Ein gestörter Fluss von Gallensäuren von der Leber in den Darm zeigt das Mikrobiom

npj Biofilms and Microbiomes Band 9, Artikelnummer: 35 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Derzeit gibt es Hinweise darauf, dass Veränderungen im Darmökosystem zur Entstehung von Lebererkrankungen beitragen. Die komplexen Mechanismen sind jedoch noch unklar. Wir haben bei Mäusen durch Gallengangsligatur (BDL) eine Cholestase induziert, die den Phänotyp einer Gallengangsobstruktion widerspiegelt, um zu verstehen, wie Veränderungen der Darmmikrobiota, die durch einen beeinträchtigten Fluss von Gallensäure in den Darm verursacht werden, zur Pathogenese und zum Fortschreiten von Lebererkrankungen beitragen. Wir führten Längsschnittproben von Stuhl, Herz und Leber bei Mäusen durch, die BDL erhielten, und bei Kontrollpersonen, die eine Scheinoperation (ShamOP) erhielten. Die Shotgun-Metagenomik-Profilierung erfolgte anhand von Stuhlproben, die vor und am Tag 1, Tag 3 und Tag 7 nach der Operation entnommen wurden, und es wurden die Zytokine und klinisch-chemischen Profile aus dem Herzblut sowie das Gallensäureprofil der Leber gemessen. Die BDL-Operation veränderte das Mikrobiom von Mäusen, was zu deutlich unterschiedlichen Merkmalen im Vergleich zur ShamOP führte. Unsere Analyse der Mikrobiompfade und ECs ergab, dass BDL die Produktion hepatoprotektiver Verbindungen im Darm wie Biotin, Spermidin, Arginin und Ornithin reduziert, die negativ mit entzündlichen Zytokinen (IL-6, IL-23, MCP-6, IL-23) assoziiert sind. 1). Die Verringerung des funktionellen Potenzials der Darmmikrobiota bei der Produktion dieser hepatoprotektiven Verbindungen ist mit der Abnahme nützlicher Bakterienarten aus den Gattungen Anaerotruncus, Blautia, Eubacterium und Lachnoclostridium sowie der Zunahme krankheitsassoziierter Bakterien, z. B. Escherichia coli und, verbunden Entercoccus faecalis. Unsere Erkenntnisse erweitern unser Wissen über das Darmmikrobiom-Gallensäuren-Leber-Dreieck, das als potenzielle Therapiestrategie für Lebererkrankungen dienen könnte.

Weltweit sind Lebererkrankungen (LD) für über zwei Millionen Todesfälle pro Jahr verantwortlich, das sind 3,5 % aller Todesfälle, und sie treten in der alternden Bevölkerung immer häufiger auf1,2. Die komplizierte Ätiologie von LD umfasst mehrere miteinander verbundene Risikofaktoren, darunter Fettleibigkeit, fortgeschrittenes Alter und übermäßiger Alkoholkonsum3. Die nichtalkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) ist die häufigste chronische Lebererkrankung, von der weltweit bis zu 25 % der Bevölkerung betroffen sind4. Es handelt sich um eine komplexe Erkrankung, die mit Stoffwechselstörungen, verändertem Darmmikrobiom und einer Immunschwäche einhergeht5,6,7. Es wurden verschiedene Therapieansätze für NAFLD untersucht, die auf den Stoffwechsel des Wirts, die Darmmikrobiota und das Immunsystem abzielen8. Aufgrund des komplexen Zusammenspiels dieser Faktoren bei den Erkrankungen ist jedoch ein integrierter Ansatz zur Untersuchung dieser Elemente erforderlich.

Zunehmende Hinweise deuten darauf hin, dass die Darmmikrobiota die Entwicklung von NAFLD auf vielfältige Weise beeinflusst. Störungen der Darmbarriere, bakterielle Translokation und Entzündungsreaktionen in der Leber sind einige mögliche Mechanismen, die vermutet wurden, wie das Darmmikrobiom NAFLD und nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH) beeinflussen könnte9. Darüber hinaus wiesen NAFLD- und NASH-Patienten signifikant höhere primäre und sekundäre Gallensäuren (BAs) im Serum auf als gesunde Personen10. BAs sind wichtige Metaboliten bei Lebererkrankungen11. Die Regulierung des sekundären BA-Stoffwechsels ist eine der bekannten Funktionen der Darmmikrobiota. Die Erhöhung der sekundären BA-Produktion war mit der Zunahme von Taurin- und Glycin-metabolisierenden Bakterien verbunden12,13. Daher kann ein Anstieg der sekundären BAs die NAFLD verschlimmern.

Dennoch wurde berichtet, dass die Mikrobiota den Farnesoid-X-Rezeptor (FXR) über sekundäre BAs14 reguliert. FXR hat eine entzündungshemmende Wirkung und schützt vor Cholestase, NAFLD und mit NASH verbundenen Leberentzündungen. Es könnte durch die sekundären BAs Lithocholsäure und Desoxycholsäure aktiviert werden15,16,17, was darauf hindeutet, dass die sekundären BAs auch eine schützende Rolle gegen das Fortschreiten der NAFLD spielen.

Zytokine sind sowohl krankheitsfördernd als auch positiv an der Pathogenese von Lebererkrankungen beteiligt. Daher bleibt ihre Rolle umstritten. Beispielsweise spielt der Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) eine dichotomische Rolle in der Leber. Es fungiert nicht nur als Vermittler des Zelltods, sondern induziert auch die Hepatozytenproliferation und die Leberregeneration18, wohingegen IL-6 sowohl als Förderer der Leberregeneration als auch als Entzündungsauslöser fungiert19. Darüber hinaus könnte sich eine Entzündung je nach Krankheitsstadium negativ auf die Entwicklung von NAFLD auswirken, da Entzündungen im Frühstadium zur Leberschädigung beitragen und im Spätstadium zu einem entscheidenden Faktor für die Abwehr des Wirts gegen Pathogeninfektionen und die Leberregeneration werden20. Schließlich könnte die Mikrobiota die Zytokinproduktion beim Menschen regulieren, hauptsächlich durch die Freisetzung üblicher Zwischenmediatoren wie Tryptophan, Palmitoleinsäure und kurzkettige Fettsäuren, anstatt eine direkte Kommunikation zwischen Mikroben und Immunzellen auszuüben21,22.

Cholestase ist eine Erkrankung, bei der der Gallenfluss aus der Leber vermindert oder blockiert ist. Je nach Mechanismus kann man sie in intrahepatische oder extrahepatische Cholestase einteilen. Interessanterweise haben die cholestatische Lebererkrankung und die NAFLD einige primäre pathophysiologische Mechanismen gemeinsam23. Die Gallengangligatur (BDL) ist eine Standardmethode zur Auslösung von Fibrose und Zirrhose bei Mäusen durch Einführung einer obstruktiven cholestatischen Verletzung24. Die durch BDL verursachten morphologischen Veränderungen ähneln denen, die bei der menschlichen Gallenzirrhose beobachtet werden, was es Forschern ermöglicht, den zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismus zu untersuchen und mögliche Behandlungen zu entwickeln25. Obwohl BDL ein Modell für cholestatische Lebererkrankungen ist, wurde es auch erfolgreich als Instrument in der präklinischen NAFLD- und NASH-Forschung eingesetzt26,27,28. Jüngste Studien haben die taxonomischen Unterschiede des Mikrobioms zwischen BDL- und Kontrollmäusen mithilfe der 16S-rRNA-Sequenzierung untersucht und spezifische Bakteriengattungen vorgeschlagen, die mit der hepatischen Genexpressionsreaktion des Wirts assoziiert sind und die Leber während einer akuten Cholestase schützen können29. Dennoch sind die Funktionsmechanismen des Darm-Leber-Zusammenspiels in diesem Mausmodellsystem weitgehend unerforscht.

Um unser Verständnis der Darm-Leber-Immunachse bei Lebererkrankungen zu erweitern, führten wir Längsschnittproben von Kot und Blut bei Mäusen mit BDL und Scheinoperation (ShamOP) durch. Unsere umfassende und integrative Analyse des Shotgun-Metagenomikprofils mit den Wirtszytokinen, Lebergallensäuren und biochemischen Markern lieferte weitere Einblicke in mögliche Mechanismen des Darmmikrobioms bei der Modulation der Schwere von Leberschäden.

Insgesamt 38 Mäuse erhielten nach dem Zufallsprinzip BDL (n = 20) und ShamOP (n = 18) (Abb. 1a). Die Mäuse wurden in Gruppen am Tag 1, Tag 3 und Tag 7 nach der Operation getötet und es wurden Herzblut- und Leberproben entnommen. Wir haben 8 biochemische Marker und 12 Zytokine aus den Herzblutproben und 15 Gallensäuren aus den Leberproben profiliert (Ergänzungstabelle 1). Zu jedem Zeitpunkt wurden Stuhlproben entnommen, vom Ausgangswert (vor der Operation) bis zum Tag 1, Tag 3 und Tag 7, bevor die Mäuse getötet wurden. Um den durch BDL verursachten Leberschaden zu bestätigen, untersuchten wir die Bilder von Hämatoxylin und Eosin (H&E) und verglichen die biochemischen, entzündlichen und Gallensäureprofile zwischen den BDL- und ShamOP-Mäusen. Unsere histopathologische Untersuchung des Lebergewebes mittels H&E-Färbung bestätigte den Erfolg der BDL-Operation in der BDL-Gruppe (ergänzende Abbildung 1). Außerdem war die Gesamtgallensäurekonzentration in der Leber bei BDL-Mäusen signifikant erhöht, was darauf hindeutet, dass der Gallenfluss wie erwartet blockiert war (ergänzende Abbildung 2, verallgemeinertes lineares Modell, P-Wert <0, 05). Wir beobachteten, dass die Serummarker im Zusammenhang mit Leberschäden, einschließlich Aspartataminotransferase (ASAT), Alaninaminotransferase (ALAT), Gamma-Glutamyltransferase (GGT) und Triglycerid (TG), bei BDL im Vergleich zu ShamOP-Mäusen signifikant höher waren (ergänzende Abb . 2, verallgemeinertes lineares Modell, P-Wert < 0,05). Die Werte von ASAT und ALAT zeigten den größten Unterschied zwischen den beiden Studiengruppen. Unsere Analyse zeigte auch, dass die entzündlichen Zytokine IL-23, TNF-α, MCP-1, IL-1β, IL-6, IL-17A, GM-CSF und IFN-β bei BDL-Mäusen signifikant erhöht waren. Im Gegensatz dazu war IFN-γ signifikant verringert (Abb. 1b und ergänzende Abb. 2, verallgemeinertes lineares Modell, P-Wert <0, 05). TNF-α, MCP-1 und IL-6 waren die wichtigsten differenziellen Zytokine zwischen den BDL- und ShamOP-Mäusen und korrelierten signifikant positiv mit ALAT und ASAT (Abb. 1c, Spearman-Korrelation, P-Wert <0,05).

a Eine grafische Darstellung des Studiendesigns, der Datenerfassung und der Datengenerierungsverfahren. b Boxplots signifikant unterschiedlicher Zytokine zwischen BDL- und ShamOP-Mäusen (P-Wert < 0,05). Die Mittellinie gibt den Median der Daten an, die Grenzen des Kästchens stellen den Interquartilbereich dar und die Whiskers geben den Bereich der Daten ohne Ausreißer an. c Korrelationen zwischen signifikant unterschiedlichen Zytokinen und signifikant unterschiedlichen biochemischen Markern unter Verwendung von Daten aller Zeitpunkte (Tag 1, Tag 3 und Tag 7). Die Bedeutung von Korrelationen wird durch Sternchensymbole angezeigt, wobei ein einzelnes Sternchen (*) einen P-Wert < 0,1 und ein doppeltes Sternchen (**) einen P-Wert < 0,05 anzeigt.

Die Darmmikrobiomstruktur der BDL-Mäuse und ShamOP-Mäuse wurde mittels Shotgun-Metagenomik-Sequenzierung aller Stuhlproben beurteilt. Insgesamt haben wir 110 Stuhlproben verarbeitet und 770,4 Gigabase-Paare mit durchschnittlich 46.689.954 hochwertigen Lesevorgängen pro Probe sequenziert. Mithilfe von mOTUs zur taxonomischen Profilerstellung30 identifizierten wir 60 Gattungen und 418 Arten. Die Alpha-Diversitätsindizes von Chao1, Shannon und Simpson zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen BDL- und ShamOP-Mäusen, wenn die Proben aller Zeitpunkte zum Vergleich verwendet wurden (Ergänzungstabelle 2, lineares gemischtes Modell, P-Wert > 0,05). Bray-Curtis-Abstände wurden berechnet, um die Beta-Diversität zwischen und innerhalb von Gruppen zu vergleichen. Die Beta-Diversität auf Gattungs- und Artenebene zwischen BDL und ShamOP zu Studienbeginn wies keinen signifikanten Unterschied auf (PERMANOVA, P-Wert > 0,05). Beim Vergleich der beiden Mäusegruppen an Tag 1, Tag 3 und Tag 7 war es jedoch signifikant unterschiedlich (mit Ausnahme des Gattungsniveaus, das am Tag 3 keine statistische Signifikanz erreichte) (Ergänzungstabelle 2, PERMANOVA, P-Wert < 0,05). ). Bemerkenswerterweise wurden beim Vergleich von BDL-Tag 0 mit BDL-Tag 1 und ShamOP-Tag 0 mit ShamOP-Tag 1 signifikante Unterschiede sowohl auf Gattungs- als auch auf Artenebene festgestellt, was darauf hindeutet, dass ein Bauchschnitt unabhängig von der Manipulation Veränderungen in der Mikrobiota fördern würde des Gallensystems. Sowohl die Gattungs- als auch die Artenzusammensetzung veränderten sich am 3. und 7. Tag bei BDL-Mäusen weiterhin signifikant (PERMANOVA, P <0, 05), jedoch nicht bei den ShamOP-Mäusen (PERMANOVA, P-Wert > 0, 05) (Abb. 2a, b).

Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) der Bray-Curtis-Unähnlichkeit zwischen Darmmikrobiom-Häufigkeitsprofilen am Tag 0, Tag 1, Tag 3 und Tag 7 auf Gattungs- und B-Artenebene. c Heatmap signifikanter unterschiedlich häufiger Gattungen und Arten (lineares Modell, FDR < 0,1). Die Farben der Zellen geben die Richtung und das Ausmaß der normalisierten Häufigkeit an. Nebenstehende Boxplots zeigen die Häufigkeit einiger ausgewählter Taxa. Die Mittellinie gibt den Median der Daten an, die Grenzen des Kästchens stellen den Interquartilbereich dar und die Whiskers geben den Bereich der Daten ohne Ausreißer an. Farben und Formen der Punkte innerhalb der Boxplots geben die Art der Behandlung und die Tage der Probenentnahme an.

Durch die Analyse des taxonomischen Profils des Mikrobioms an jedem Probenahmetag (normalisiert auf den Ausgangswert; detailliert in den Methoden) fanden wir 19 Gattungen (12 mit der genauen Gattungsanmerkung), deren Häufigkeit sich zwischen BDL- und ShamOP-Mäusen signifikant unterscheidet (Abb. 2c und Ergänzungstabelle). 3, lineares Modell, FDR < 0,05). Von den 19 bedeutenden Gattungen wurden neun in der BDL-Gruppe angereichert, während zehn in der ShamOP-Mäuse angereichert wurden. Escherichia und Eubacterium waren die am häufigsten angereicherten Gattungen bei BDL- und ShamOP-Mäusen (mittlere normalisierte Häufigkeit der drei Tage nach der Operation = 5,23 bzw. 2,22) (Ergänzungstabelle 3). Als wir neben Escherichia speziell Gattungen mit exakter Gattungsanmerkung untersuchten, wiesen fünf Gattungen im Vergleich zu ShamOP-Mäusen (lineares Modell, FDR < 0,05) eine signifikant höhere relative Häufigkeit von BDL auf, darunter Enterococcus und Prevotella, von denen zuvor in Studien an Mäusen und Menschen berichtet wurde, dass sie eine Förderung bewirken Lebererkrankung oder -entzündung31,32. Im Gegensatz dazu umfassten sechs Gattungen, die signifikant an ShamOP-Mäusen angereichert waren, bekannte Butyrat-produzierende Bakterien wie Anaerotruncus, Blautia, Eubacterium und Lachnoclostridium (lineares Modell, FDR < 0,05)33,34. Einige Gattungen zeigten deutliche Trends bei den Veränderungen der relativen Häufigkeit. Beispielsweise nahm die relative Häufigkeit von Anaerotruncus bei BDL-Mäusen bis zum siebten Tag nach der Operation weiter ab (Abb. 2c und Ergänzungstabelle 3).

Auf Artenebene fanden wir insgesamt 128 Arten (16 mit exakter Artenanmerkung), deren Häufigkeit sich zwischen den BDL- und ShamOP-Mäusen signifikant unterscheidet (Abb. 2c und Ergänzungstabelle 4, lineares Modell, FDR <0, 05). Es wurde festgestellt, dass 22 und 106 dieser Arten in den BDL- bzw. ShamOP-Mäusen signifikant angereichert waren. Escherichia coli und Enterococcus faecalis waren bei BDL-Mäusen am stärksten angereichert (durchschnittliche normalisierte Häufigkeit der drei Tage nach der Operation = 5,24 bzw. 4,26). Arten, die zu Clostridiales und Lachnospiraceae gehören, waren bei ShamOP-Mäusen am stärksten angereichert (mittlere normalisierte Häufigkeit der drei Tage nach der Operation = 3,35 bzw. 3,33) (Ergänzungstabelle 4). Es wurde berichtet, dass mehrere deutlich unterschiedliche Arten einen negativen oder positiven Zusammenhang mit der Entwicklung von Lebererkrankungen haben. Bei NAFLD-Patienten mit fortgeschrittener Fibrose wurde eine erhöhte Häufigkeit von E. coli beobachtet und könnte zur entzündungsfördernden Aktivität beitragen35. Es wurde berichtet, dass Enterococcus faecalis die alkoholische Hepatitis bei Mäusen verschlimmert36. Eine Mäusestudie ergab eine höhere Häufigkeit von Bacteroidales-Bakterien in der Gruppe mit alkoholischer Fettlebererkrankung (AFLD) im Vergleich zur Kontrollgruppe37. Auch in unserer Studie hatten Bacteroidales-Arten einen höheren BDL-Gehalt im Vergleich zu ShamOP-Mäusen (Abb. 2c und Ergänzungstabelle 4).

Andererseits waren Butyrat-produzierende Bakterien wie Lachnospiraceae-Bakterium A2, Lachnospiraceae-Bakterium A4 und Anaerotruncus sp G3 (2012) bei ShamOP-Mäusen signifikant höher (Abb. 2c, lineares Modell, FDR < 0,05)11. Das Lachnospiraceae-Bakterium A2 zeigte an allen drei Tagen nach der Operation einen signifikanten Rückgang der relativen Häufigkeit bei BDL-Mäusen, während sich seine relative Häufigkeit bei ShamOP-Mäusen nicht veränderte. Es wurde berichtet, dass Bakterien der Gattung Oscillibacter bei gesunden Personen häufiger vorkommen als bei Personen mit NAFLD38. Im Gegenteil wurde auch berichtet, dass Oscillibacter bei nicht-diabetischen adipösen Frauen mit Lebersteatose in Zusammenhang steht39. Ein Mitglied dieser Gattung, Oscillibacter sp 1-3, wurde in ShamOP im Vergleich zu BDL-Mäusen häufiger gefunden (lineares Modell, FDR < 0,05). Allerdings nahm seine relative Häufigkeit bei BDL-Mäusen kontinuierlich ab. Interessanterweise hat eine weitere nützliche Bakterienart, Parabacteroides goldsteinii, entzündungshemmende Eigenschaften bei durch fettreiche Ernährung verursachter Fettleibigkeit gezeigt40 und wurde in BDL im Vergleich zu ShamOP-Mäusen in höherer relativer Häufigkeit gefunden (lineares Modell, FDR < 0,05).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass BDL signifikante Veränderungen in der Struktur der Darmgemeinschaft verursachte, wie Beta-Diversitätsvergleiche mit den ShamOP-Mäusen zeigten. Darüber hinaus waren viele Arten von der Blockade des Gallensäureflusses im Darm betroffen, was sich in einem Rückgang der bekannten Butyratproduzenten und einer Zunahme von Bakterien zeigte, die hauptsächlich mit Lebererkrankungen in Zusammenhang stehen.

Die hier verwendete Shotgun-Metagenomik-Analyse der Stuhlproben ermöglichte es uns, anschließend die Signalwege und Enzymprofile der mikrobiellen Gemeinschaften in den beiden Mäusegruppen zu kommentieren. Mit HUMAnN341 haben wir 392 Signalwege und 1790 ECs identifiziert. Die Analyse der Signalwegprofile zeigte, dass BDL nicht nur die Zusammensetzung des Mikrobioms, sondern auch das Funktionsprofil der Gemeinschaft verändert. Im Gegensatz zur Taxonomie wurde auf funktioneller Ebene ein signifikanter Unterschied beobachtet, als wir die Community-Alpha-Diversitäten zwischen BDL-Mäusen und ShamOP-Mäusen verglichen, gemessen als Shannon-, Simpson- und Chao1-Indizes (lineares gemischtes Modell, P-Wert < 0,05, ergänzend). Tabelle 5). Darüber hinaus war die Beta-Diversität der Pathway-Profile zwischen BDL- und ShamOP-Gruppen, die Proben aller Zeitpunkte zusammenfassten, signifikant unterschiedlich (PERMANOVA, P-Wert < 0,05). Die Signalwegzusammensetzung veränderte sich sowohl bei BDL- als auch bei ShamOP-Mäusen vom Ausgangswert bis zum ersten Tag nach der Operation signifikant (PERMANOVA, P-Wert < 0,05). Ebenso deuten unsere Ergebnisse im taxonomischen Profil des Mikrobioms darauf hin, dass ein Bauchschnitt auch zu Veränderungen im Funktionspotenzial der Mikrobiota führen würde. Diese signifikanten Veränderungen hielten bis zum dritten Tag bei BDL-Mäusen an (PERMANOVA, P-Wert < 0,05), jedoch nicht bei den ShamOP-Mäusen (PERMANOVA, P-Wert > 0,05). Obwohl sich bei den BDL-Mäusen die Taxonomiezusammensetzung von Tag 3 bis Tag 7 weiterhin signifikant änderte (Abb. 2a, b), folgte das Funktionsprofil der Gemeinschaft nicht (Ergänzungstabelle 5, PERMANOVA, P-Wert > 0, 05).

Wir haben die Häufigkeit von Signalwegen und Enzymen auf ihren Ausgangswert normalisiert und die Funktionsprofile zwischen den BDL- und ShamOP-Mäusen verglichen. Wir beobachteten, dass sich die relative Häufigkeit von 195 Funktionswegen und 762 ECs zwischen den BDL- und ShamOP-Mäusen nach der Operation signifikant unterschieden (Abb. 3, lineares Modell, FDR < 0,05); 139 und 56 Signalwege sowie 483 und 279 Gene wurden in BDL- bzw. ShamOP-Mäusen angereichert (Ergänzungstabellen 6 und 7). Der Biotin-Biosyntheseweg (PWY-5005) war in der relativen Häufigkeit bei den BDL-Mäusen deutlich geringer (lineares Modell, FDR < 0,05) und ein beteiligtes Gen, das für das Enzym 6-Carboxyhexanoat-CoA-Ligase (EC 6.2.1.14) kodiert im Biotin-Biosyntheseweg war bei BDL-Mäusen signifikant niedriger (lineares Modell, FDR < 0,05). Biotin reduziert Hepatotoxizität und oxidativen Stress in der Leber diabetischer Mäuse, und ein Biotinmangel verstärkt die Sekretion entzündungsfördernder Zytokine in einer Studie am Menschen42. Die Biosynthesewege von zwei verzweigtkettigen Aminosäuren (BCAAs), Isoleucin und Valin (ILEUSYN-PWY und VALSYN-PWY), waren bei ShamOP-Mäusen im Vergleich zu BDL-Mäusen signifikant höher (Abb. 3a und Ergänzungstabelle 6, lineares Modell, FDR). < 0,05). Es wurde festgestellt, dass NAFLD-Patienten mit fortschreitender Krankheit erhöhte Isoleucin- und Valinspiegel aufwiesen43. Es wurde jedoch auch berichtet, dass Isoleucin und Valin die Fettansammlung in der Leber im Frühstadium der NAFLD reduzieren und akute Leberschäden bei Mäusen verhindern und die Immunfunktion bei Patienten mit fortgeschrittener Leberzirrhose wiederherstellen könnten44,45. Mehrere ECs, die zur Isoleucin- und Valin-Biosynthese beitragen, wiesen bei ShamOP-Mäusen eine signifikant höhere Häufigkeit auf (Abb. 3b und Ergänzungstabelle 7, lineares Modell, FDR <0,05), einschließlich Ketolsäurereduktoisomerase (NADP+) (EC 1.1.1.86) und Acetolactatsynthase (EC 2.2.1.6) und Dihydroxysäure-Dehydratase (EC 4.2.1.9). Auch die Biosynthesewege von Arginin (ARGSYN-PWY und ARGSYNBSUB-PWY) waren bei ShamOP-Mäusen signifikant höher (Abb. 3a, lineares Modell, FDR < 0,05). Eine Mäusestudie legte nahe, dass ein Arginin- und Gallensäurekonjugat eine mögliche Behandlung für NAFLD sein könnte46. Das mikrobielle Funktionspotenzial bei der Produktion von Ornithin (GLUTORN-PWY), einer Verbindung, die bei NAFLD47 eine hepatoprotektive Wirkung hat, war bei BDL-Mäusen ebenfalls signifikant geringer (Abb. 3a, lineares Modell, FDR < 0,05). Darüber hinaus lindert Spermidin akute Leberschäden48 und der Spermidin-Biosyntheseweg (PWY-6834) war bei BDL-Mäusen im Vergleich zu ShamOP-Mäusen signifikant niedriger (Abb. 3a, lineares Modell, FDR < 0,05). Dieser Signalweg wies bei BDL-Mäusen einen deutlich abnehmenden Trend auf, während seine relative Häufigkeit während der Zeit nach der Operation bei ShamOP-Mäusen nur geringfügig schwankte. Innerhalb des Spermidin-Biosynthesewegs waren zwei ECs, N1-Aminpropylagmatin-Ureohydrolase (EC 3.5.3.24) und Adenosylmethionin-Decarboxylase (EC 4.1.1.50), bei ShamOP-Mäusen im Vergleich zu BDL-Mäusen signifikant höher (Abb. 3b und lineares Modell der Ergänzungstabelle 7, FDR <). 0,05). Ein für die Taurin-Pyruvat-Aminotransferase (EC 2.6.1.77) kodierendes Gen, das Alanin produziert, das die Wiederherstellung einer geschädigten Leber fördert49, war bei ShamOP-Mäusen ebenfalls signifikant höher (Abb. 3b, lineares Modell, FDR < 0,05). Darüber hinaus war die relative Häufigkeit des Peptidoglycan-Biosynthesewegs (PWY-5265) bei BDL-Mäusen signifikant höher als bei ShamOP-Mäusen (Ergänzungstabelle 6, lineares Modell, FDR <0,05), während Peptidoglycan ein entzündungsfördernder Faktor war, von dem festgestellt wurde, dass er den Biosyntheseweg (PWY-5265) induziert Fortschreiten der Steatohepatitis50. EC 2.3.2.17, ein Gen, das für ein Enzym kodiert, das an der Peptidoglycan-Biosynthese beteiligt ist, war bei BDL-Mäusen signifikant höher (Ergänzungstabelle 7, lineares Modell, FDR < 0,05).

Vulkandiagramme, die die unterschiedlichen a-Pfade und b-EC-Faltenänderungsprofile in den beiden Gruppen BDL und ShamOP zeigen. Die horizontalen gestrichelten Linien stellen den −log10 angepassten P-Wert bei FDR bei 0,05 dar (lineares Modell). Mehrere Pfade und ECs, die wir im Haupttext besprechen, werden als Boxplots dargestellt. Die Mittellinie darin gibt den Median der Daten an, die Grenzen der Box stellen den Interquartilbereich dar und die Whiskers geben den Bereich der Daten ohne Ausreißer an.

Im Gegenteil, die Biosynthesewege von Menachinon (PWY-5838, PWY-5840, PWY-5861, PWY-5897 und PWY-5899) wiesen bei BDL-Mäusen im Vergleich zu ShamOP-Mäusen eine signifikant höhere relative Häufigkeit auf (Abb. 3a und Ergänzung). Tabelle 6 (Lineares Modell, FDR < 0,05). Darüber hinaus wurde berichtet, dass NAFLD-Patienten mit Fibrose ein höheres Potenzial für die bakterielle Menachinonproduktion haben als NAFLD-Patienten ohne Fibrose51. Zu guter Letzt untersuchten wir, ob eine Einschränkung des Gallensäureflusses die Fähigkeit des Darmmikrobioms zur Produktion von Butyrat beeinträchtigen würde. Obwohl wir auf Taxonomieebene signifikante Unterschiede in der Häufigkeit der Butyratproduzenten festgestellt haben, unterschied sich keiner der Butyratproduktionswege in unserem Datensatz (PWY-5022, PWY-5676, P162-PWY und CENTFERM-PWY) signifikant relative Häufigkeit zwischen den beiden Studiengruppen (Ergänzungstabelle 6, lineares Modell, P-Wert = 0,16-1). Dennoch war die relative Häufigkeit von zwei ECs, die an diesen Butyrat-produzierenden Wegen beteiligt sind, Butyratkinase (EC 2.7.2.7) und 3-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydratase (EC 4.2.1.55), bei BDL-Mäusen im Vergleich zu ShamOP-Mäusen signifikant geringer (Abb . 3b, lineares Modell, FDR < 0,05).

Insgesamt wurde das funktionelle Potenzial des Mikrobioms in BDL-Mäusen stark beeinträchtigt, einschließlich einer Verringerung der Produktion entzündungshemmender und hepatoprotektiver Verbindungen (Biotin, Isoleucin, Valin, Ornithin, Arginin und Spermidin) und einer erhöhten Produktion von Menachinon. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass auch bestimmte ECs, die an der Butyrat-Biosynthese beteiligt sind, bei BDL-Mäusen verringert sind.

Als nächstes wollten wir untersuchen, wie die durch BDL induzierte Umgestaltung des Darmmikrobioms mit dem Zytokinprofil zusammenhängt. Wir führten eine Drei-Wege-Korrelationsanalyse zwischen dem Zytokinprofil, dem Funktionsprofil und dem Taxonomieprofil durch, um zu bestimmen, welche Taxa und Funktionen mit dem Unterschied in den gemessenen Zytokinspiegeln verbunden waren. Um zu bestimmen, welche Taxa/Funktionen bei einer Einschränkung des Gallensäureflusses zur Leberschädigung beitragen können, konzentrierten wir uns auf die Zytokine, Gattungen, Arten, Signalwege und ECs, deren Häufigkeit sich zwischen der BDL- und der Schein-OP-Gruppe nach der Normalisierung auf die Ausgangswerte deutlich unterschied ( verallgemeinertes lineares Modell oder lineares Modell, FDR < 0,05).

Wie in Abb. 4 gezeigt, korrelierten die Butyrat-produzierenden Gattungen Anaerotruncus, Blautia, Eubacterium und Lachnolostridium, die in BDL-Mäusen seltener gefunden wurden, signifikant positiv (Spearman-Korrelation, P-Wert < 0,05) mit dem Biosyntheseweg von Biotin (PWY-5005). ), die bei BDL-Mäusen ebenfalls deutlich niedriger war. Zwei Arten aus diesen butyratproduzierenden Gattungen, Eubacterium sp. 14-2 und Anaerotruncus sp. G3 (2012) korrelierten ebenfalls signifikant positiv mit diesem Biosyntheseweg. Im Gegensatz dazu zeigten zwei Gattungen, die häufiger bei BDL-Mäusen vorkamen, Enterococcus und Prevotella, und zwei Arten, die ebenfalls häufiger bei BDL-Mäusen vorkamen, Enterococcus faecalis und das Bakterium Bacteroidales M14, signifikante negative Korrelationen mit dem Biotin-Produktionsweg (Abb. 4, Spearman-Korrelation). , P-Wert < 0,05). Darüber hinaus korrelierte das funktionelle Potenzial der Mikrobiota, die Biotin synthetisiert, signifikant negativ mit den proinflammatorischen Zytokinen IL-6 und IL-23 (Abb. 4, Spearman-Korrelation, P-Wert < 0,05). Es wurde festgestellt, dass ein hoher IL-6-Spiegel das Risiko für NAFLD erhöht52, und IL-23 war bei NASH-Patienten erhöht und es wurde vermutet, dass es indirekt mit Lebersteatose und proinflammatorischer Reaktion bei NAFLD zusammenhängt53.

Die dargestellten Gattungen und Arten unterscheiden sich deutlich zwischen BDL- und ShamOP-Mäusen (lineares Modell, FDR < 0,05). Die gezeigten Signalwege unterscheiden sich bei BDL-Mäusen deutlich von denen bei ShamOP-Mäusen (lineares Modell, FDR < 0,05). Die gezeigten ECs sind Teil der signifikanten Signalwege und haben sich bei BDL im Vergleich zu ShamOP-Mäusen deutlich verändert. Pfade, die nicht mindestens eine signifikante Korrelation (Spearman-Korrelation, P-Wert < 0,05) mit den signifikanten Taxa (lineares Modell, FDR < 0,05) und Zytokinen (generalisiertes lineares Modell, FDR < 0,05) aufweisen, wurden entfernt. Die Bedeutung von Korrelationen wird durch Sternchensymbole angezeigt, wobei ein einzelnes Sternchen (*) einen P-Wert < 0,1 und ein doppeltes Sternchen (**) einen P-Wert < 0,05 anzeigt.

Anaerotruncus, Blautia, Eubacterium und Lachnolostridium hatten ebenfalls positive Korrelationen mit der Darmmikrobiota-Biosynthese von zwei Aminosäuren, Ornithin und Arginin (GLUTORN-PWY und ARGSYNBSUB-PWY) (Abb. 4, Spearman-Korrelation, P-Wert < 0,05). Diese beiden Biosynthesewege waren bei BDL-Mäusen geringer und waren auch stark positiv mit Eubacterium sp. verknüpft. 14-2 und Anaerotruncus sp. G3 (2012). Im Gegensatz dazu wurden signifikante negative Korrelationen zwischen dem Ornithin-Produktionsweg und Prevotella und dem Biosyntheseweg von Arginin und Enterococcus gezeigt (Abb. 4, Spearman-Korrelation, P-Wert < 0,05). Bacteroidales-Bakterien, die häufiger in BDL-Mäusen gefunden wurden (Bacteroidales-Bakterium M10, Bacteroidales-Bakterium M11, Bacteroidales-Bakterium M12 und Bacteroidales-Bakterium M14), korrelierten negativ mit den beiden Aminosäure-Biosynthesewegen (Abb. 4, Spearman-Korrelation, P-Wert < 0,05). ). Darüber hinaus korrelierten die Biosynthesewege von Ornithin und Arginin negativ mit MCP-1, einem Zytokin, das zur Lebersteatose und -fibrose beiträgt54,55.

Darüber hinaus fanden wir heraus, dass die funktionelle Fähigkeit der Mikrobiota, Spermidin (PWY-6834) zu synthetisieren, signifikant positiv mit Anaerotruncus, Blautia, Eubacterium und Lachnolostridium korreliert (Abb. 4, Spearman-Korrelation, P-Wert < 0,05). Andererseits war der Spermidin-Biosyntheseweg bei BDL-Mäusen geringer. Zwei Arten, die bei BDL-Mäusen niedriger waren, Anaerotruncus sp. G3 (2012) und das Lachnospiraceae-Bakterium A2 korrelierten ebenfalls positiv mit dem Spermidin-Produktionsweg. Andererseits korrelierten Enterococcus, Prevotella, Bacteroidales-Bakterium M11 und Bacteroidales-Bakterium M14 negativ mit diesem Signalweg (Abb. 4, Spearman-Korrelation, P-Wert < 0,05). Darüber hinaus korrelierte der Spermidin-Biosyntheseweg negativ mit IFN-beta und MCP-1 (Abb. 4, Spearman-Korrelation, P-Wert < 0,05).

Wir beobachteten auch geringere Mengen an Isoleucin- und Valin-Produktionswegen (ILEUSYN-PWY und VALSYN-PWY) bei BDL-Mäusen. Diese Wege korrelierten positiv mit Lachnolostridien und Eubacterium sp. 14-2 und korrelierte negativ mit dem Bacteroidales-Bakterium M10, dem Bacteroidales-Bakterium M11 und dem Bacteroidales-Bakterium M12 (Abb. 4, Spearman-Korrelation, P-Wert < 0,05). Darüber hinaus zeigten die proinflammatorischen Zytokine IL-6 und MCP-1 signifikante negative Korrelationen mit dem funktionellen Potenzial von Mikrobiota, die Isoleucin und Valin synthetisieren (Abb. 4, Spearman-Korrelation, P-Wert < 0,05).

Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Menachinon-Biosynthese der Mikrobiota (einschließlich PWY-5840, PWY 5899, PWY-5897, PWY-5861 und PWY-5838) bei BDL höher war und signifikante positive Korrelationen mit den beiden am stärksten angereicherten Arten aufwies BDL, E. coli und E. faecalis. Diese Biosynthesewege korrelierten negativ mit Eubacterium sp. 14-2 und Oscillibacter sp. 1-3 (Abb. 4, Spearman-Korrelation, P-Wert < 0,05). GM-CSF, IFN-β, IL-23, IL-6, MCP-1 und TNF-α haben einen starken positiven Zusammenhang mit der funktionellen Fähigkeit der Mikrobiota, Menachinon zu produzieren (Abb. 4, Spearman-Korrelation, P-Wert). < 0,05).

Unsere Analyse untersuchte den Zusammenhang zwischen dem Entzündungszustand des Wirts und dem Darmmikrobiom und beleuchtet mehrere mögliche Mechanismen der Darmmikrobiota-Beiträge bei Leberschäden, wenn der Gallensäurefluss in den Darm stoppt. Die durch BDL induzierten taxonomischen Veränderungen waren mit einer Verringerung der Biosynthese nützlicher Verbindungen (Biotin, Ornithin, Arginin, Spermidin, Isoleucin und Valin) und einer erhöhten Menachinonproduktion im Darm verbunden, was zur Förderung entzündungsfördernder Zytokine führte ( wie IL-6 und MCP-1) und verstärkter Leberschädigung, wie durch ihre Korrelation mit Leberschädigungsmarkern (wie ALAT und ASAT) gezeigt wird.

Die Darm-Leber-Achse umfasst den Darm, der etwa 70–75 % des Blutflusses zur Leber liefert56. Die Leber ist ein entscheidender Bestandteil des Immunsystems und fungiert als zentraler Kommunikationspunkt zwischen der Darmmikroumgebung und dem Stoffwechsel des Wirts. Dadurch ist die Leber zahlreichen bakteriellen Bestandteilen, Metaboliten und Signalen ausgesetzt, die aus dem Mikrobiom stammen. Aktuellen Forschungsergebnissen zufolge fungieren Gallensäuren als pleiotrope Signalmoleküle, die den Crosstalk zwischen Darm und Leber vermitteln57,58. Die komplexe Wechselwirkung zwischen Gallensäuren und der Darmflora (die gegenseitige Abhängigkeit und Hemmung beinhaltet) ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Homöostase bei Säugetieren. Nicht konjugierte Gallensäuren können den pH-Unterschied über die Zellmembran hinweg ausgleichen. Zellmembranschäden können direkt aus dem anschließenden Fehlen von Bioenergie durch die Protonenpumpe resultieren. Gallensäuren verhindern schließlich das Wachstum einiger Bakterien und sind an der Entwicklung des Darmmikrobioms beteiligt59. Parallel dazu sind Gallensäuren essentielle Moleküle für die bidirektionale Regulierung zwischen Leber und Darm und werden durch zwei Signalwege aktiviert. Ein Signalmolekül bindet an den G-Protein-gekoppelten Gallensäurerezeptor 1 (GPBAR1 oder TGR5), der die Lebersteatose und die Entzündungsreaktion reguliert und die Expression des FXR aktiviert; Dies steuert dann das Gleichgewicht des Energiestoffwechsels, steuert die Lebersteatose und die Entzündungsreaktion und beeinflusst die Zusammensetzung des Darmtrakts. Infolgedessen kann die Pathophysiologie von Lebererkrankungen durch die Verwendung von Gallensäuren als Signalmoleküle durch das Darmmikrobiom beeinflusst werden12,60,61,62. Neue Behandlungen könnten auf einem besseren Verständnis der genauen Wirkungsbereiche des Darmmikrobioms und der Gallensäuren in verschiedenen Signalwegen bei Lebererkrankungen basieren.

Die Notwendigkeit, die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die am Zusammenspiel von Darmmikrobiota, Gallensäuren und Lebererkrankungen beteiligt sind, wurde durch eine aktuelle Mäusestudie29 weiter unterstrichen, in der BDL an keimfreien (GF) Mäusen und veränderter Schaedler-Flora durchgeführt wurde -Kolonisierte Mäuse. Akute Cholestase verursachte bei GF eine schwerere Leberschädigung im Vergleich zu Mäusen mit begrenzter mikrobieller Belastung im Darm, was, wie die Autoren gezeigt haben, mit Veränderungen der hepatischen Genexpression verbunden war, die an der Gewebereparatur und mehreren Stoffwechsel- und Immunfunktionen mit hepatoprotektiven Wirkungen beteiligt sind. Dennoch blieben die Rolle einzelner Mikrobenarten und die Funktionsmechanismen für die mikrobiell induzierten Unterschiede, die Leberschäden modulieren, unklar. Um diese Lücke zu schließen und gezielte Veränderungen der Darmmikrobiota vorzuschlagen, die zur Abschwächung von Leberschäden beitragen können, haben wir hier eine Shotgun-Metagenomik-Sequenzierung im BDL-Mäusemodell und in ShamOP-Mäusen mit Längsschnittproben durchgeführt. Darüber hinaus untersuchten wir, wie die Veränderungen der mikrobiellen Artenzusammensetzung und des Biosynthesepotenzials als Reaktion auf den Stopp der Gallensäuren von der Leber in den Darm mit biochemischen und entzündlichen Profilen zusammenhängen.

Die BDL-Operation veränderte das Mikrobiom von Mäusen, was zu sehr unterschiedlichen Merkmalen im Vergleich zur ShamOP-Kontrolle führte. Wie die Taxonomie veränderte der Bauchschnitt die Funktionsfähigkeit des Mikrobioms sowohl bei BDL- als auch bei ShamOP-Mäusen, während die Veränderungen nur bei BDL-Mäusen beibehalten wurden. Unsere Analyse der Signalwege und ECs zeigte die funktionelle Rolle der Mikrobiota bei der Pathogenese bei akuten Leberschäden. BDL reduziert die Produktion hepatoprotektiver Verbindungen im Darm, wie Biotin, Spermidin, Arginin, Ornithin, Isoleucin und Valin42,44,45,46,48,63. BDL induziert die bakterielle Menachinonproduktion. Es kann die Schädigung der Leber verstärken, indem es Vitamin-K-abhängige Proteine fördert, die eine wesentliche Rolle bei chronischer Leberfibrose spielen64. Die Häufigkeit von ECs für die Butyratproduktion war bei BDL-Mäusen deutlich zurückgegangen, was auf eine mögliche Rolle der Gallensäure bei der Stabilisierung des Butyratspiegels im Darm schließen lässt65. Die Verringerung des funktionellen Potenzials der Darmmikrobiota bei der Produktion mehrerer hepatoprotektiver Verbindungen (Biotin, Ornithin, Arginin, Spermidin, Isoleucin und Valin) ist mit der Abnahme der nützlichen Bakterien Anaerotruncus, Blautia, Eubacterium und Lachnoclostridium und der Zunahme schädlicher Bakterien verbunden Bakterien bei Lebererkrankungen (E. coli, E. faecalis und Bacteroidales-Arten). Die Biosynthese dieser Verbindungen war negativ mit entzündlichen Zytokinen (IL-6, IL-23 und MCP-1) assoziiert, die bei NAFLD mit Lebersteatose und -fibrose verbunden sind52,53,54,55. Im Gegensatz dazu ist die höhere Menachinonproduktion im Darmmikrobiom von BDL-Mäusen mit einer erhöhten E. coli- und E. faecalis-Erhöhung und einer verringerten Butyrat-produzierenden Bakterienzahl verbunden. Die Menachinonproduktion war positiv mit entzündlichen Zytokinen (GM-CSF, IFN-β, IL-23, IL-6, MCP-1 und TNF-α) assoziiert. Diese Ergebnisse verdeutlichen den Zusammenhang zwischen Zytokinprofilen und der Darmmikrobiota und offenbaren den möglichen Mechanismus, durch den die Darmmikrobiom zu Entzündungen und Leberschäden beiträgt.

Laut Gergiev et al. treten die meisten durch BDL verursachten Verletzungen innerhalb der ersten 5 bis 7 Tage auf, wobei bis zum 3. Tag akute Entzündungsprozesse beobachtet werden und nach dem 566. Tag eine signifikante Gallengangsproliferation festgestellt wird. Reparaturmechanismus und Gallengangsproliferation Bestimmen Sie die molekulare Anpassung in der zweiten Woche und stellen Sie den teilweisen Gallenfluss wieder her, der sich auf das Mikrobiom auswirkt. Daher haben wir uns in unserer Studie auf die ersten Tage (Tage 1, 3 und 7) nach der Operation konzentriert, um mögliche Verzerrungen zu vermeiden, die durch die Wiederherstellung des Gallenflusses zu späten Zeitpunkten entstehen. Darüber hinaus weist unsere Studie auch Einschränkungen auf. Die Längsschnittprobenahme dauerte 7 Tage, während eine schwerere Leberschädigung (Leberfibrose), die durch BDL verursacht wurde, 20 Tage brauchte, um sich vollständig zu entwickeln24. Wir konnten die Rolle des Darmmikrobioms bei der Entstehung von Leberschäden nur in der Anfangsphase untersuchen. Die Zusammensetzung einzelner Bakterienarten und ihre jeweiligen Funktionen können sich im Verlauf der Krankheit weiter verändern und ein anderes Muster zeigen. Die in dieser Studie beobachteten Veränderungen können zu den anfänglichen Auswirkungen von BDL und der Entwicklung von Leberschäden beitragen, stehen jedoch möglicherweise nicht in direktem Zusammenhang mit einer schweren Lebererkrankung. Diese cholestasebedingten und BA-abhängigen Veränderungen der Darmmikrobiota und -biochemie während der ersten sieben Tage der Studie könnten als Vorläufer dienen und die Veränderungen im Zusammenhang mit schwereren Lebererkrankungen fördern. Zukünftige Studien könnten das Experiment auf mindestens 20 Tage verlängern, um einen vollständigen Überblick über den Beitrag der Darmmikrobiota während der laufenden Fibrogenese zu erhalten. Es gibt auch einige Unterschiede zwischen den Gallensäurepools von Menschen und Mäusen, die die Übertragbarkeit unserer Erkenntnisse auf den Menschen einschränken könnten. Die Gallensäurezusammensetzung unterscheidet sich zwischen Mäusen und Menschen, wobei hydrophile 6-hydroxylierte Muricholsäuren die Hälfte des BA-Pools bei Mäusen ausmachen. Darüber hinaus hat Cholestase unterschiedliche Auswirkungen auf die BA-Produktion bei Mäusen und Menschen, wobei BDL die BA-Synthese bei Mäusen erhöht, während Cholestase beim Menschen die BA-Synthese verringert67,68. Zukünftige Studien könnten humanisierte Mausmodelle verwenden, um diese Einschränkungen zu beheben und unser Verständnis des Zusammenhangs zwischen Gallensäuren, Darmmikrobiomen und der menschlichen Gesundheit zu verbessern.

Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse jedoch den Beitrag der Darmmikrobiota und ihren potenziellen molekularen Mechanismus bei beeinträchtigtem Gallensäurefluss von der Leber zum Darm bei Leberentzündungen oder sogar bei laufender Fibrogenese, indem sie auf die Beziehung zwischen dem Stoffwechsel, dem Darmmikrobiom und dem Darm abzielen Immunsystem. Unsere Ergebnisse erweitern auch unser Wissen über die Rolle von Gallensäuren als Eckpfeiler der Immunachse zwischen der Leber und dem Darmmikrobiom und ihre optimale Nutzung als potenzielle therapeutische Ziele.

Alle Tierversuche in dieser Studie wurden von der unabhängigen Ethikkommission bewertet und vom Thüringer Landesverwaltungsamt gemäß den europäischen und deutschen Gesetzen und Vorschriften unter der Lizenz UKJ-19-010 genehmigt. Für alle Experimente wurden männliche und weibliche FVB/NRj-Mäuse (Janvier Laboratory, Frankreich) unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten und in der Tierhaltungseinrichtung des Universitätsklinikums Jena (Deutschland) gezüchtet. Alle Tiere erhielten LASQ-Diät (Rod 16, Auto) der Firma Altromin, die aus Getreide, pflanzlichen Nebenprodukten, Mineralien, Ölen, Fetten und Hefe bestand und den Mäusen Rohnährstoffe mit 16,9 % Rohprotein und 4,3 % Rohprotein lieferte Fett, 4,3 % Rohfaser und 7,0 % Rohasche.

Alle Tiere wurden gewogen, bewertet und erhielten 1 Tag und 1 Stunde vorher 1 mg kg-1 Körpergewicht (KG)-1 Meloxicam oral (Meloxicam, CP-Pharma Handelsgesellschaft mbH, Burgdorf, Deutschland, 0,5 mg mL-1 orale Suspension). Operation. Die präoperative Vorbereitung, chirurgische Eingriffe unter Narkose (Isofluran, CP-Pharma Handelsgesellschaft mbH, Burgdorf, Deutschland, 1,5–3 % in 100 ml min−1 O2-Inhalation) und die postoperative Behandlung wurden bereits zuvor beschrieben24,69. Der Gallengang wurde mit zwei vorgeschnittenen 6-0 geflochtenen Seidennähten (Teleflex Medical GmbH, Fellbach, Deutschland, zuvor sterilisiert und in 70 % Ethanol eingeweicht) abgebunden (BDL-Gruppe). Im Gegensatz dazu erhielt die Scheinoperationsgruppe (ShamOP) bis auf die Gallengangligatur die gleichen chirurgischen Eingriffe. Anschließend wurden die Bauchschichten verschlossen und mit 4-0 antibakteriellen Nähten vernäht (Johnson & Johnson Medical GmbH Ethicon, Norderstedt, Deutschland, Vicryl Plus mit vormontierter 17 mm 1/2c RB-1 plus Nadel). Eine 2 bis 4 μg g-1 BW-1 Bupivacain-Lösung (PUREN Pharma GmbH, München, Deutschland, 2,5 mg mL-1), verabreicht als intrainzisionale Injektion während des Nähens, verstärkte die postoperative Analgesie. Nach der Operation wurden die Tiere erneut gewogen und erhielten subkutan 20 µL g-1 BW-1 Ringeracetat (Berlin Chemie AG, Berlin, Deutschland). Die Tiere erholten sich getrennt in Einzelkäfigen mit freiem Zugang zu Wasser und Weichfutter unter einer Wärmelampe. Cholestase manifestierte sich bei allen Tieren der BDL-Gruppe (jedoch nicht in der ShamOP-Gruppe) als Verfärbung des Urins und Gelbfärbung der Pfoten oder der Hornhaut etwa 12 Stunden nach der Operation. Die Tiere wurden 1, 3 oder 7 Tage lang nachbeobachtet. Das Körpergewicht wurde morgens und abends gemessen. Alle Tiere erhielten zweimal täglich eine Flüssigkeitsreanimation, bis das Körpergewicht ungefähr das Niveau vor der Operation erreichte. Darüber hinaus wurden die orale Analgesie und die Bewertung dreimal täglich durchgeführt.

Frischer Stuhl wurde 1 Stunde vor der Operation und 1, 3 und 7 Tage danach gesammelt. Der Stuhl wurde mit einer sterilisierten Pinzette aufgenommen und in ein 2-ml-Mikroröhrchen überführt, wo er sofort in flüssigem Stickstoff zur mikrobiellen DNA-Extraktion eingefroren wurde.

Am Ende des Experiments (1, 3 oder 7 Tage nach der Operation) wurden die Tiere mit einer anästhetischen Überdosis Xylazin (Rompun, Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Deutschland, 80 mg kg-1 KG-1) und Ketamin ( bela-pharm GmbH, Vechta, Deutschland, 500 mg kg−1 KG−1). Nachdem die Tiere die chirurgische Toleranz erreicht hatten, wurde der Bauch geöffnet und über eine abschließende Herzpunktion Herzblut in eine sterile 1-ml-EDTA-Spritze entnommen, die mit einer 24-G-Nadel verbunden war. Anschließend wurden Leber und Milz entnommen, in flüssigem Stickstoff eingefroren und zur weiteren Analyse in Mikroröhrchen bei –80 °C gelagert.

Das Herzblut wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) mit 15.000 × g zentrifugiert, um Plasma zu erhalten. Anschließend wurden 25 μl Plasma von jedem Tier mit dem LEGENDplex Mouse Inflammation Panel (13-plex) (BioLegend, Koblenz, Deutschland, Nr. 740150) verarbeitet, um die Konzentrationen von 13 entzündlichen Zytokinen zu quantifizieren. Das LEGENDplex Mouse Inflammation Panel ist ein Zytokin-Bead-Array zur Quantifizierung spezifischer Zytokine, die anhand ihrer unterschiedlichen Vorwärtsstreuung und Fluoreszenz identifiziert werden. Der Test wurde mit einem BD Accuri C6 Plus Durchflusszytometer (BD Bioscience, Heidelberg, Deutschland) durchgeführt, das vom Hersteller für diesen Test validiert wurde. Als Ergebnis werden IL-23, IL-1α, IFN-γ, TNF-α, MCP-1, IL-1β, IL-6, IL-27, IL-17A, IFN-β, GM-CSF und anti -Die entzündlichen Zytokine IL-12p70 und IL-10 wurden mittels Durchflusszytometrie identifiziert und anhand einer Standardkurve quantifiziert. Die Datenanalyse wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers unter Verwendung des von BioLegend bereitgestellten Chargen- und Assay-spezifisch kalibrierten Online-Analysetools durchgeführt. Die Gating-Strategie für die verschiedenen Perlen ist herstellerspezifisch und wird im Zytokin-Bead-Array-Kit bereitgestellt.

Die Konzentrationen von 15 Gallensäuren wurden in isolierten Hepatozyten mithilfe einer LC-MS/MS-Quantifizierungsmethode bestimmt: Taurocholsäure (TCA), Glykocholsäure (GCA), Glykochenodesoxycholsäure (GCDCA), Taurochenodesoxycholsäure (TCDCA), Taurolithocholsäuren (TLCA), Glycolithocholsäure (GLCA), Taurodesoxycholsäure (TDCA), Glycodesoxycholsäure (GDCA), Cholsäure (CA), Chenodesoxycholsäure (CDCA), Ursodesoxycholsäure (UDCA), Desoxycholsäure (DCA), Tauroursodesoxycholsäure (TUDCA), Glycoursodesoxycholsäure (GUDCA) und Lithocholsäure (LCA). Vorgewogene Proben wurden mit 3-fach (Gew./Vol.) Ethanol-Phosphat-Puffer (15 % 0,01 mol/L Phosphatpufferlösung pH 7,5, 85 % Ethanol) gemischt, gefolgt von einem Homogenisierungsschritt in einer Kieselmühle (QiaShredder) und ein Zentrifugationsschritt (5 min, 16.000 × g). 270 µL 85 %iges wässriges Methanol wurden zu 30 µL des Probenüberstands in einem Thomson Single Step® Filter Vial (PES-Membran 0,2 µM, Thomson Instrument Company, Kalifornien) gegeben. Diese Lösung wurde 20 Sekunden lang gemischt, 1 Minute lang bei 200 × g zentrifugiert, filtriert und in den Autosampler gegeben. Es wurde ein Agilent 1200 Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesystem (HPLC) (Agilent Technologies GmbH, Böblingen, Deutschland) mit einem CTC-PAL-Autosampler, gekoppelt an ein API 4000 Triple Quadrupol-Massenspektrometer mit Elektrospray-Ionisationsquelle (AB Sciex, Darmstadt, Deutschland) verwendet hindurch. Alle chromatographischen Trennungen wurden mit einer Umkehrphasen-Analysesäule Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 (3,5 µm, 100 × 3 mm) durchgeführt, die mit einer Vorsäule (C18, 4 × 3 mm; Phenomenex, Aschaffenburg, Deutschland) ausgestattet war. Die mobile Phase bestand aus Wasser (A) und Methanol (B), enthaltend 0,012 % Ameisensäure und 5 mM Ammoniumacetat, bei einer Gesamtflussrate von 300 µL min−1.

Das routinemäßige klinische Labor des Universitätsklinikums Jena quantifizierte acht biochemische Marker: Albumin, Aspartat-Transaminase (ASAT), Alanin-Transaminase (ALAT), Glutamat-Dehydrogenase (GLDH, GDH), Gamma-Glutamyltransferase (Gamma-GT), Triglycerid, Laktat-Dehydrogenase (LDH). und alkalische Phosphatase (ALP), wenn Plasma verblieben ist.

Alle Stuhlproben (ca. 200 mg pro Probe) wurden von Novogene (UK) verarbeitet. Die DNA wurde nach dem folgenden Protokoll extrahiert: Stuhlproben wurden gründlich mit 900 μl CTAB-Lysepuffer gemischt. Alle Proben wurden 60 Minuten lang bei 65 °C inkubiert, bevor sie 5 Minuten lang bei 4 °C und 12.000 × g zentrifugiert wurden. Die Überstände wurden in frische 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und für jede Extraktion wurden 900 μl Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1, pH = 6,7; Sigma-Aldrich) zugegeben. Die Proben wurden gründlich gemischt, bevor sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Die Phasentrennung erfolgte durch 15-minütige Zentrifugation bei 12.000 × g und 4 °C, und die obere wässrige Phase wurde mit weiteren 900 μl Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol erneut extrahiert. Anschließend wurden die Proben 10 Minuten lang bei 4 ° C und 12.000 × g zentrifugiert und die oberen wässrigen Phasen in frische 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Die abschließende Extraktion wurde mit 900 μl Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) durchgeführt und die Schichttrennung erfolgte durch 15-minütige Zentrifugation bei 12.000 × g und 4 °C. Die Fällung der DNA wurde durch Zugabe der oberen Phase aus dem letzten Extraktionsschritt zu 450 μl Isopropanol (Sigma-Aldrich) erreicht, das 50 μl 7,5 M Ammoniumacetat (Fisher) enthielt. Die Proben wurden über Nacht bei –20 °C inkubiert, obwohl kürzere Inkubationen (1 Stunde) zu geringeren DNA-Ausbeuten führten. Die Proben wurden 10 Minuten lang bei 4 ° C und 7500 × g zentrifugiert und die Überstände wurden verworfen. Abschließend wurden die DNA-Pellets in 1 ml 70 %igem (v/v) Ethanol (Fisher) gewaschen. Das endgültige Pellet wurde luftgetrocknet und in 200 μl 75 mM TE-Puffer (pH = 8,0; Sigma-Aldrich) resuspendiert. Die Sequenzierungsbibliothek wurde basierend auf Illumina-Technologien und unter Befolgung der Herstellerempfehlungen erstellt. Die DNA-Fragmente wurden endpoliert, mit einem A-Schwanz versehen und mit den Volllängenadaptern der Illumina-Sequenzierung ligiert, gefolgt von einer weiteren PCR-Amplifikation mit P5- und indizierten P7-Oligos. Die PCR-Produkte als Endkonstruktion der Bibliotheken wurden mit dem AMPure XP-System gereinigt. Anschließend wurden die Bibliotheken mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, CA, USA) auf Größenverteilung überprüft und durch Echtzeit-PCR quantifiziert (um die Kriterien von 3 nM zu erfüllen). Die qualifizierten Bibliotheken werden in Illumina-Sequenzer (NovaSeq-System) eingespeist.

Zur Qualitätskontrolle der Rohdaten haben wir im ersten Schritt alle Illumina-Primer-/Adapter-/Linkersequenzen entfernt. Anschließend verwendeten wir BWA Version 0.7.4, um alle Reads auf das Mausgenom auszurichten (Version: GRCm39), gefolgt von der Entfernung von Reads mit >90 % Abdeckung und 95 % Identität. Anschließend führten wir paarweise Vergleiche von Paired-End-Reads durch, um potenzielle PCR-Duplikate zu eliminieren, wobei wir das Kriterium von 25 bp verwendeten, die nacheinander von beiden Enden der Vorwärts- und Rückwärts-Reads übereinstimmten. Schließlich haben wir bei jedem Lesevorgang alle Terminalregionen mit geringer Qualität gekürzt, die als aufeinanderfolgende Basen mit einem Phred-Qualitätswert von <2070 definiert sind.

Die taxonomische Annotation der qualitativ hochwertigen Lesevorgänge wurde von mOTUs2 mit Standardeinstellungen durchgeführt, wodurch taxonomische relative Häufigkeiten generiert wurden30. Zur weiteren Analyse wurden Bakteriengemeinschaftsprofile auf Familien-, Gattungs- und Artenebene zur weiteren Analyse erstellt. Die funktionale Anmerkung nach der Qualitätskontrolle wurde von HUMAnN341 erstellt. Die quantifizierten Pfad- und Genfamilienhäufigkeiten in RPK-Einheiten (Read per Kilobase) wurden dann auf Kopien pro Million (CPM)-Einheiten normalisiert. Anschließend wurden die Genfamilien zur weiteren Analyse in die EC-Domäne umgruppiert.

Alle Analysen wurden mit R Statistical Software (v4.1.1; R Core Team 2021) durchgeführt.

Die Prävalenzfilterung wurde durchgeführt, um Merkmale mit geringer Prävalenz (Prävalenz < 10 %) vor der Analyse der unterschiedlichen Häufigkeit und der Diversität zu entfernen.

Klinische Daten wurden durch ein verallgemeinertes lineares Modell analysiert, angepasst an den Erntetag und das Körpergewicht der Mäuse (klinische Daten ~ Gruppe + Erntetag + Körpergewicht). Taxonomische und funktionelle Daten wurden vor der Analyse auf den Ausgangswert normalisiert (log2-fache Änderung [log2FC] der Nachbeobachtung im Vergleich zum Ausgangswert) und mit einem linearen Modell analysiert, angepasst an den Erntetag des Kots der Mäuse (log2FC-Häufigkeit ~ Gruppe + Ernte). Tag). Metagenomikdaten wurden vor der Korrelationsanalyse mithilfe des R-Paket-Mikrobioms mittels Centered Log Ratio (CLR) transformiert71. Spearmans Korrelationen zwischen Daten wurden mit der Funktion rcorr aus dem R-Paket Hmisc72 analysiert. Ein P-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die False-Discovery-Rate (FDR) wurde berechnet, um die P-Werte für das Testen mehrerer Hypothesen mithilfe des Benjamini-Hochberg-Verfahrens anzupassen.

Die Alpha-Diversität (Shannon-, Simpson- und Chao1-Indizes) wurde mit dem R-Paket vegan73 berechnet. Das lineare gemischte Modell wurde angewendet, um die Alpha-Diversität zwischen Gruppen zu vergleichen. Bray-Curtis-Abstände wurden mithilfe des R-Pakets vegan berechnet, um die Unterschiede in der Gemeinschaft abzuschätzen. Schließlich wurde eine permutationelle multivariate Varianzanalyse unter Verwendung der Funktion Adonis aus dem R-Paket vegan durchgeführt, um die Beta-Diversität zwischen Gruppen zu analysieren. Ein P-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Rohe metagenomische Sequenzierungsdaten für alle Proben dieser Studie wurden im European Nucleotide Archive unter der Zugangs-ID PRJEB57214 hinterlegt. Weitere Informationen und Anfragen zu Ressourcen und Reagenzien richten Sie bitte an den Hausarzt ([email protected]).

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Diese Arbeit wurde unterstützt vom Interdisziplinären Zentrum für Klinische Forschung Jena (ID: AMSP-05); Marie Sklodowska-Curie Actions (MSCA) und Innovative Training Networks, H2020-MSCA-ITN-2018 813781 „BestTreat“; und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Deutschen Exzellenzstrategie, EXC 2051, Projekt-ID 390713860. Die Autoren danken Dr. Jessica Hoff und Dr. Wanling Foo für ihre Unterstützung bei der Tierbewertung und -ernte.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Howell Leung, Ling Xiong.

Mikrobiomdynamik, Leibniz-Institut für Naturstoff-Forschung und Infektionsbiologie – Hans-Knöll-Institut, Jena, Deutschland

Howell Leung, Yueqiong Ni & Gianni Panagiotou

Universitätsklinikum Jena, Klinik für Anästhesiologie und Intensivmedizin, Jena, Deutschland

Ling Xiong, Anne Busch, Michael Bauer und Adrian T. Press

Friedrich-Schiller-Universität, Theoretische Mikrobielle Ökologie, Institut für Mikrobiologie, Fakultät für Biowissenschaften, Jena, Deutschland

Anne Busch

Friedrich-Schiller-Universität, Medizinische Fakultät, Jena, Deutschland

Adrian T. Press

Friedrich-Schiller-Universität Jena, Institut für Mikrobiologie, Fakultät für Biowissenschaften, Jena, Deutschland

Gianni Panagiotou

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GP und ATP haben die Studie entworfen. LX und ATP führten Tierversuche und Probenentnahmen durch und verarbeiteten Blut- und Stuhlproben aus den Materialien. ATP und MB betreuten den Tierversuch. HL führte die Metagenomikanalyse durch. GP und YN überwachten die Metagenomanalyse. GP und YN betreuten das Manuskript. HL und GP haben das Manuskript geschrieben. HL und LX haben gleichermaßen zu diesem Artikel beigetragen. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen, überprüft und genehmigt.

Korrespondenz mit Adrian T. Press oder Gianni Panagiotou.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Leung, H., Xiong, L., Ni, Y. et al. Ein beeinträchtigter Fluss von Gallensäuren von der Leber in den Darm zeigt Mikrobiom-Immun-Wechselwirkungen, die mit Leberschäden verbunden sind. npj Biofilms Microbiomes 9, 35 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00398-0

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Eingegangen: 29. November 2022

Angenommen: 18. Mai 2023

Veröffentlicht: 07. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00398-0

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