElmer, ME, USA) und einer Canon-Kamera (Japan) abgebildet. Die Mäuse wurden durch eine Überdosis Natriumpentobarbital (400 mg/kg) vollständig betäubt und getötet, um Tumore und Lungen zu sammeln. Die Gewebeproben wurden für Zytokin- und Adenosinmessungen in flüssigem Stickstoff gelagert oder für die H&E-Färbung oder Immunfärbung der A2AR-, CD4-, CD39-, CD206- und CD73-Expression fixiert.

Brustkrebstragende Mäuse mit einem Tumorvolumen von ~50 mm3 wurden durch Würfeln für die folgenden Behandlungen zufällig in fünf Gruppen eingeteilt, einschließlich der intratumoralen Injektion von 25 μl Kochsalzlösung (Vehikel-Control) und der 1-stündigen Verabreichung von 60 % hyperbarem Sauerstoff (Hyperbare O2-Gruppe). , intratumorale Injektion von 3,6 × 104/ml PMCs in 25 μl Kochsalzlösung (PMC-Gruppe), intratumorale Injektion von 3,6 × 104/ml leeren Mikrokügelchen in 25 μl Kochsalzlösung gekoppelt mit 300 mW/cm2 NIR-Exposition pro Tag (NIR-Gruppe) und intratumoral Injektion von 3,6 × 104/ml PMCs in 25 μl Kochsalzlösung gekoppelt mit 300 mW/cm2 NIR-Exposition pro Tag (NIR-PMC-Gruppe). In jeder Gruppe waren drei Tiere enthalten. Die Sauerstoffpartialdrücke (pO2) in Tumoren wurden in verschiedenen Tiefen mit einem Clark-Sensor (0,4 mm Durchmesser) auf einem pO2-Monitor (POG-203, Unique Medical, Tokio, Japan) bei 110 V gemäß dem Protokoll des Herstellers erfasst.

Zur Vorbereitung der Splenozyten wurden BALB/c-Mäuse (Alter: 6–8 Wochen; Gewicht: 20 g) durch CO2-Inhalation getötet, um Milzen zu sammeln. Die Milzen wurden in 10 ml 1640 RPMI-Medium (10 % fötales Rinderserum, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin) gemahlen. Die Mischung wurde durch eine 200-Mesh-Nylonmembran (Kat. 7061011, Dakewe, China) filtriert, um Gewebereste zu entfernen. Die Suspensionen wurden 5 Minuten lang bei 500 × g zentrifugiert (Allegra 64 R, Beckman), um Zellpellets zu sammeln, gefolgt von zweimaligem Waschen in PBS. Die Zellpellets wurden dispergiert und in 5 ml 1× RBC-Lysepuffer für rote Blutkörperchen (8,26 g/L NH4Cl, 1 g/L KHCO3 und 0,037 g/L EDTA in DI H2O) bei Raumtemperatur 5 Minuten lang inkubiert. Anschließend wurden RPMI-1640-Medien (5 ml) hinzugefügt, um die Lysereaktion zu stoppen, und zentrifugiert, um die Splenozyten zu sammeln, die zur Expansion von T-Zellen und NK-Zellen wie unten beschrieben verwendet wurden.

Zur Expansion von T-Zellen wurden die Anti-Maus-CD28- und CD3-Aktivierungsantikörper in PBS bei CD3 gelöst und in 6-Well-Platten (1,5 ml/Well) gegeben, um Well-Oberflächen 12 Stunden lang bei 4 °C zu behandeln. Anschließend wurden die Antikörperlösungen in jeder Vertiefung verworfen und die beschichteten Platten waren für die Expansion von T-Zellen aus Maus-Splenozyten bereit. Die Splenozyten, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, wurden in RPMI-1640-Medium bei 2 × 106/ml resuspendiert, in die mit CD28/CD3-Antikörpern beschichteten Platten gegeben (5 ml/Vertiefung) und 48 Stunden lang in Gegenwart von 200 IU/ml inkubiert. ml IL-2 zur Expansion der T-Zelle. Anschließend wurden die voraktivierten T-Zellen gesammelt und zur weiteren Prüfung der IFN-γ-Produktion in Platten mit 24 Vertiefungen (2 × 106/ml, 2 ml/Vertiefung) überführt.

Zur NK-Zellexpansion wurden die Splenozyten (2 × 106/ml, 5 ml/Vertiefung) in Gegenwart von 20 ng/ml Maus-IL-15 und 1000 IU/ml Maus-IL-2 in Platten mit sechs Vertiefungen gegeben. Die Zellmedien wurden alle 2 Tage gewechselt. Nach 7 Tagen wurden die resultierenden Zellen mit 1 μL/1 × 106 Zellen Anti-CD3-APC (Kat. 30041, Biolegend) und 1 μL/1 × 106 Zellen Anti-NK1.1-PE (Kat. 557391, BD) markiert Biowissenschaften) für 30 Min. Die gefärbten Zellen wurden gesammelt, um die NK1.1 + CD3-NK-Zellen mithilfe eines Durchflusszellsortierers (FACSMelody, BD) auszusortieren. Die sortierten NK-Zellen wurden zur weiteren Prüfung der zytolytischen Aktivität auf Platten mit 24 Vertiefungen übertragen.

Kaninchentumoren (20–30 mg) wurden mit 1 ml Trizol in Aufschlämmungsrohre gegeben, um das Tumorgewebe mit einem Homogenisator (PRO200, FLUKO, China) 2 Minuten lang zu dissoziieren, und dann 15 Minuten lang auf Eis gelegt, um die Zelllyse zu ermöglichen. Anschließend wurden die Überstände durch 15-minütige Zentrifugation bei 4 ° C und 6000 × g erhalten. Dann wurden 0,5 ml Überstand mit Chloroform (0,2 ml) gemischt und 2 Minuten lang oszilliert, um Nukleinsäure zu extrahieren. Nach 5-minütigem Schmoren auf Eis wurde die Mischung 15 Minuten lang bei 4 °C und 6000 × g zentrifugiert. Die obere wässrige Lösung (0,2 ml) wurde gesammelt und in ein neues RNase-freies Eppendorf-Röhrchen überführt. Den Überständen wurde Isopropanol (0,2 ml) zugesetzt und 15 Minuten bei 4 °C und 6000 × g zentrifugiert. Die Pellets wurden gesammelt und mit 75 %igem Ethanol gewaschen. Die resultierende RNA wurde in 20 μl Diethylpyrocarbonat (DEPC)-Wasser erneut gelöst, um die Konzentration mit einem Nanodrop 2000c-Spektrophotometer (Thermo Fisher, USA) bei OD 260 nm zu quantifizieren. Die PCR-Analyse wurde in Anhui Leaobei Biotechnology Co. LTD (Tongling, China) mit einem SYBR Green-Assay-Kit (Thermo Fisher, USA) unter einem Echtzeit-PCR-System (ABI-7300, USA) durchgeführt. Die Daten wurden mit der ABI Prism 7300 SDS-Software analysiert und die mRNA-Spiegel jedes Gens in zwei Gruppen (n = 3) wurden auf die von GAPDH normalisiert. Die verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt.

Gesunde BALB/c-Mäuse (Alter: 6–8 Wochen; Gewicht: 20 g) wurden durch Würfeln in drei Gruppen randomisiert. Die Tiere wurden für die Verabreichung von PMC-Suspensionen (25 μl, 3,6 × 104/ml) oder einem gleichen Volumen PBS am Tag 0 durch intraperitoneale oder subkutane Injektion anästhesiert. Tiere wurden täglich NIR-Strahlung mit 300 mW/cm2 ausgesetzt. Verhalten und Aussehen der Tiere wurden nach der Injektion regelmäßig überprüft. Die behandelten Mäuse wurden am 1., 3. und 8. Tag durch Inhalation von CO2 getötet, um Organe (Herz, Leber, Lunge, Niere, Gehirn, Milz und Haut) und Blut zu entnehmen. Die Organgewebe wurden für die H&E- oder TUNEL-Färbung fixiert. Die Blutproben (~ 400 μl pro Maus) wurden der Erkennung routinemäßiger Blutindikatoren mit dem Hämatologieanalysator Mindray BC-2800Vet (Mindray Global, China) unterzogen.

Alle Experimente wurden mindestens dreimal mit drei bis zehn Wiederholungen wiederholt. Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) von mindestens drei Replikaten ausgedrückt. Alle konfokalen Bildgebungs- und immunhistochemischen Färbungsbildgebungen wurden in mindestens drei Wiederholungen wiederholt. Die Datenanalyse wurde mittels zweiseitigem Student-t-Test oder Log-Rank-Test über die Software SPSS Statistics 17.0 durchgeführt. Der Unterschied wurde als statistische Signifikanz angesehen, wenn p < 0,05.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt. Die restlichen Daten sind in der Artikel-, Zusatzinformations- oder Quelldatendatei verfügbar. Die Bilddaten werden in einem öffentlichen Repository, Zenodo Dataverse, hinterlegt, indem Sie https://doi.org/10.5281/zenodo.6588765 folgen. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (21976126 an RL), der Natural Science Foundation der Provinz Jiangsu (BK20211545 an RL), des National Key R&D Program of China und des Ministry of Science and Technology of China (2020YFA0710700) unterstützt zu RL).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Weili Wang, Huizhen Zheng.

Staatliches Schlüssellabor für Strahlenmedizin und -schutz, Schule für radiologische und interdisziplinäre Wissenschaften (RAD-X), Kollaboratives Innovationszentrum für Strahlenmedizin der höheren Bildungseinrichtungen von Jiangsu, Suzhou Medical College, Soochow-Universität, Suzhou, Jiangsu, 215123, China

Weili Wang, Huizhen Zheng, Jun Jiang, Hui Wang, Jie Jiang, Qianqian Xie, Meng Gao und Ruibin Li

Abteilung für Interventionelle Radiologie, das erste angegliederte Krankenhaus der Soochow-Universität, Soochow-Universität, Suzhou, Jiangsu, 215001, China

Zhi Li

Institut für Blut- und Marktransplantation, Nationales klinisches Forschungszentrum für hämatologische Erkrankungen, Soochow-Universität, Suzhou, China

Dongpeng Jiang, Xiangru Shi und Jianhong Chu

School of Public Health, Suzhou Medical College, Soochow University, Suzhou, Jiangsu, 215123, China

Xiaoming Cai

Abteilung für Nanomedizin, Department of Medicine, California Nanosystems Institute, University of California, Los Angeles, CA, 90095, USA

Tian Xia

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RL hatte die Idee und entwarf die Experimente. WW führte die meisten Experimente durch. HZ und Ju.J. konstruierte die PMCs. HZ führte Zellproliferations-, HIF-1α-, qPCR-, neue Tochterzellbildgebungs- und Adenosinproduktionstests durch. ZL führte Experimente zur Tumorimplantation bei Kaninchen durch. Ju.J. führten Experimente zur Tumorimplantation bei Mäusen durch. DJ, XS und JC trugen zur Extraktion von T- und NK-Zellen sowie zum Aktivitätstest bei. HW und Ji.J. Getesteter Sauerstoffgehalt im Tumor. XC, QX quantifizierte den HIF-1α-Spiegel in Zellen und Tumoren. MG beteiligte sich am Zelllebensfähigkeitstest. TX brachte die Idee einer Immuntherapie in der Hyperoxie-Mikroumgebung ein. Das Schreiben des Manuskripts wurde von RL unter Beteiligung von WW geleitet

Korrespondenz mit Ruibin Li.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Wang, W., Zheng, H., Jiang, J. et al. Entwicklung von Mikrosauerstofffabriken, um das Fortschreiten des Tumors durch hyperoxische Mikroumgebungen zu verlangsamen. Nat Commun 13, 4495 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32066-w

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Eingegangen: 22. März 2022

Angenommen: 18. Juli 2022

Veröffentlicht: 02. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32066-w

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