Strukturelle Grundlagen der Ligandenbindungsmodi von menschlichem EAAT2

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 3329 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Im Zentralnervensystem (ZNS) vermitteln exzitatorische Aminosäuretransporter (EAATs) die Aufnahme des exzitatorischen Neurotransmitters Glutamat und halten seine niedrigen Konzentrationen im synaptischen Spalt aufrecht, um neuronale Zytotoxizität zu vermeiden. Eine Funktionsstörung der EAATs kann zu vielen psychiatrischen Erkrankungen führen. Hier berichten wir über Kryo-EM-Strukturen von menschlichem EAAT2 in einer nach innen gerichteten Konformation in Gegenwart des Substrats Glutamat oder des selektiven Inhibitors WAY-213613. Das Glutamat wird durch ausgedehnte Wasserstoffbrückenbindungen koordiniert und durch HP2 weiter stabilisiert. Der Inhibitor WAY-213613 besetzt eine ähnliche Bindungstasche wie das Substrat Glutamat. Bei der Assoziation mit WAY-213613 erfährt HP2 eine wesentliche Konformationsänderung und stabilisiert wiederum die Inhibitorbindung durch die Bildung hydrophober Wechselwirkungen. Elektrophysiologische Experimente verdeutlichen, dass das einzigartige S441 eine entscheidende Rolle bei der Bindung von hEAAT2 an Glutamat oder WAY-213613 spielt und der I464-L467-V468-Cluster als Schlüsselstrukturfaktor für die selektive Hemmung dieses Transporters durch WAY-213613 fungiert.

Glutamat ist der vorherrschende erregende Neurotransmitter, der eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung des Zentralnervensystems von Säugetieren spielt und an der normalen Gehirnfunktion beteiligt ist, beispielsweise an der Integration von Lernen, Kognition und Gedächtnis1. Außerdem kann ein Überschuss an Glutamat zu Exzitotoxizität führen, die neuronale Zellen durch übermäßige Stimulation von Glutamatrezeptoren abtöten kann2. Daher ist es wichtig, niedrige Glutamatkonzentrationen in extrazellulären Flüssigkeiten aufrechtzuerhalten. EAATs sind als erregende Aminosäuretransporter bekannt und umfassen fünf Subtypen (EAAT1–EAAT5), die für die Entfernung von Glutamat aus dem synaptischen Spalt verantwortlich sind, indem sie Glutamate schnell binden und zurück in die Präsynapse oder Astrozyten transportieren, was zur Termination beiträgt der synaptischen Aktivität und zur Clearance von potenziell zytotoxischem extrazellulärem Glutamat3. Unter den fünf EAATs wird menschliches EAAT2 (hEAAT2) überwiegend in Astrozyten exprimiert und soll für 90–95 % der Glutamataufnahme im Vorderhirn durch einen Aufzugsmechanismus verantwortlich sein3,4. Daher kann hEAAT2 das extrazelluläre Glutamat im synaptischen Spalt auf einem niedrigen Niveau halten, was eines der wichtigsten EAATs zum Schutz von Neuronen ist5,6. Ein Mangel an hEAAT2 führt zum fortschreitenden Absterben von Neuronen und zu psychiatrischen oder neurologischen Erkrankungen, einschließlich schwerer depressiver Störungen, Epilepsie, Alzheimer-Krankheit, Schlaganfall, Parkinson-Krankheit und amyotropher Lateralsklerose (ALS). Daher stellt hEAAT2 ein potenzielles therapeutisches Ziel dar6,7,8.

EAATs ähneln strukturell dem archaischen Homologen GltPh, bei denen es sich allesamt um Homotrimere handelt, die aus drei identischen Protomeren bestehen9,10. Das einzelne Protomer verfügt über acht Transmembranhelices (TM 1–8) und zwei Haarnadelschleifen (HP), die in zwei Domänen organisiert sind: Die Gerüstdomäne umfasst TM1, 2, 4 und 5, die für die Stabilisierung der Transportdomäne verantwortlich ist; Die Transportdomäne umfasst TM 3, 6, 7 und 8, HP1 und HP2. Frühere Studien haben gezeigt, dass die einzelne Untereinheit in EAATs das Substrat unabhängig transportieren kann11,12,13 und die Substratbindungsstelle besteht aus der zentralen abgewickelten Region von TM7 (NMDGT-Motiv), TM8 und den Spitzen von HP1 und HP23,9.

Die Strukturen archaeischer Homologer (GltPh4,9,10,14,15,GltTk16,17,18) und vier menschlicher SLC1-Transporter (hEAAT119, hEAAT320, hASCT121 und hASCT222,23,24,25) wurden gelöst und sie teilen sich Hohe Sequenzkonservierung in der Ligandenbindungstasche, einschließlich TM7, TM8, HP1 und HP2. Es ist jedoch immer noch wünschenswert, die Struktur von hEAAT2 zu bestimmen, da es geringe Sequenzidentitäten mit diesen Homologen aufweist (34 % Sequenzidentität mit GltPh und GltTk, 50 % Sequenzidentität mit hEAAT1 und hEAAT3, 42 % und 39 % Sequenzidentität mit hASCT1). bzw. hASCT2). WAY-213613 ist ein wirksamer und hochselektiver Inhibitor für hEAAT2 (IC50 beträgt 85 nM), der eine 59-fache bzw. 44-fache Affinität gegenüber denen von hEAAT1 und hEAAT3 (IC50 beträgt 5 bzw. 3,8 μM) aufweist26. Der Mechanismus, der WAY-213613 hochselektiv den Glutamattransport durch hEAAT2 hemmt, ist jedoch noch unklar.

Hier berichten wir über zwei Kryo-EM-Strukturen von trimerem hEAAT2 im Komplex mit Glutamat bzw. WAY-213613. Beide Strukturen werden mit einer Auflösung von 3,4 Å bestimmt und im nach innen gerichteten Konformationszustand stabilisiert. Diese Strukturen verdeutlichen die strukturellen Grundlagen, wie das Substrat von hEAAT2 erkannt wird und wie WAY-213613 den Transporter selektiv hemmt. Die elektrophysiologischen Experimente wurden durchgeführt und bestätigten unsere Vermutungen.

Zusätzlich zur Vermittlung des exzitatorischen Aminosäuretransports fungiert hEAAT2 auch als anionenselektiver Kanal27,28,29. Der hEAAT2-assoziierte Strom umfasst drei Komponenten: Glutamat-induzierter Anionenstrom, Na+-abhängiger Anionenleckstrom und Glutamat-Transportstrom30,31. Die kompetitiven Inhibitoren können alle drei Komponenten des Stroms blockieren32. Um mehr Einblicke in die Bindungsstellen von Glutamat und Inhibitoren zu erhalten, führten wir elektrophysiologische Experimente mit der Ganzzell-Patch-Clamp-Technik unter ähnlichen Bedingungen wie den zuvor beschriebenen durch25. In Übereinstimmung mit den vorherigen Berichten 25, 31, 33 erhöhte die Anwendung von Substratglutamat die Amplituden der Anionenleckströme (ergänzende Abbildung 1a). Im Gegensatz dazu konnte WAY-213613 die Anionenleckleitfähigkeit blockieren (ergänzende Abbildung 1b). Die Aktivierung von Anionenleckströmen, die durch Glutamat vermittelt werden, und die Hemmung dieser Anionenleckströme durch WAY-213613 waren beide dosisabhängig und konnten in eine Michaelis-Menten-Gleichung eingepasst werden, was einen Km von 30 ± 2,5 μM für Glutamat und einen scheinbaren Ki ergab von 0,07 ± 0,03 μM für WAY-213613 (Abb. 1a, b), was beides mit früheren Berichten übereinstimmt26,34.

a Glutamat-Dosis-Wirkungs-Beziehung für hEAAT2-assoziierten Strom in Gegenwart von 3 μM, 10 μM, 30 μM, 100 μM, 300 μM und 1000 μM Glutamat. Die getesteten Probengrößen (n) von niedrigen bis hohen Konzentrationen betragen 5, 5, 5, 5, 5 und 8 Zellen. Die Linien stellen die beste Anpassung an eine Michaelis-Menten-ähnliche Gleichung mit einem durchschnittlichen scheinbaren Km von 30 ± 2,5 μM für Glutamat dar. Die Ströme wurden auf den maximalen Strom normalisiert, der nach der Anwendung von 1000 μM Glutamat aufgezeichnet wurde. b WAY-213613 Dosis-Wirkungs-Beziehung für hEAAT2-assoziierten Strom in Gegenwart von 0,01 μM, 0,03 μM, 0,1 μM, 0,3 μM, 1 μM, 3 μM und 30 μM WAY-213613. Die getesteten Probengrößen (n) von niedrigen bis hohen Konzentrationen betragen 5, 5, 5, 5, 5, 5 und 10 Zellen. Die Linien stellen die beste Anpassung an eine Michaelis-Menten-ähnliche Gleichung mit einem durchschnittlichen scheinbaren Ki von 0,07 ± 0,03 μM für WAY-213613 dar. Die Ströme wurden auf den maximalen Strom normalisiert, der nach der Anwendung von 30 μM WAY-213613 aufgezeichnet wurde. In den Abbildungen a und b wurden alle Experimente bei 0 mV durchgeführt und die Daten als Mittelwerte ± SD dargestellt. c Cartoon-Darstellung des hEAAT2-Homotrimers aus der Sicht des Zytoplasmas. Durchgezogene Linien unterteilen das Homotrimer in drei einzelne Protomere und gestrichelte geschwungene Linien beschreiben die Transportdomäne jedes Protomers. Jedes Protomer besteht aus der Gerüstdomäne (Weizen) und der Transportdomäne (hellgrün). Die Strukturelemente HP1 (blau) und HP2 (rot) sind hervorgehoben. Sofern nicht ausdrücklich darauf hingewiesen wird, wird im gesamten Manuskript das gleiche Farbschema übernommen. d Struktur eines einzelnen Protomers, gesehen von der Membranebene. Die Transportdomäne sowie HP1 und HP2 werden als Cartoon dargestellt, während die Gerüstdomäne als Zylinder dargestellt wird. In den Abbildungen c und d sind die Grenzen der Zellmembran durch graue Linien dargestellt und neben den Pfeilen sind Dimensionsinformationen angegeben.

Um die Strukturmerkmale von hEAAT2 aufzuklären, haben wir das Wildtyp-hEAAT2 in HEK293-Zellen exprimiert und gereinigt (ergänzende Abbildung 1c). Die Kryo-EM-Studien wurden in Gegenwart des Substrats Glutamat und des Inhibitors WAY-213613 durchgeführt und erzeugten zwei 3,4 Å-Karten (Ergänzende Abbildungen 2, 3 und Ergänzungstabelle 1). hEAAT2 hat eine Homotrimerstruktur, die anderen EAATs (hEAAT119 und hEAAT320) und seinen Orthologen (hASCT121 und hASCT222,23,24,25) oder Paralogen (GltPh4,9,10,14,15 und GltTk16,18) ähnelt. Jede Untereinheit des hEAAT2-Trimers verfügt über acht Transmembranhelices (TM1–TM8) und ein Paar halbe Transmembranspiralhaarnadeln (HP1, HP2) (Abb. 1c, d). Diese Sekundärstrukturen fügen sich zu einer Gerüstdomäne (TM1, 2, 4, 5 und zwei extrazelluläre Beta-Faltblatt-Inserts in TM4b und TM4c) bzw. einer Transportdomäne (TM3, 6–8 und HP1, HP2) zusammen. Jede der beiden Domänen weist eine erkennbare interne Doppelsymmetrie auf. Die Gerüstdomäne jedes einzelnen Protomers verbindet sich mit denen der anderen beiden Protomere, was eine ziemlich stabile Integration im zentralen Teil des Homotrimers darstellt. Und die Transportdomäne ist durch eine eigene Gerüstdomäne getrennt und wie ein gleichseitiges Dreieck verteilt (Abb. 1c). In unseren hEAAT2-Strukturen liegt HP1 ungefähr parallel zur Membranebene und ist fast vollständig im Zytoplasma exponiert (Abb. 1d). Das Gegenstück HP2 ist in die Lipiddoppelschicht eingebettet und die HP2-Spitze ist von der zytoplasmatischen Seite aus lösungsmittelzugänglich (Abb. 1d). Das hEAAT2 hat eine Länge von ~97 Å und eine Breite von ~100 Å entlang der Normalen zur Membranebene und ~70 Å entlang der Membrannormalen (Abb. 1c, d).

Aufgrund der hohen Auflösung zweier aufgelöster Strukturen von hEAAT2 wurden viele streifenförmige Dichten beobachtet, die sich um das Protein verteilten (ergänzende Abbildung 4a, b). Die am häufigsten vorkommenden Lipide befinden sich zwischen den beiden benachbarten Untereinheiten des hEAAT2-Trimers, was der Verteilung der Lipide in den Strukturen von hASCT2 (6RVX)23 oder GltPh (6 × 15)14 ähnelt. Während der Vorbereitung von hEAAT2-Proben stellten wir fest, dass CHS einen erheblichen Einfluss auf die Homogenität und das SEC-Profil von hEAAT2 hat, wie in einem ähnlichen Szenario in hASCT220 berichtet. Tatsächlich wurde festgestellt, dass sich CHS-ähnliche Dichten in dem von TM3, TM6 und TM8 gebildeten Hohlraum im Innenlappen der Plasmamembran befinden (ergänzende Abbildung 4c, d), was auch in den Karten von hEAAT335 und GltPh14 gefunden wurde (6S3Q bzw. 6 × 15), was darauf hindeutet, dass Cholesterin möglicherweise mit dem Aufbau oder der Funktion von SLC1-Transportern und ihren Homologen korreliert.

Säugetier-EAATs transportieren L-Glutamat, L-Aspartat und D-Aspartat mit scheinbar mikromolaren Affinitäten3. Um zu verstehen, wie hEAAT2 an Glutamat bindet, haben wir die Struktur von hEAAT2 im Komplex mit dem Glutamat (hEAAT2Glu) mit einer Auflösung von 3,4 Å bestimmt (ergänzende Abbildung 2). In der hEAAT2Glu-Struktur wird das Glutamat durch die Spitzen der HP1- und HP2-Schleifen versiegelt (Abb. 2a, b). Unter Verwendung der Gerüstdomäne als Referenz führten wir einen Strukturvergleich zwischen den nach außen gerichteten hEAAT1Asp- (PDB-ID: 5LLU)19 und den hEAAT2Glu-Strukturen durch und stellten fest, dass die Transportdomäne der hEAAT2Glu-Struktur um ~17 Å über die Membran in Richtung Zytoplasma verschoben ist Seite relativ zu der von hEAAT1Asp, was darauf hindeutet, dass die hEAAT2Glu-Struktur in einer nach innen gerichteten Konformation bestimmt wird (ergänzende Abbildung 5). Eine solche Konformationsänderung der Transportdomäne steht auch im Einklang mit früheren Beobachtungen24. An der Stelle hochkonservierter polarer Reste aus einer abgewickelten Region von TM7 (NMDGT-Motiv10) bildet das amphipathische TM8 eine breite Palette starker Wechselwirkungen (hauptsächlich Wasserstoffbrückenbindungen) mit Glutamat, um dessen Bindung an hEAAT2 zu stabilisieren (Abb. 2a). Insbesondere bildet die α-Carboxylgruppe des Substrats Glutamat Kontakte mit den Seitenketten von T479TM8 und N482TM8 und dem Hauptketten-N von S364HP1 in der Spitze von HP1. Die Aminogruppe des Substrats Glutamat ist nur mit der Carboxylgruppe von D475TM8 koordiniert. Die δ-Carboxylgruppe des Substrats Glutamat interagiert mit den Seitenketten von T401TM7 und R478TM8 (Abb. 2c, d). Im Vergleich zu eukaryotischen Homologen (hEAAT119, hEAAT320, hASCT222) und prokaryotischen Homologen (GltPh14, GltTk17) sind Schlüsselreste, die an der Substratbindung beteiligt sind, zwischen hEAAT2 und den oben genannten Homologen hoch konserviert (ergänzende Abbildung 6). Allerdings wird R478TM8 im hEAAT2 an der entsprechenden Position im neutralen Aminosäuretransporter hASCT2 durch C467TM8 ersetzt (ergänzende Abbildung 6e), was zur Substratselektivität von hASCT2 für neutrale Aminosäuren 20 beiträgt. Um die Glutamat-Bindungsstelle zu validieren, haben wir D475TM8 und R478TM8 getrennt zu Alanin mutiert (D475ATM8 und R478ATM8). Elektrophysiologische Experimente zeigten, dass Glutamat die Anionenströme dieser beiden Mutanten bei einer Glutamatkonzentration von bis zu 1 mM im Vergleich zu der von Wildtyp-hEAAT2 nicht aktivierte (Abb. 2e und ergänzende Abb. 7a – c). Um die Möglichkeit auszuschließen, dass eine Mutation in einem der Reste die Aktivität von hEAAT2 als Anionenkanal stören könnte, haben wir auch die hemmende Wirkung von WAY-213613 auf die Anionenströme dieser beiden Mutanten getestet. Infolgedessen konnten beide Mutanten, D475ATM8 und R478ATM8, immer noch einen nach innen gerichteten Anionenstrom vermitteln, was durch einen scheinbaren nach außen gerichteten Strom belegt wird, der durch WAY-213613 induziert wird, obwohl der scheinbare Ki von WAY-213613 für D475ATM8 auf 30,48 μM und 1,68 μM reduziert wurde bzw. R478ATM8 (Abb. 2f und ergänzende Abb. 7e, f). Daher spekulieren wir, dass die Reste D475TM8 und R478TM8 für die Bindung von hEAAT2 an Glutamat entscheidend sind und möglicherweise auch an der Bindung dieses Transporters an WAY-213613 beteiligt sind.

a Gesamtstruktur des hEAAT2Glu-Homotrimers mit Glutamat (farbige Kugeln), gesehen von der Membranebene. b Schneiden Sie durch die molekulare Oberfläche eines einzelnen Protomers von hEAAT2Glu und zeigen Sie Glutamat (Stäbchen) und seine EM-Dichte (blaues Netz). c Detaillierte Bindungsstelle für Glutamat (gelb) mit seinen wichtigsten interagierenden Resten (Stäbchen). d 2D-Diagramm, das die Wechselwirkungen von Glutamat mit seinen umgebenden Resten durch LigPlot+ darstellt. e Vergleich der Glutamat-bezogenen Stromdichten zwischen den getesteten Mutanten und Wildtyp-hEAAT2. Die Ströme wurden bei 1000 μM Glutamat aufgezeichnet und dargestellt, nachdem der Na+-abhängige Leckstrom abgezogen wurde. Die auf Wildtyp-hEAAT2, D475ATM8 oder R478ATM8 getesteten Probengrößen (n) betragen 5, 4, 5 Zellen. Auf die einfache ANOVA folgte der Bonferroni-Post-hoc-Test, ****P < 0,0001. f WAY-213613 Dosis-Wirkungs-Beziehungen für die durch D475ATM8, R478ATM8 oder S441GHP2 vermittelten Ströme. WAY-213613 wurde in den folgenden Konzentrationen variiert: 0,3 μM, 1 μM, 3 μM, 10 μM, 30 μM und 100 μM für D475ATM8 und R478ATM8; 0,03 μM, 0,1 μM, 0,3 μM, 1 μM, 3 μM, 10 μM und 30 μM für S441GHP2. Die Ströme wurden auf den maximalen Strom normalisiert, der nach der Anwendung von 30 μM oder 100 μM WAY-213613 aufgezeichnet wurde. Die getesteten Probengrößen (n) von niedrigen bis hohen Konzentrationen sind wie folgt aufgeführt: n = 4, 5, 5, 5, 5 und 9 Zellen für D475ATM8; n = 5, 5, 5, 4, 5 und 12 Zellen für R478ATM8; n = 4, 4, 4, 5, 5, 4 und 7 Zellen für S441GHP2. Die Linien stellen die besten Anpassungen an eine Michaelis-Menten-Gleichung dar. Die Daten von Wildtyp-hEAAT2 aus Abb. 1b wurden mit denen der getesteten Mutanten verglichen. g Strukturvergleich der Transportdomänen zwischen hEAAT2Glu (blassgrün) und hEAAT3Apo (PDB-ID: 6X3F, grau). h Glutamat-Dosis-Wirkungs-Beziehung für die S441GHP2-vermittelten Ströme bei den verschiedenen Konzentrationen von 0,1 μM, 0,3 μM, 1 μM, 3 μM, 10 μM und 30 μM. Die Linien stellen die beste Anpassung an eine Michaelis-Menten-Gleichung mit einem durchschnittlichen scheinbaren Km von 0,40 ± 0,03 μM dar. Die Ströme wurden auf den maximalen Strom normalisiert, der nach der Anwendung von 30 μM Glutamat aufgezeichnet wurde. Die getesteten Probengrößen (n) von niedrigen bis hohen Konzentrationen betragen 4, 5, 5, 5, 12 und 5 Zellen. In den Abbildungen e, f und h wurden alle Experimente bei 0 mV durchgeführt und die Daten wurden als Mittelwerte ± SD dargestellt.

Im Vergleich zu nach innen gerichtetem hEAAT3 im Apo-Zustand (PDB-ID: 6X3F)20 stellten wir fest, dass sich HP2 im hEAAT2Glu-Komplex deutlich zur intrazellulären Seite verschiebt, wenn Glutamat gebunden wird (Abb. 2g), was das Entweichen von Substrat verhindern würde. Diese Konformation wird durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen HP2 und umgebenden Helices stabilisiert. D475TM8 ist nicht nur direkt an der Glutamatbindung beteiligt, sondern kann auch eine Wasserstoffbindung mit dem Grundstickstoff von S444HP2 aus dem HP2 bilden, was zur Nahaufnahme der HP2-Spitze beiträgt (Abb. 2g). Darüber hinaus interagieren die Rückgrat-Carbonylgruppe und die Seitenkette von S441HP2 mit den Seitenketten von S363HP1 bzw. A394TM7 (Abb. 2g). Zusammengenommen sind drei Wasserstoffbrückenpaare, darunter D475-S444, S363-S441 und S441-A394, entscheidend dafür, dass HP1 und HP2 nahe beieinander bleiben. Interessanterweise ist S441HP2 nur im hEAAT2 vorhanden und an der entsprechenden Position jedes Homologen durch einen konservierten Glycinrest ersetzt (ergänzende Abbildung 8). Um die funktionelle Rolle von S441HP2 zu untersuchen, ersetzten wir diesen Rest durch Glycin (S441GHP2) und führten elektrophysiologische Aufzeichnungen durch Anwendung verschiedener Glutamatkonzentrationen durch. Bemerkenswerterweise stellten wir fest, dass die S441GHP2-Mutante eine höhere Empfindlichkeit gegenüber Glutamat aufweist, wobei der Km-Wert bei 0,40 ± 0,03 μM liegt (Abb. 2h und ergänzende Abb. 7d), was jedoch um das etwa 77-fache höher ist als bei Wildtyp-hEAAT2 Das S441HP2 ist nicht direkt an der Glutamatbindung beteiligt (Abb. 2c, d). Dieser Rest ist ausschließlich im hEAAT2 vorhanden, verglichen mit dem konservierten Glycin an der entsprechenden Position in anderen Homologen (ergänzende Abbildung 8). Wir spekulieren, dass der einzigartige Rest S441HP2 wahrscheinlich zusätzliche Wechselwirkungen bereitstellt, um HP2 bei einer versiegelten Bestätigung zu stabilisieren und die Glutamatfreisetzung von der intrazellulären Seite zu verhindern. Somit könnte eine Mutation im S441HP2 diese Wechselwirkungen unterbrechen, die Glutamatfreisetzung erleichtern, den Glutamataufnahmezyklus beschleunigen und folglich den hEAAT2 in Richtung eines Kanals mit höherer Offenheitswahrscheinlichkeit verschieben. Der scheinbare Ki von WAY-213613 für die Mutante S441GHP2 wurde auf 0,26 μM reduziert (Abb. 2f und ergänzende Abb. 7g), was darauf hindeutet, dass diese Stelle auch die Bindung des Inhibitors in gewisser Weise beeinflusst.

WAY-213613 zeigt eine hohe Selektivität für hEAAT2, daher ist es wünschenswert, seine Spezifitätsunterschiede zwischen hEAATs zu untersuchen. Um den Hemmmechanismus von hEAAT2 durch WAY-213613 zu untersuchen, haben wir mit diesem Inhibitor eine komplexe Struktur von hEAAT2 mit einer Auflösung von 3,4 Å bestimmt (Abb. 3a und ergänzende Abb. 3). Das WAY-213613 besteht aus drei funktionellen Gruppen, darunter Bromfluorphenol-, Anilin- und Asparagingruppen (Abb. 3b). Diese komplexe Struktur nimmt eine nach innen gerichtete Konformation an. An der Glutamat-Bindungsstelle nahe der zytoplasmatischen Seite der Membran wird eine zusätzliche Dichte identifiziert, die gut mit dem Inhibitor WAY-213613 kompatibel ist (Abb. 3b). Im Folgenden bezeichnen wir das an WAY-213613 gebundene hEAAT2 als hEAAT2W-Komplex. Die an der Stabilisierung des Inhibitors WAY-213613 beteiligten Wechselwirkungen bestehen aus hydrophoben Wechselwirkungen und Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem Inhibitor und seinen umgebenden Resten (Abb. 3c, d). Genauer gesagt bildet die α-Carboxylgruppe von WAY-213613 Kontakte mit dem Rückgrat-Stickstoff und der Seitenketten-Hydroxylgruppe von S364HP1. Die Aminogruppe von WAY-213613 ist mit der Seitenketten-Carboxylgruppe von D475TM8 koordiniert (Abb. 3c). Darüber hinaus bildet R478TM8 nicht nur eine Salzbrücke mit D475TM8, sondern auch zwei Kation-π-Wechselwirkungen mit Y404TM7 und der Anilingruppe von WAY-213613 (Abb. 3c). Diese strukturellen Beobachtungen werden auch durch die Funktionsanalyse gestützt, dass die Mutanten D475ATM8 und R478ATM8 im Vergleich zu Wildtyp-hEAAT2 deutlich verringerte Bindungsaffinitäten mit WAY-213613 aufwiesen (Abb. 2f). Darüber hinaus ist die Bromfluorphenolgruppe in einen hydrophoben Hohlraum eingeschlossen, der durch die hydrophoben Reste I464TM8, L467TM8, V468TM8, M450HP2 und L447HP2 gebildet wird (Abb. 3c). Die Bromfluorphenolgruppe wird auch durch Bildung einer π-π-Stapelwechselwirkung mit Y404TM7 in einer T-förmigen Konfiguration stabilisiert (Abb. 3c). In der Kryo-EM-Karte des hEAAT2W-Komplexes wurde festgestellt, dass ein DDM-ähnliches Molekül zwischen TM1 und der abgewickelten Helix von TM8 liegt. Sein hydrophober Schwanz zeigt zur extrazellulären Seite. Die Kopfgruppe ist proximal zur Bromfluorphenolgruppe positioniert und bildet hydrophobe Wechselwirkungen, um die WAY-213613-Bindung zu stabilisieren (ergänzende Abbildung 4b, e). Daher spekulieren wir, dass ein Lipidmolekül in der Membranumgebung die Bindungsposition des DDM einnehmen und an den hemmenden Wirkungen des Glutamattransports durch WAY-213613 beteiligt sein könnte.

a Gesamtstruktur von hEAAT2W aus der Membranebene betrachtet. WAY-213613 wird als Kugeln dargestellt. b Schneiden Sie durch die molekulare Oberfläche eines einzelnen Protomers von hEAAT2W. Der WAY-213613 wird in Stäbchen dargestellt und seine entsprechende EM-Dichte wird in einem blauen Netz angezeigt. c Detaillierte Bindungsstelle für WAY-213613 in hEAAT2W. Der Inhibitor WAY-213613 (rosa) und die Reste der Schlüsselinteraktion sind als Stäbchen dargestellt; Die hydrophoben Reste der Bindungstasche werden als halbtransparente Kugeln dargestellt. d 2D-Diagramm, das die Wechselwirkungen von WAY-213613 mit seinen umgebenden Resten durch LigPlot+ darstellt. e Konformationsänderungen der Glutamat-Bindungsstelle zwischen hEAAT2W (hellgrün) und hEAAT2Glu (grau). Der HP2 von hEAAT2W ist rot hervorgehoben und schwarze Pfeile zeigen die Verschiebung des HP2 an.

Wir haben auch die Strukturen von hEAAT2Glu und hEAAT2W überlagert (Abb. 3e). Da ein Teil von WAY-213613 von Asparagin abgeleitet ist, war es nicht überraschend, dass der Inhibitor parallel zur Situation der Glutamatbindung ähnliche Wasserstoffbrückenbindungen ausbildet. Die α-Carboxyl- und α-Aminogruppen von WAY-213613 oder Glutamat werden durch denselben Cluster von Resten von TM8 und der HP1-Spitze koordiniert, wie z. B. D475TM8 und S364HP1 (Abb. 2c, 3c). Bei der Bindung von WAY-213613 interagiert jedoch die hydrophobe Bromfluorphenolgruppe des Inhibitors mit hydrophoben Resten von HP2, wie M450HP2 und L447HP2, und treibt folglich HP2 von der HP1-Spitze weg und öffnet die HP2-Spitze. Die HP2b-Spirale erfährt eine nach außen gerichtete Drehung mit einem Winkel von etwa 22°, und die HP2-Spitze weist eine Abstandsänderung von ~8,0 Å auf (Abb. 3e). Aufgrund der Bewegung von HP2 können die Reste S441HP2 und S444HP2 an der HP2-Spitze keine Wasserstoffbrückenbindungen mit der HP1-Spitze bzw. TM8 bilden, die in der Glutamat-gebundenen hEAAT2-Struktur vorhanden sind (Abb. 2g). Stattdessen bildet die Hydroxygruppe S441HP2 eine Wasserstoffbindung mit der Carbonylgruppe von T395TM7 und stabilisiert so den WAY-213613-gebundenen Zustand (Abb. 3c). Dies steht im Einklang mit der oben erwähnten Funktionsanalyse, dass die S441GHP2-Mutation die Empfindlichkeit von hEAAT2 gegenüber WAY-213613 verringert (Abb. 2f). Da die an der WAY-213613-Bindung beteiligten Reste von HP1-, HP2- und TM8-Elementen stammen, könnte dieses durch WAY-213613 vermittelte Interaktionsnetzwerk folglich das hEAAT2 in einem nach innen gerichteten Konformationszustand stabilisieren. Darüber hinaus behindert eine solche offene Konformation des durch WAY-213613 stabilisierten HP2 die Konformationsänderung, einen Schlüsselprozess für die hEAAT2-Aktivität.

Um zu verstehen, wie WAY-213613 hEAAT2 selektiv blockiert, haben wir die Struktur von nach innen gerichtetem hEAAT3Na (PDB-ID: 6X2L)20 mit der von hEAAT2W überlagert (Abb. 4a – c). Wir fanden heraus, dass die Asparagingruppe von WAY-213613 ziemlich kompatibel mit der Struktur von hEAAT3 ist. Allerdings sind einige Reste neben den Bromfluorphenolgruppen in hEAAT3 substituiert. Insbesondere werden die Reste V468TM8, L467TM8 und I464TM8 von TM8 von hEAAT2 durch I437TM8, I436TM8 bzw. V433TM8 in hEAAT3 ersetzt (Abb. 4c und ergänzende Abb. 8). Folglich führen diese Substitutionen in hEAAT3 zu einer Verkleinerung der Bindungstasche von WAY-213613 in hEAAT3, was den Mechanismus impliziert, warum hEAAT3 nicht die gleiche hohe Affinität zum Inhibitor WAY-213613 aufweisen kann wie hEAAT2 (Abb. 4a, b). . Um die oben genannten Hypothesen zu validieren, haben wir drei Mutationen entworfen, darunter I464VTM8, L467ITM8 und V468ITM8. Die elektrophysiologischen Experimente deuten darauf hin, dass Mutationen keinen Einfluss auf die Glutamatbindung haben. Bei diesen drei Mutanten kann die Anwendung von Glutamat in der externen Lösung den Anionenstrom mit ähnlicher Wirksamkeit wie bei Wildtyp-hEAAT2 signifikant aktivieren (Abb. 4d und ergänzende Abb. 9a – c). Diese Mutationen führen jedoch zu einer signifikanten Abnahme der Empfindlichkeit gegenüber WAY-213613, wobei Ki für die Mutanten I464VTM8, L467ITM8 und V468ITM8 auf ~0,17 μM, ~0,46 μM und ~0,20 μΜ anstieg (Abb. 4e und ergänzende Abb. 9d–f), was unsere Vermutungen stützt, dass die Reste I464TM8, L464TM8 und V468TM8 für die Bindungsspezifität von hEAAT2 mit WAY-213613 entscheidend sind.

a Oberflächendarstellung der WAY-213613-Tasche im hEAAT2W (hellgrün). Der WAY-213613 wird in Stäbchen (rosa) angezeigt. b Andocken von WAY-213613 an hEAAT3Na (PDB-ID: 6X2L). Die Oberflächendarstellung von hEAAT3Na (blau) zeigt eine Schrumpfung der WAY-213613-Bindungstasche in hEAAT3. Der WAY-213613 wird in Stäbchen (rosa) angezeigt. c Strukturvergleich der Transportdomäne von hEAAT2W (blassgrün) und hEAAT3Na (PDB-ID: 6X2L, grau). WAY-213613 und hydrophobe Rückstände in seiner Bindungstasche werden in Stäbchen angezeigt. Das HP2 von hEAAT2W ist rot gefärbt. d Glutamat-Dosis-Wirkungs-Beziehungen für die durch I464VTM8, L467ITM8 oder V468ITM8 vermittelten Ströme. Die Dosis-Wirkungs-Beziehungen für die getesteten Mutanten wurden bei den in Abb. 1a angegebenen unterschiedlichen Glutamatkonzentrationen analysiert. Die getesteten Probengrößen (n) von niedrigen bis hohen Konzentrationen sind wie folgt aufgeführt: n = 5, 5, 5, 5, 5 und 5 Zellen für die Mutante I464VTM8; n = 4, 4, 5, 5, 5 und 5 Zellen für die Mutante L467ITM8; n = 5, 5, 5, 5, 4 und 6 Zellen für die Mutante V468ITM8. e WAY-213613 Dosis-Wirkungsbeziehungen für die durch I464VTM8, L467ITM8 oder V468ITM8 vermittelten Ströme. Die Dosis-Wirkungs-Beziehungen für die hEAAT2-Mutanten als WAY-213613 wurden bei den in Abb. 1b angegebenen Konzentrationen variiert. Die Linien stellen die besten Anpassungen an eine Michaelis-Menten-ähnliche Gleichung mit einem scheinbaren Ki von 0,166 μM, 0,464 μM bzw. 0,196 μM dar. Die Ströme wurden auf den maximalen Strom normalisiert, der nach der Anwendung von 30 μM WAY-213613 aufgezeichnet wurde. Die getesteten Probengrößen (n) von niedrigen bis hohen Konzentrationen sind: n = 5, 5, 5, 4, 4, 5 und 10 Zellen für I464VTM8; n = 5, 5, 5, 5, 5, 4 und 11 Zellen für L467ITM8; n = 5, 5, 5, 5, 5, 5 und 11 Zellen für V468ITM8. Die Daten von Wildtyp-hEAAT2 aus Abb. 1b wurden mit denen der getesteten Mutanten verglichen. In Abb. d und e, alle Experimente wurden bei 0 mV durchgeführt und die Daten wurden als Mittelwerte ± SD dargestellt.

Bisher wurde eine Reihe von Strukturen von hEAAT2-Homologen in Gegenwart verschiedener Arten von Inhibitoren bestimmt, darunter die kompetitiven Inhibitoren TBOA10,14,18, TFB-TBOA14,19,35 sowie trans- und cis-Isomere von p-OMe-azo -TBOA36, Lc-BPE25 und allosterische Inhibitoren UCPH-10119. Für den weiteren Vergleich mit hEAAT2W (ergänzende Abbildung 10a) wurden komplexe Strukturen mit nach innen gerichteter Konformation übernommen, bestehend aus GltPhTFB-TBOA (PDB-ID: 6 × 14)14, GltPhTBOA (PDB-ID: 6 × 16)14 und hEAAT3TFB-TBOA (PDB-ID: 6S3Q)35. In den Strukturen von GltPhTBOA und hEAAT3TFB-TBOA fügen sich die Inhibitoren in die beiden Helices von HP2 ein, um HP2a von HP2b zu trennen und so die Konformationsänderung des Transporters zu blockieren (Ergänzende Abbildung 10b, c). Die Ausrichtung von WAY-213613 im hEAAT2W-Komplex unterscheidet sich jedoch erheblich von der der Inhibitoren in den GltPhTBOA- und hEAAT3TFB-TBOA-Komplexen (ergänzende Abbildung 10a – c). Die Bromfluorphenolgruppe von WAY-213613 befindet sich im „tiefen hydrophoben Hohlraum“, der von TM8, TM7b und HP2b gebildet wird (Abb. 3c und ergänzende Abb. 10a). Der GltPhTFB-TBOA-Komplex weist eine andere Bindungsstelle auf als der hEAAT3TFB-TBOA-Komplex (ergänzende Abbildung 10c, d). Im Gegensatz dazu scheint der GltPhTFB-TBOA-Komplex eine ähnliche Bindungsstelle wie der hEAAT2W-Komplex aufzuweisen (ergänzende Abbildungen 10a, d). Allerdings ist TFB-TBOA nicht in der Lage, sich dem „tiefen Hohlraum“ von WAY-213613 im hEAAT2 zu nähern (ergänzende Abbildung 10e). Die obigen Ergebnisse zeigen, dass WAY-213613 an einem bisher nicht identifizierten Hohlraum gebunden ist.

hEAAT2 ist der am häufigsten exzitatorische Aminosäuretransporter in Astrozyten, der für die Aufnahme von Glutamat aus dem synaptischen Spalt in Astrozyten erforderlich ist, um neuronale Zytotoxizität zu verhindern3. Hier berichten wir über die Kryo-EM-Struktur von hEAAT2Glu im Komplex mit Glutamat, die die molekularen Details enthüllt, wie hEAAT2 das Glutamat erkennt. Im Vergleich zu eukaryotischen Homologen (hEAAT119, hEAAT320, hASCT222) und prokaryotischen Homologen (GltPh14, GltTk17) (ergänzende Abbildung 6) sind die an der Substratbindung beteiligten Schlüsselinteraktionsreste zwischen hEAAT2 und den oben genannten Homologen hoch konserviert. In der Zwischenzeit haben wir herausgefunden, dass ein einzigartiger Rest S441HP2 ausschließlich in hEAAT2 vorhanden ist und an der entsprechenden Position anderer Homologe durch das konservierte Glycin ersetzt wird (ergänzende Abbildung 8). Elektrophysiologische Experimente zeigten, dass die Affinität von S441GHP2 zu Glutamat im Vergleich zu der von Wildtyp-hEAAT2 deutlich erhöht werden kann (Abb. 2h). Bemerkenswerterweise befindet sich S441HP2 an der HP2-Spitze und nimmt nicht direkt an der Wechselwirkung mit Glutamat teil (Abb. 2g). Daher spekulieren wir, dass S441HP2 die Transportgeschwindigkeit von Glutamat beeinflussen könnte. Weitere Experimente sind erforderlich, um die funktionellen Rollen von S441HP2 in hEAAT2 zu klären.

In dieser Studie haben wir auch die Struktur von hEAAT2 im Komplex mit dem Inhibitor WAY-213613 aufgeklärt, was die Bindungstasche von hEAAT2 für WAY-213613 klar aufklärt. Der hEAAT2W-Komplex ist im nach innen gerichteten Konformationszustand stabilisiert. Die α-Carboxyl- und α-Amino- sowie die Anilingruppen von WAY-213613 bilden Kontakte mit den Resten S364HP1, D475TM8 und R478TM8 und teilen eine überlappende Bindungsstelle mit dem Substrat Glutamat, was mit der Annahme übereinstimmt, dass WAY-213613 ein kompetitiver Inhibitor ist . Im hEAAT2W-Komplex erfährt HP2 eine bemerkenswerte Konformationsänderung und rotiert vom HP1 weg, wodurch genügend Platz für die WAY-213613-Bindung entsteht. Interessanterweise wurde festgestellt, dass S441HP2 eine Wasserstoffbrücke mit T395TM7 bildet und folglich HP2 in einer offenen Konformation stabilisiert, was zeigt, dass diese Wechselwirkung für die WAY-213613-Bindung entscheidend ist (Abb. 3c, 2f). Unterdessen ist die Bromfluorphenolgruppe von WAY-213613 von einigen hydrophoben Resten von TM8, TM7b und HP2b umhüllt, wie z. B. I464TM8, L467TM8, V468TM8, M450HP2 und L447HP2 (Abb. 3c). Basierend auf dem Strukturvergleich und der Sequenzausrichtung werden die Reste I464TM8, L467TM8 und V468TM8 von TM8 in hEAAT2 im Vergleich zu den entsprechenden Resten anderer hEAATs variiert (Abb. 4c). Die elektrophysiologischen Experimente zeigen, dass die oben genannten drei Reste für die Hemmung von hEAAT2 durch WAY-213613 mit hoher Wirksamkeit entscheidend sind und eine Mutation in jedem der drei Reste die Hemmwirkung von hEAAT2 durch WAY-213613 erheblich verringert (Abb. 4e). Wenn man bedenkt, dass der I464-L467-V468-Cluster in hEAAT2 durch Val-Leu-Ile in hEAAT3 bzw. Ile-Ile-Val in hEAAT1/hEAAT4/hEAAT5 ersetzt wird, spekulieren wir, dass der I464-L467-V468-Cluster aus TM8 als a fungiert Schlüsselstrukturdeterminante für die selektive Hemmung von hEAAT2 durch WAY-213613.

Das hEAAT2-Gen in voller Länge (UniProtKB-Zugang: P43004) wurde aus einer HEK293-cDNA kloniert und in einen modifizierten pEG-BacMam-Vektor konstruiert, der einen N-terminalen Strep∙-Tag II gefolgt von einem Superfolder-GFP (sfGFP) und einer PreScission-Protease aufweist ( PPase)-Erkennungsstelle. Das Bac-to-Bac-Baculovirus-Expressionssystem (Invitrogen) wurde verwendet, um rekombinante hEAAT2-Proteine in HEK293F-Zellen zu exprimieren. Kurz gesagt wurde das Plasmid pEG-strep-GFP-hEAAT2 gemäß den Anweisungen des Herstellers (Bac-to-Bac; Invitrogen) in Escherichia coli DH10bac-Zellen transformiert, um ein Bacmid-Plasmid zu erhalten, das das hEAAT2-Gen enthält. Dann wurde das Baculovirus in Sf9-Zellen (Spodoptera frugiperda-9-Zellen) gewonnen und P2-Viren wurden nach 72 Stunden Amplifikation gesammelt. HEK 293F-Zellen wurden bis zu einer Dichte von 2,5 × 106 Zellen/ml bei 37 °C kultiviert, und die P2-Viren wurden in einem Verhältnis von 1 % (v/v) zugegeben, um die Transfektion zu initiieren, und gleichzeitig mit 1 mM Glutamat (Sigma-) ergänzt. Aldrich) oder 5 μM WAY-213613 (MedChemExpress) und 1 % (v/v) FBS (fötales Rinderserum), dann in einem Schüttler bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Nach der 8–12-stündigen Kultivierung wurde 10 mM Natriumbutyrat zugegeben und die Zellen wurden 48 Stunden lang weiter inkubiert, gefolgt von einer 5-minütigen Zentrifugation bei 2500 × g und 4 ° C zur Zellsammlung.

Die Zellpellets wurden in Puffer A (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 mM Glutamat oder 5 μM WAY-213613) resuspendiert, ergänzt mit einer 1:1000-Verdünnung eines Säugetier-Protease-Inhibitor-Cocktails (Sigma- Aldrich) oder mit flüssigem Stickstoff schockgefroren und zur weiteren Verwendung bei −80 °C gelagert. Die resuspendierten Zellen wurden in einem Dounce-Homogenisator aufgeschlossen. Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C entfernt und der Überstand wurde bei 100.000 × g für 0,5 Stunden bei 4 °C ultrazentrifugiert. Die rohen Membranpellets wurden in Puffer A, ergänzt mit Protease-Inhibitor-Cocktail, resuspendiert und homogenisiert. 1 % (Gew./Vol.) n-Dodecyl-β-d-Maltopyranosid (DDM; Anatrace) und 0,2 % (Gew./Vol.) Cholesterylhemisuccinat (CHS; Sigma-Aldrich) wurden in die homogene Lösung gegeben, gefolgt von einer 2-stündigen Solubilisierung unter leichtem Rühren bei 4 °C. Nach 0,5-stündiger Ultrazentrifugation bei 100.000 × g und 4 °C wurden unlösliche Rückstände entfernt und das solubilisierte Material durch einen 0,22 μM-Filter (Merck Millipore) filtriert. Anschließend lief das Filtrat langsam durch eine mit Puffer B voräquilibrierte Streptactin-Beads-Säule (Smart-Lifesciences) (Puffer A, ergänzt mit 0,025 % (Gew./Vol.) DDM und 0,005 % (Gew./Vol.) CHS) mit einer Geschwindigkeit von ~0,2 ml/min. Die Säule wurde mit 10 Säulenvolumina (CV) Puffer B gewaschen, um ungebundene Materialien zu entfernen, und das Protein wurde mit vier Säulenvolumina Puffer C (Puffer B ergänzt mit 5 mM d-Desthiobiotin) eluiert. N-terminales Strep∙Tag II und GFP wurden durch 3-stündige Inkubation mit einem geeigneten Verhältnis hausgemachter PreScission-Protease bei 4 °C verdaut. Die hEAAT2-Probe wurde mit einem 100-kDa-Cut-off-Konzentrator (Merck Millipore) auf 1 ml konzentriert und durch Größenausschlusschromatographie unter Verwendung von Superose 6 Boost 10/300 GL (GE Healthcare), voräquilibriert mit Puffer B, weiter gereinigt. Schließlich die Fraktionen mit gereinigtem Protein wurden gesammelt und sofort für die Kryo-EM-Gittervorbereitung konzentriert.

Um Gitter für die Kryo-EM-Bildgebung vorzubereiten, wurde das frisch gereinigte Protein konzentriert und mit 2 mM Glutamat oder 200 μM WAY-213613 auf Eis ergänzt und 30 Minuten lang inkubiert. Insgesamt wurden 2,5 μl 12,6 mg/ml hEAAT2Glu-Komplex oder 10 mg/ml hEAAT2W-Komplex auf löchrige Kohlenstoff-Kryo-EM-Gitter (Quantifoil Cu R1.2/1.3, 300 Mesh) aufgetragen, die 60 s lang glimmentladen wurden im H2O2-Zustand durch den Solarus-Plasmareiniger (Gatan). Die Gitter wurden entweder 2,5 s lang bei 4 °C und 100 % Luftfeuchtigkeit in Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific) geblottet, anschließend durch Eintauchen in flüssiges Ethan vitrifiziert und in flüssigem Stickstoff gelagert. Kryo-EM-Daten wurden mit einem 300-kV-Titan-Krios-Transmissionselektronenmikroskop (Thermo Fisher Scientific) erfasst, das mit einem Gatan K2 Summit-Direktelektronendetektor (Gatan) ausgestattet war, der hinter einem GIF-Quantenenergiefilter positioniert war. Mit einem auf 20 eV eingestellten Schlitz des Energiefilters wurde SerialEM37 für die Robotersammlung von Filmstapeln im hochauflösenden Zählmodus bei 130.000-facher Vergrößerung (1,04 Å Pixelgröße) mit einem nominellen Defokusbereich von 1,5–2,5 μm verwendet. Filmstapel hatten eine Gesamtdosis von etwa 50 e/Å2, verteilt auf 60 Bilder, mit einem Dosisleistungsbereich von 8,5–9,0 e−/Å2/s.

Für den Datensatz des hEAAT2Glu-Komplexes wurden insgesamt 2256 dosisfraktionierte Filme gesammelt, die strahlinduzierte Bewegung wurde mit MotionCor238 korrigiert und die Schätzung der Kontrastübertragungsfunktion (CTF) wurde mit GCTF39 bestimmt. 148 Bilder, die eine schlechte CTF-Schätzung oder eine Kontamination mit Eis erkennen ließen, wurden verworfen, was zu 2108 Bildern führte, die für die nachfolgende Analyse mit RELION-3.140 ausgewählt wurden, sofern nicht ausdrücklich erwähnt. Mit Gautomatch wurden insgesamt 1.509.287 Partikel automatisch ausgewählt und die ersten Referenzen wurden mit der Ab-initio-Rekonstruktion in cryoSPARC41 berechnet. Zwei Runden der geführten 3D-Klassifizierung mit mehreren Referenzen wurden anhand mehrerer verzerrter Karten durchgeführt, was zu guten Referenzen führte, bei denen die C3-Symmetrie erzwungen wurde. Die resultierende Klasse 4 (41,8 %) in der ersten Runde der 3D-Klassifizierung und Klasse 4 (82,8 %) in der zweiten Runde der 3D-Klassifizierung zeigten klar aufgelöste Transmembranhelices und wurden für die folgende 3D-Verfeinerung eingereicht, die eine 3,9 Å ergab Auflösungskarte. Um die Qualität der hEAAT2-Karte weiter zu verbessern, wurden 3D-Klassifizierungen ohne Ausrichtung unter Verwendung einer engen Maske und auferlegter C3-Symmetrie durchgeführt. Partikel, die die beste Klasse von 6 Klassen (15,0 %) bilden, wurden für eine weitere CTF-Verfeinerung und 3D-Auto-Verfeinerung unter Verwendung von C3-Symmetrie und Nachbearbeitung mit enger Maske ausgewählt und verbesserten die endgültige Karte gemäß dem berichteten GSFSC-Kriterium42 auf eine Auflösung von 3,4 Å.

Für den Datensatz des hEAAT2W-Komplexes wurden insgesamt 465 dosisfraktionierte Filme gesammelt, die strahlinduzierte Bewegung wurde mit MotionCor238 korrigiert und die CTF-Schätzung wurde mit GCTF39 bestimmt. Mit dem Template-Picker in cryoSPARC41 wurden aus den 420 Mikroaufnahmen insgesamt 233.008 Partikel ausgewählt. Die extrahierten Partikel wurden zwei Runden der 2D-Klassifizierung unterzogen. Die guten 2D-Klassendurchschnitte wurden ausgewählt und einer 3D-heterogenen Verfeinerung mit auferlegter C3-Symmetrie unterzogen. Die resultierende gute 3D-Klasse mit 98.685 Partikeln wurde einer 3D-ungleichmäßigen Verfeinerung unterzogen, um eine Karte mit einer Auflösung von 3,7 Å zu erhalten. Die 98.685 Partikel wurden in RELION-3.140 erneut extrahiert, gefolgt von einer automatischen 3D-Verfeinerung, Nachbearbeitung und Polierung, um die Partikelqualität weiter zu verbessern. Anschließend wurden die polierten Partikel erneut in cryoSPARC importiert. Nach der heterogenen 3D-Verfeinerung mit auferlegter C3-Symmetrie wurden 98.536 Partikel aus der besten Klasse einer ungleichmäßigen Verfeinerung unterzogen. Letztendlich wurde eine Karte mit einer Auflösung von 3,4 Å erhalten.

Für den Modellaufbau des hEAAT2Glu-Komplexes wurde eine zuvor veröffentlichte Kryo-EM-Struktur von hEAAT3 (PDB-ID: 6S3Q)35, bei der seine Nicht-Protein-Komponenten entfernt wurden, als Referenzmodell verwendet, das mithilfe von Chimera43 in die Dichtekarte angedockt wurde, gefolgt von einer manuellen Anpassung in COOT44. Diese hochauflösende Karte kann die Proteinsequenz sichtbar zuordnen und die meisten Reste (37–148, 162–195 und 229–507) zuverlässig modellieren. In jedem Protomer wurde in der räumlichen Mitte, die durch die Oberseite von HP2 und HP1 abgedeckt wurde, eine verwaiste Feststoffdichte gefunden, die als Dichte für 2 mM Glutamat angesehen wurde, das bereits vorhanden war, als Gitter hergestellt wurden und analoges Substrat Aspartat oder Glutamin an eine ähnliche Stelle gebunden wurde in hEAAT2-Homologen. Das Glutamatmolekül wurde mithilfe von COOT manuell an die Dichte angedockt. Beschränkungen für PC1 (1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phosphocholin) und CHS wurden von eLBOW45 in Phenix abgeleitet. Hier wurde PC1 als Modelllipid verwendet, wobei Acylketten oder Ethanolaminköpfe entfernt wurden, um die entsprechenden Dichten anzupassen. Anschließend wurde das Modell einer manuellen Anpassung in COOT unterzogen und mithilfe von Phenix mit Runden der Realraumverfeinerung46 mit Standardparametern gegenüber der Karte verfeinert. Zur Validierung wurde MolProbity47 verwendet. Das endgültige Modell von hEAAT2 erhielt eine gute Geometrie (Ergänzungstabelle 1). Fourier-Shell-Korrelationskurven (FSC) wurden zwischen dem endgültigen verfeinerten unmaskierten Modell und der maskierten Karte sowie der Kreuzvalidierung des verfeinerten Modells mit der Karte von hEAAT2 berechnet (ergänzende Abbildung 2 und ergänzende Tabelle 1). Die Zahlen wurden mit UCSF ChimeraX48 und PyMOL49 oder LigPlot+50 erstellt.

Menschliche embryonale Nierenzellen 293T (HEK293T) wurden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco)-Medium, ergänzt mit 15 % (v/v) fötalem Rinderserum (FBS, PAN-Biotech), bei 37 °C mit 5 % CO2 kultiviert. HEK293T-Zellen wurden in den Kulturschalen (d = 3,5 cm) (Thermo Fisher Scientific) 24 Stunden lang gezüchtet und dann wurden 1 μg hEAAT2-Wildtyp- und mutierte Plasmide pro Schale verwendet, um HEK293T unter Verwendung von 0,7 μg Lipofectamine 2000-Reagenz (Thermo) vorübergehend zu transfizieren Fisher Scientific). Die Zellen wurden mithilfe elektrophysiologischer Experimente zwischen 24 und 40 Stunden nach der Transfektion bei Raumtemperatur (21–25 °C) analysiert.

Elektrophysiologische Experimente wurden wie zuvor beschrieben mit einer geringfügigen Modifikation durchgeführt25. Der externe Puffer enthielt 140 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 und 10 mM HEPES (pH = 7,4 mit NaOH und Osmolarität von etwa 310 mosmol L−1), während die interne Pipettenlösung 130 mM NaSCN, 2 mM MgCl2 enthielt. 10 mM EGTA, 10 mM HEPES (pH = 7,4 mit NaOH und Osmolarität von ∼310 mosmol L−1) und 10 mM Glutamat. 50 mM WAY-213613-Stammlösungen wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO) hergestellt und anschließend mit dem oben genannten externen Puffer auf Arbeitskonzentrationen verdünnt. In unserem Experiment wurde maximal 0,5 % DMSO verwendet und es hatte keinen Einfluss auf die elektrophysiologischen Ergebnisse in den Kontrollzellen. Aufzeichnungen des Ganzzell-Patch-Clamp-Experiments wurden aus isolierten GFP-positiven HEK293T-Zellen (hEAAT2-Wildtyp und Mutanten) durchgeführt. Insgesamt wurden 3–6 MΩ zum Abfeuern einer polierten Pipette (Sutter Instrument) verwendet. Da ein relativ kleiner Strom und eine Kompensation keinen Einfluss auf die Größe der beobachteten Ströme hatten, wurde der Serienwiderstand in diesen Experimenten nicht kompensiert. Die Zellen wurden in den oben genannten externen Puffer getaucht, der mit einer bestimmten Konzentration an Glutamat oder WAY-213613 ergänzt war. Glutamatinduzierter Anionenstrom, Na+-abhängiger Anionenleckstrom und Glutamattransportstrom oder WAY-213613-inhibierte Anionenleckströme wurden mit einem EPC-10-Verstärker (HEKA Electronic) bei einer Abtastrate von 20 kHz und einem Tiefpassfilter bei 5 kHz aufgezeichnet. Alle Experimente wurden bei 0 mV durchgeführt. Nachdem sich der Zellstrom stabilisiert hatte, wurde Glutamat oder WAY-213613 durch externe Dosierung mindestens 6 s lang in den angegebenen Konzentrationen gehalten. Anschließend wurde die Zelle mit externem Puffer abgewaschen, um eine neue Anwendungsrunde zu starten oder das Experiment zu beenden. Für die folgenden Berechnungen wurden die Plateauströme verwendet. Zur Analyse wurden die Daten 5 s nach der Aufzeichnung mit dem PatchMaster-Programm (HEKA Electronic) erfasst. Nichtlineare Dosis-Wirkungs-Beziehungen wurden in die unten gezeigte Michaelis-Menten-Gleichung eingepasst, um die scheinbaren Km- und Ki-Werte in Gegenwart von Glutamat oder WAY-213613 zu erhalten.

In dieser Gleichung stellt I den Strom bei verschiedenen Glutamat- oder Inhibitorkonzentrationen dar, und Imax stellt den maximalen Strom bei der Sättigungskonzentration von Glutamat oder Inhibitor dar. [C] stellt die Konzentration von Glutamat oder Inhibitor dar. Km/i stellt die scheinbare Konstante dar.

Die statistische Signifikanz wurde mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA und anschließendem Bonferroni-Post-hoc-Test bewertet, der ausführlich wie in den Legenden der Abbildungen beschrieben ist.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die dreidimensionalen Kryo-EM-Dichtekarten von hEAAT2Glu und hEAAT2W wurden in der EM-Datenbank unter den Zugangscodes EMD-33407 bzw. EMD-33408 hinterlegt, und die Koordinaten für die Strukturen wurden in der Proteindatenbank unter dem Beitritt hinterlegt Codes 7XR4 bzw. 7XR6. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir danken B. Zhu und anderen Mitarbeitern des Center for Biological Imaging (CBI), Core Facilities for Protein Science am Institute of Biophysics, Chinese Academy of Science (IBP, CAS) für die Unterstützung bei der Kryo-EM-Datenerfassung; Wir danken Bei Yang und Yan Wu für ihre wissenschaftliche Hilfstätigkeit. Diese Arbeit wird von den chinesischen Nationalprogrammen für Gehirnforschung und gehirnähnliche Intelligenztechnologie (Grant-Nr. 2022ZD0205800 an YZ), dem Strategic Priority Research Program der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (Grant-Nr. XDB37030304 an YZ) und dem National Key Research and Development Program von finanziert China (Zuschuss Nr. 2021YFA1301501 an YZ), die National Natural Science Foundation of China (Zuschuss Nr. 92157102 an YZ und Zuschuss Nr. 32070031, 31770051 an JJ), das National Laboratory of Biomacromolecules, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences ( Zuschuss Nr. 2021kf10 und 2022kf09), Chinese National Programmes for Brain Science and Brain-like Intelligence Technology (Zuschuss Nr. 2021ZD0202102 an ZH) und die National Natural Science Foundation of China (Zuschuss Nr. 81371432 an ZH).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Zhenglai Zhang, Huiwen Chen, Ze Geng.

Abteilung für Mikrobiologie und Biotechnologie, College of Life Sciences, Northeast Agricultural University, No. 600 Changjiang Road, Xiangfang District, Harbin, 150030, China

Zhenglai Zhang, Huiwen Chen und Juquan Jiang

National Laboratory of Biomacromolecules, CAS Center for Excellence in Biomacromolecules, Institut für Biophysik, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Peking, 100101, China

Zhenglai Zhang, Huiwen Chen, Zhuoya Yu, Hang Li, Yanli Dong, Hongwei Zhang und Yan Zhao

Staatliches Schlüssellabor für natürliche und biomimetische Arzneimittel, Abteilung für molekulare und zelluläre Pharmakologie, Fakultät für Pharmazeutische Wissenschaften, Gesundheitswissenschaftliches Zentrum der Peking-Universität, Peking, 100191, China

Ze Geng & Zhuo Huang

IDG/McGovern Institute for Brain Research, Universität Peking, Peking, 100871, China

Ze Geng & Zhuo Huang

Staatliches Schlüssellabor für Gehirn- und Kognitionswissenschaft, Institut für Biophysik, Chinesische Akademie der Wissenschaften, 15 Datun Road, Peking, 100101, China

Zhuoya Yu & Yan Zhao

College of Life Sciences, Universität der Chinesischen Akademie der Wissenschaften, Peking, 100049, China

Zhuoya Yu, Hang Li, Hongwei Zhang und Yan Zhao

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YZ konzipierte das Projekt und überwachte die Forschung. ZZ bereitete Probe für Kryo-EM-Studie vor. HC und ZY sammelten Kryo-EM-Daten und berechneten die EM-Karten. ZZ und ZY bauten und verfeinerten das Atommodell. HL, YD und HZ helfen bei der Reinigung von Proteinproben. YZ, JJ und ZZ analysierten die Struktur. ZH und YZ entwarfen die elektrophysiologischen Experimente und ZG führte sie durch. ZZ, HC und ZY haben zum ersten Entwurf des Manuskripts beigetragen. YZ und JJ haben das Manuskript unter Einbeziehung aller Autoren in der endgültigen Fassung bearbeitet.

Korrespondenz mit Zhuo Huang, Juquan Jiang oder Yan Zhao.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Rosemary Cater, Josep Font Sadurni und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Zhang, Z., Chen, H., Geng, Z. et al. Strukturelle Grundlagen der Ligandenbindungsmodi von menschlichem EAAT2. Nat Commun 13, 3329 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-31031-x

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Eingegangen: 08. November 2021

Angenommen: 31. Mai 2022

Veröffentlicht: 09. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-31031-x

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