Aus einem Genom - Foshan Mining Labs Group Co., Ltd

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 277 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Erweiterung des Arsenals an prophylaktischen Ansätzen gegen SARS-CoV-2 ist von größter Bedeutung, insbesondere derjenigen Strategien, die gegen Antigendrift bei Spike resistent sind. Hier haben wir ein Screening von über 16.000 RNAi-Auslösern gegen das SARS-CoV-2-Genom durchgeführt und dabei einen massiv parallelen Assay verwendet, um hyperpotente siRNAs zu identifizieren. Wir haben zehn Kandidaten für die In-vitro-Validierung ausgewählt und fünf siRNAs gefunden, die in Experimenten mit Lebendviren eine hyperpotente Aktivität (IC50 < 20 pM) und eine starke Blockade der Infektiosität zeigten. Wir haben diese Aktivität durch kombinatorische Paarung der siRNA-Kandidaten weiter verstärkt und Cocktails identifiziert, die gegen mehrere Arten besorgniserregender Varianten (VOC) aktiv waren. Anschließend untersuchten wir mithilfe der Sättigungsmutagenese über 2.000 mögliche Mutationen in den siRNA-Zielstellen und bestätigten einen breiten Schutz des führenden Cocktails vor zukünftigen Varianten. Schließlich haben wir gezeigt, dass die intranasale Verabreichung dieses siRNA-Cocktails die klinischen Anzeichen und viralen Krankheitssymptome im Goldstandard-Modell des Syrischen Hamsters wirksam abschwächt. Unsere Ergebnisse ebnen den Weg für die Entwicklung einer zusätzlichen Schicht antiviraler Prophylaxe, die orthogonal zu Impfstoffen und monoklonalen Antikörpern ist.

Covid-19 war eine der weltweit schlimmsten Pandemien der Neuzeit. Während Impfstoffe ein großer Erfolg sind, besteht dringender Bedarf, das Arsenal an Präventivmaßnahmen zu erweitern, um einige ihrer Mängel zu beheben1. Erstens zielen praktisch alle zugelassenen Impfstoffe auf das Spike-Protein2,3 ab und weisen angesichts der Exposition gegenüber Escape-Mutanten und neu auftretenden virulenten Varianten4,5,6,7,8 einen Single Point of Failure auf. Da außerdem alle Behandlungen mit monoklonalen Antikörpern (mAb) auf dasselbe Protein abzielen, beeinträchtigen solche Antigenverschiebungen nicht nur den Schutz von Impfstoffen, sondern können auch die Wirksamkeit einer Vielzahl anderer Behandlungsarten verringern. Zweitens haben mehrere Studien gezeigt, dass der Schutz von Impfstoffen, auch vor schweren Erkrankungen, typischerweise innerhalb weniger Monate nach der zweiten9, dritten10,11 oder vierten Dosis12 nachlässt. Drittens deuten aktuelle Erkenntnisse aus Mäusen und nichtmenschlichen Primaten (NHPs) darauf hin, dass aktualisierte Versionen von Impfstoffen eine verminderte Wirksamkeit aufweisen und möglicherweise der ursprünglichen antigenen Sünde unterliegen13,14, wenn die erste Exposition gegenüber einem Virus das Ergebnis nachfolgender Expositionen beeinflusst gegenüber antigenisch verwandten Stämmen. Diese Daten deuten auf den begrenzten Nutzen von Impfstoffaktualisierungen für neu auftretende besorgniserregende Varianten (VoCs) hin. Viertens reichten antivirale Medikamente wie Paxlovid nicht aus, um Erwachsene vor einer COVID-19-Exposition zu schützen. Schließlich zeigen mehrere Studien immer wieder, dass es schwierig ist, bei immungeschwächten Personen einen hohen Schutz zu erreichen, selbst nach wiederholter Gabe15, was bedeutet, dass die Personen, die einen Impfstoff am dringendsten benötigen, am wenigsten davon profitieren werden. Schließlich können Infektionen bei immungeschwächten Personen eine längere Dauer haben16,17, was das Risiko einer Hyperevolution und der Entstehung von VoCs erhöht und somit große Risiken für die öffentliche Gesundheit mit sich bringt.

Aufgrund des Erfolgs mehrerer früherer Studien, in denen Small Interfering RNAs (siRNAs) wirksam als antivirale Mittel eingesetzt wurden18, 19, 20, 21, gingen wir davon aus, dass intranasal (in) verabreichte siRNAs besonders gut als Maßnahme zur Impfstoffverstärkung bei Infektionen geeignet sein würden in die oberen Atemwege, wo sie zur Eindämmung der Übertragung eingesetzt werden können.

Zu diesem Zweck haben wir über 16.000 RNA-Interferenz-Trigger (RNAi) untersucht, die auf das SARS-CoV-2-Genom abzielen, um hyperpotente Kandidaten zu identifizieren. Das Screening stützte sich auf einen massiv parallelen Assay, Sens.AI, der ein System der synthetischen Biologie nutzt, um die Stummschaltungsaktivität jedes siRNA-Kandidaten gegen das Virus zu rekapitulieren. In unseren früheren Studien22,23 verwendeten wir eine frühere Version von Sens.AI, um hyperpotente siRNAs gegen HIV und HCV zu identifizieren. Der vorherige Entwurf war jedoch ineffizient und die Durchführung dauerte über sechs Monate. Im neuen Design haben wir eine schnellere Methode erfunden, die das Signal-Rausch-Verhältnis durch statistisches Lernen anstelle mühsamer experimenteller Schritte verbessert. Umfangreiche Computeranalysen und In-vitro-Experimente ergaben einen Cocktail aus zwei hyperpotenten siRNA-Kandidaten, die sich als wirksam gegen alle getesteten Virusstämme erwiesen. Endlich. Die intranasale Verabreichung dieses siRNA-Cocktails erwies sich im Syrischen Hamstermodell von SARS-CoV-2 als wirksam.

Wir haben das SARS-CoV-2-Genom in eine Reihe potenzieller Ziele für kurze Haarnadel-RNA (shRNA) zerlegt (ergänzende Abbildung 1). Dieser Prozess wurde durchgeführt, indem das Genom mit überlappenden 50 Nukleotid langen Sequenzen kachelt wurde, die jeweils um ein einzelnes Nukleotid gegeneinander verschoben waren. Die Zielregion jeder shRNA umfasste einen Abschnitt von 22 Nukleotiden, der in der Mitte der 50-Nukleotid-Sequenz positioniert war, und der Rest der flankierenden Sequenz diente der Erhaltung des genomischen Kontexts. Anschließend haben wir mehrere In-silico-Filter angewendet, um Zielregionen mit geringer Synthesetreue auszuschließen, solche, die eine minimale Konservierungsschwelle bei Virusstämmen nicht überschreiten, solche, die Sequenzattribute enthalten, die typischerweise mit einer schlechten shRNA-Reaktion einhergehen, und solche, die Samenregionen besitzen, die dies möglicherweise können stimmen mit einem menschlichen Transkript überein (Ergänzungstabelle 1). Insgesamt wurden bei diesem Prozess 16.471 shRNA-Kandidaten ermittelt, die auf das SARS-CoV-2-Genom und seinen subgenomischen RNA1-Negativstrang abzielen. Schließlich wurde diese Bibliothek durch einen Satz von 1.118 Positiv- und Negativkontroll-shRNAs ergänzt, über die in früheren Screenings gegen krebsbezogene Gene im Mausgenom berichtet wurde22.

Wir haben diese 17.589 shRNAs und ihre entsprechenden 50-Nukleotid-Zielregionen mithilfe eines DNA-Oligo-Pools (Twist Bioscience) synthetisiert. Jedes dieser Oligos war 185 Nukleotide lang und bestand aus zwei PCR-Annealing-Stellen, der miR-30-basierten shRNA, einem Leitfaden und seinem Passagierstrang gemäß unserem Design, einem Spacer mit Klonierungsstellen und einer 50-Nukleotid-Region, die die Zielstelle rekapitulierte mit seinem genomischen Kontext (Abb. 1a). Wir verwendeten eine Reihe von Klonierungsschritten, um ein Venus-Reportergen in die Spacer-Region einzuführen, sodass die 3'UTR von Venus die 50-Nukleotid-Zielregion umfasste, und fügten dieses gesamte Konstrukt in unsere Retro-Vektorbibliothek ein (Abb. 1b).

ein Oligo-Design. Jedes Oligo hatte einen einzigartigen RNAi-Trigger im Kontext eines miR-30-Rückgrats zusammen mit einem 50-Nukleotid-Abschnitt, der die virale RNAi-Zielstelle flankierte; b Bibliotheksdesign. Jedes Plasmid enthielt einen spezifischen RNAi-Trigger und seine passende Zielstelle in cis als Teil der 3'UTR eines Venus-Reporters; c–e Schema eines In-vitro-Screenings in menschlichen Zellen: c Die RNAi-Maschinerie wurde zunächst ausgeschaltet. Dicer-/- 293FT-Zellen wurden mit der Plasmidbibliothek infiziert und nach Venushigh-Expression sortiert, was die T0-Auslesung ergab; d Die RNAi-Maschinerie wurde dann eingeschaltet. Wir haben die RNAi-Maschinerie durch ektopische Expression eines destabilisierten Dicer (ddDicer) wiederhergestellt; e Die Aktivität der RNAi-Maschinerie wurde quantitativ moduliert. Zwei biologische Replikate wurden sieben verschiedenen Bedingungen ausgesetzt, um die Dicer-Expression entweder durch Behandlung mit einer Anti-Dicer-siRNA nach unten oder durch Behandlung mit Shield-1 nach oben zu titrieren. Bei der FACS-Sortierung wurden Venuslow- und Venusdark-Zellen gesammelt und ihre Oligokonstruktregionen sequenziert; f Die resultierende Datenmatrix des Bildschirms. Jede Zeile stellt eine spezifische Kombination aus einer Behandlungsbedingung (die Spalte ganz links) und einem FACS-Gate dar (bezeichnet als D für Dunkel und L für Niedrig). Diese Zeilenvektoren beschreiben die Anreicherung jedes getesteten RNAi-Triggers (blau) im Vergleich zu negativen (grün hervorgehoben) und positiven (rot hervorgehoben) Kontrollen. Die Spalte „Fläche unter der Kurve“ (AUC) wurde basierend auf der Fähigkeit berechnet, die positiven von den negativen Kontrollen zu unterscheiden; g Auswahl der beiden besten Konditionen. Die zweireihigen Vektoren mit der höchsten AUC wurden ausgewählt. Dargestellt sind die für die intrinsischen Steuerungen berechneten Precision-Recall-Kurven (links) und Receiver-Betriebseigenschaften (rechts). Der Screen-Score jedes RNAi-Triggers wurde als Durchschnitt dieser zweizeiligen Vektoren berechnet.

Unser Screening-Verfahren bestand aus zwei Schritten, um den Effekt von Positionsschwankungen zu reduzieren, die durch Retro-Vektor-Integration entstehen können. Wir führten das Screening zunächst in einer menschlichen Dicernull/Null-293FT-Zelllinie durch, die über CAS9/CRISPR-Knockout konstruiert wurde (Abb. 1c; ergänzende Abb. 2a, b). Das Fehlen von Dicer verhinderte die Reifung von shRNAs und entkoppelte effektiv die Expression von Venus und die Wirksamkeit jeder kodierten shRNA. Insgesamt haben wir 1,2 Millionen Dicernull/null 293FT-Zellen mit Retrovektoren transduziert, die unsere Bibliothek bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,8 kodierten. Drei Tage nach der Infektion haben wir vier Millionen Venushigh Dicernull/null 293FT-Zellen aus insgesamt 50 Millionen Zellen FACS-sortiert. Diese Zellen stellen Beispiele einer erfolgreichen Konstruktintegration in genomische Loci dar, die sich in einer angemessenen Venus-Expression widerspiegelte. Anschließend stellten wir die Expression von Dicer wieder her, indem wir ein synthetisches Konstrukt und eine modulierte DICER-Expression verwendeten, um eine Kopplung zwischen dem optischen Signal und der Wirksamkeit jeder shRNA herzustellen (Abb. 1d). Das synthetische Konstrukt war eine Fusion zwischen menschlichem Dicer und einer destabilisierenden Domäne (ddDicer), die auf einem mutierten menschlichen FKBP12-Protein basierte, was es uns ermöglichte, die Aktivität von Dicer mithilfe von Shield-124 zu erhöhen. Darüber hinaus haben wir eine siRNA gegen Dicer eingesetzt, um den gegenteiligen Effekt hervorzurufen und dessen Expression zu reduzieren. Die Grundidee hinter diesen verschiedenen Erkrankungen bestand darin, ein Behandlungsschema zu identifizieren, bei dem die RNAi-Maschinerie es hyperpotenten shRNAs ermöglicht, ihre Ziele zu hemmen, aber zu schwach ist, um die Aktivität weniger wirksamer shRNAs zu unterstützen.

Insgesamt haben wir die Bibliothek anhand von acht verschiedenen Bedingungen der ddDicer-Expression gescreent (Abb. 1e). Die erste Bedingung, die wir als T0 zugewiesen haben, enthielt kein ddDicer und spiegelte die nicht manipulierte relative Häufigkeit der verschiedenen shRNAs wider. Die anderen Bedingungen enthielten erhöhte Dosen von entweder Shield-1 (um die ddDicer-Aktivierung zu induzieren) oder einer Anti-Dicer-siRNA (um Dicer zu hemmen). Wir haben jede dieser sieben Bedingungen auf zwei biologische Replikate angewendet. Anschließend haben wir die Zellen in jeder Replikation anhand ihrer Venus-Expression in drei Klassen sortiert: hoch, niedrig und dunkel. Anschließend haben wir die niedrigen und dunklen Klassen sequenziert, um die Ebene und Identität der shRNAs zu entschlüsseln. Wir haben auch unsortierte T0-shRNAs sequenziert, um die Verteilung der shRNAs in der ursprünglichen Bibliothek darzustellen. Insgesamt haben wir (2[Replikate] × 2[Sortierbehälter] × 4[Dicer-Expressionsniveaus] + 1[T0] =) 17 Sequenzierungsbibliotheken (Illumina MiSeq) erhalten, die jeweils aus 150 bp Paired-End-Reads bestehen. Insgesamt haben wir für jede Bibliothek durchschnittlich 36 Millionen Lesevorgänge erzielt. Wir haben die 50-Basenpaar-Region, die dem Ziel aus diesen Bibliotheken entsprach, analysiert, sie mit ihrer shRNA versehen und die Anzahl der eindeutigen Auftritte jeder shRNA in jeder Bedingung gezählt. Schließlich verwendeten wir DESeq225, um die Anreicherung der shRNA in jeder Bedingung im Vergleich zu T0 zu messen, und bildeten den Durchschnitt der beiden biologischen Replikate. Dieser Prozess ergab eine 8 x 17.589-Matrix (Abb. 1f), in der jede Spalte eine shRNA darstellte, für die jede Zeile eine der Behandlungen darstellte (siRNA oder Shield-1, jeweils für einen von zwei Sortierfächern, niedrig und dunkel). ) und die Anreicherungsstatistik (die Spalte ganz rechts) wurde dann durch die Fläche unter der Kurve (AUC) dargestellt, wie von DESeq2 berechnet.

Als nächstes verwendeten wir unsere internen Kontrollen, um die optimalen Parameter zu identifizieren, die hyperpotente shRNAs vom Rest der Bibliothek trennen (Abb. 1f, g). Wir haben die AUC zur Unterscheidung der schwach wirksamen Kontrollen von den hyperpotenten Kontrollen mithilfe der DESeq2-Anreicherungsstatistik berechnet. Im Allgemeinen zeigte dieser Prozess, dass die niedrigen Venus-Bins die dunklen Bins bei der Unterscheidung zwischen hyperpotenten und armen Kontrollen deutlich übertrafen. Darüber hinaus schnitten die Shield1-haltigen Bedingungen besser ab als die Shield-Null-Bedingungen, wobei die Konzentrationen von 10 pM und 100 pM am besten abschnitten. Aus diesem Grund haben wir beschlossen, uns auf diese beiden Bedingungen zu konzentrieren, wobei das niedrige Venus-Tor die optimalen Bedingungen darstellt, um zwischen neuartigen hyperpotenten shRNAs und solchen mit schlechter Leistung zu unterscheiden. Nach Konzentration auf RNAi-Trigger mit hoher Sequenzierungsabdeckung ergaben diese beiden Bedingungen AUC-Werte von nahezu 80 % für die internen Kontrollen. Noch wichtiger ist, dass diese beiden Bedingungen einen perfekten positiven Vorhersagewert (PPV) für die internen Kontrollen aufwiesen, wenn der Rückruf auf die oberen 5 % der Liste beschränkt wurde.

Nachdem wir die optimalen Parameter identifiziert hatten, ordneten wir die möglichen SARS-CoV-2-shRNAs anhand eines Prozesses ein, der dem für die internen Kontrollen ähnelt. Für jede shRNA verwendeten wir die DESeq2-Statistik jeder der Bedingungen unter denselben Einschränkungen der Sequenzierungsabdeckung. Das Endergebnis war eine nach Rang geordnete Liste von shRNAs über alle getesteten Bedingungen hinweg, wobei die wirksamste shRNA ganz oben und die am wenigsten wirksame ganz unten stand.

Als nächstes haben wir das Ranking unseres Bildschirms mit mehreren Methoden validiert. Zunächst analysierten wir die Korrelation zwischen den SARS-CoV-2-shRNA-Statistiktests unter den beiden leistungsstärksten Bedingungen. Diese Analyse ergab, dass die Pearson-Korrelation zwischen den gemeldeten Statistiken der beiden Erkrankungen 72,2 % (p < 10−9) betrug, was darauf hindeutet, dass die Screening-Ergebnisse eine signifikante interne Konsistenz aufwiesen (Abb. 2a). Als nächstes konzentrierten wir uns auf die Sequenzmerkmale unserer shRNAs. Frühere Studien berichteten, dass hochwirksame shRNAs typischerweise mit dem Fehlen von Adenin an der 20. Position des Leitfadens verbunden waren22. Daher haben wir die Häufigkeit von Adenin als Funktion des gemittelten Screen-Scores aus den beiden Bedingungen bewertet. Diese Analyse ergab eine signifikante Korrelation (Pearson = 90,4 %, p < 10–20) zwischen der Häufigkeit von SARS-CoV-2-shRNAs ohne Adenin an ihrer 20. Position und der durchschnittlichen Screen-Statistik (Abb. 2b). Tatsächlich wiesen die obersten shRNAs in unserem Screening an Position 20 praktisch alle Adenin auf. Schließlich verglichen wir die Ergebnisse unseres Screenings mit In-silico-shRNA-Potenzvorhersagen, die von einem veröffentlichten Algorithmus für maschinelles Lernen erstellt wurden26 (Abb. 2c). Obwohl die Vorhersage dieser Algorithmen für jeden einzelnen RNAi-Trigger alles andere als perfekt war, fanden wir eine hochsignifikante Korrelation (Pearson = 90,6 %, p < 10–20) zwischen den Ergebnissen dieses Algorithmus und unserem durchschnittlichen Bildschirmergebnis.

a Die Screen-Scores wiesen eine hohe interne Konsistenz auf. Die Screening-Ergebnisse zeigten eine Pearson-Korrelation von 72,2 % zwischen den Ergebnissen unter den beiden leistungsstärksten Bedingungen; b Anreicherung von Merkmalen, die mit potenten shRNAs verbunden sind. Die Wahrscheinlichkeit, kein Adenin in Position 20 von RNAi-Triggern zu finden, die auf SARS-CoV-2 abzielen, stieg mit den Screening-Ergebnissen, was frühere Studien zusammenfasst, die darauf hinweisen, dass Adenin, wenn es Position 20 einnimmt, die shRNA-Reifung schwächt; c Screen-Scores korrelierten stark mit bioinformatischen Vorhersagen. Die Screen-Scores, die die von DESeq2 berechneten Anreicherungsstatistiken darstellen, korrelierten stark mit einem veröffentlichten Algorithmus für maschinelles Lernen, der die Wirksamkeit von shRNAs vorhersagte; d Screen-Ergebnisse und die ausgewählten Kandidaten. Die Grafik zeigt die resultierenden Screen-Scores jedes RNAi-Triggers, der die Qualitätsschwelle überschritten hat, als Funktion der Position entlang des viralen Genoms. Orange: RNAi-Trigger, die auf konservierte Regionen zwischen SARS-CoV und SARS-COV-2 abzielen. Grün: Die ausgewählten zehn Kandidaten. Blau: alle anderen RNAi-Rigger; e Dosis-Wirkungs-Kurven der ausgewählten zehn Kandidaten. siRNAs wurden mit einem Reporter-Assay getestet. Das Diagramm stellt das standardisierte mittlere Verhältnis zwischen der Expression von mCherry (Reportergen) und GFP (Kontrollgen) dar; f Potenzwerte für jeden der 10 ausgewählten Kandidaten. Der IC50-Wert jedes der 10 Kandidaten wurde auf Grundlage der Dosis-Wirkungs-Kurven in (e) berechnet. Standardfehler für IC50-Berechnungen wurden mithilfe eines statistischen Bootstrap über alle Datenpunkte auf jedem Konzentrationsniveau berechnet.

Ermutigt durch diese Ergebnisse wählten wir manuell zehn Kandidaten für weitere Experimente aus (Tabelle 1; Abb. 2d). Die ersten fünf Kandidaten (S1-S3 und S5-S6) wurden hauptsächlich auf der Grundlage ihrer durchschnittlichen Screen-Bewertung unter den beiden leistungsstärksten Bedingungen ausgewählt, wobei sie sich bemühten, mehrere Virusgene darzustellen. Die anderen fünf Kandidaten (S4 und S7-S10) wurden ebenfalls auf der Grundlage ihrer Screen-Scores ausgewählt, waren jedoch auf 22mer-Regionen beschränkt, die zwischen SARS-CoV und SARS-CoV-2 vollständig konserviert waren, da wir die Hypothese aufstellten, dass diese Regionen auf die Zukunft anwendbar sein könnten Auch Spillover-Effekte von Beta-Coronaviren. Um unsere ausgewählten shRNAs zu testen, haben wir ihre Zielregion in die 3'UTR von mCherry geklont und jede shRNA in die entsprechende siRNA umgewandelt. Anschließend transfizierten wir jeden Reporter mit verringerten Dosen seiner entsprechenden siRNA, um seine halbmaximale Hemmkonzentration (IC50) zu identifizieren. Acht der zehn getesteten siRNAs zeigten IC50-Werte unter 50 pM (Abb. 2e, f; Ergänzungstabelle 2), fünf davon zeigten IC50-Werte unter 20 pM. Nur ein Kandidat, S9, zeigte in diesem Test einen relativ schlechten IC50-Wert (IC50 > 1,4 uM). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass unsere neuartige genomweite Screening-Methode hyperpotente siRNAs innerhalb eines einzigen Zyklus identifiziert.

Parallel zum Sens.AI-Screening verwendeten wir eine traditionellere Entdeckungspipeline, um siRNAs gegen SARS-CoV-2 zu identifizieren. Unsere Motivation bestand darin, die Leistungsstatistiken, technischen Eigenschaften und logistischen Eigenschaften unserer neuartigen Sense.AI-Pipeline im Vergleich zu modernsten siRNA-Vorhersagealgorithmen zu bewerten. Zu diesem Zweck verwendeten wir drei Open-Source-Algorithmen zur Vorhersage der siRNA-Potenz: RNAxs27, DSIR28, OligoWalk29, um über 815 potenzielle Zielorte rechnerisch zu bewerten, wobei wir uns auf Regionen konzentrierten, die zuvor gute Ergebnisse gegen SARS-CoV zeigten30,31,32. Es gab eine relativ geringe Korrelation zwischen den Algorithmen mit Spearman-Korrelationen zwischen 0,4 und 0,02 (ergänzende Abbildung 3). Als nächstes wählten wir manuell siRNA-Kandidaten aus, die in allen Programmen durchweg besser waren, wobei wir Kandidaten mit zum menschlichen Transkriptom komplementären Samenregionen ausschlossen. Diese Liste ergab 88 siRNAs, die wir mit demselben oben beschriebenen Reporter-Assay (bei 1 nM pro Kandidat) synthetisiert und getestet haben. Anschließend haben wir die vielversprechendsten 27 siRNAs priorisiert und sie bei Konzentrationen von 500 pM und 100 pM erneut getestet (ergänzende Abbildung 4). Dabei haben wir festgestellt, dass 9 dieser 27 Kandidaten die Reporterexpression um mehr als 50 % (100 pM) hemmten.

Als nächstes bewerteten wir unsere Top-Kandidaten anhand des Sensorbildschirms und der Bioinformatik-Pipeline mithilfe eines Goldstandard-Lebend-SARS-CoV-2-In-vitro-Infektionstests. Wir haben Vero E6-Zellen mit 100 nM jedes der Sens.AI-siRNA-Kandidaten in dreifacher Ausfertigung transfiziert. Als Negativkontrolle transfizierten wir Zellen auch mit einer Schein-siRNA, die auf eGFP abzielte. Nach 24 Stunden haben wir die Zellen mit 60xTCID50, 600xTCID50 oder 6000xTCID50 des lebenden SARS-CoV-2 (Vorfahrenstamm) herausgefordert. Schließlich haben wir die Viruslast 48 Stunden nach der Erstinfektion mittels qPCR gemessen und dabei die RdRP- und E-Gene untersucht.

Wir fanden heraus, dass sechs der neun getesteten siRNAs aus unserem Screening die Menge an viraler RNA drastisch senken konnten. Während die Ergebnisse bei allen drei getesteten Virustitern qualitativ konsistent waren (Abb. 3 und ergänzende Abb. 5a, b), haben wir uns entschieden, uns für zukünftige Experimente auf den 600xTCID50-Titer zu konzentrieren, da dieser den größten dynamischen Bereich ergab (Abb. 3a). Unter diesen Bedingungen reduzierten unsere fünf siRNAs mit der besten Leistung die genomische Viruslast um >95 %. Interessanterweise zeigten sowohl S8 als auch S10 trotz sehr hoher Wirksamkeit im Reporter-Assay (IC50 < 20 pM) schwache Reaktionen mit einer SARS-CoV-2-Hemmung von etwa 10 % im Vergleich zur Kontroll-siRNA. Im Gegensatz zu den anderen siRNA-Kandidaten zielen diese beiden jedoch auf den Negativstrang des Virus ab, der als Vermittler im Replikationsprozess fungiert. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass das Targeting dieses intermediären RNA-Moleküls die Virusreplikation wahrscheinlich nicht beeinträchtigen würde. Um unsere Spitzenkandidaten weiter zu bestätigen, haben wir die Auswirkung auf die Infektiosität lebender Viren in Zellen mithilfe des TCID50-Assays bewertet (Abb. 3b). Auch hier fanden wir eine starke inhibitorische Aktivität der drei besten der vier siRNAs, wobei die Virusrepression im Vergleich zur GFP-siRNA-Kontrolle etwa zwei Größenordnungen betrug. Als nächstes verwendeten wir dieselben Einstellungen, um fünf der wirksamsten siRNAs aus der Open-Source-Erkennungsmethode zu testen (Ergänzungstabelle 3). Nur ein Kandidat, Hel14, zeigte eine Unterdrückung der Viruslast um >95 %, was den Werten der Top-siRNAs aus unserem Sens.AI-Screening entsprach (~90 % Hemmung) (Abb. 3c).

Blau und Orange: qPCR-Ergebnisse der E- bzw. RdRP-Transkripte. Sofern nicht anders angegeben, wurde die 100-prozentige Viruslast auf das Virusniveau nach Behandlung mit einer Anti-GFP-siRNA kalibriert. eine Viruslast von SARS-CoV-2 (Vorfahrenstamm) nach Behandlung mit den besten siRNA-Kandidaten aus dem Sens.AI-Screening; b TCID50-Spiegel von SARS-CoV-2 (Vorfahrenstamm) nach Behandlung mit vier der besten siRNA-Moleküle. In jeder Versuchsreihe wurde eine siRNA gegen eGFP als Negativkontrolle verwendet (linkes Feld n = 3, rechtes Feld n = 1, Fehlerbalken = SEM, Signifikanz wurde mithilfe des t-Tests berechnet); c Viruslast von SARS-CoV-2 (Vorfahrenstamm) nach Behandlung mit der Top-siRNA aus der Bioinformatik-Pipeline; d Die Wirkung verschiedener siRNA-Cocktails gegen SARS-CoV-2 (Vorfahrenstamm). Die Ergebnisse wurden auf die Unterdrückung von S3 bei derselben Konzentration kalibriert; e Viruslast von SARS-CoV-2 (Vorfahrenstamm) nach Behandlung mit siRNA-Cocktails in ALI-Kultur. Die Viruslast wurde in Medien gemessen, die 48, 72 und 96 Stunden nach der Infektion aus den Medien entnommen wurden (n = 2 unabhängige Proben, Fehlerbalken = SEM). f Nachbehandlung der Viruslast mit siRNA-Cocktails gegen SARS-CoV-2 Delta im Vergleich zum Stammstamm (n = 3 unabhängige Proben, Fehlerbalken = SEM). g Viruslast von SARS-CoV-2 Omicron im Vergleich zum Stammstamm nach Behandlung mit dem S5/Hel14-Cocktail und anderen Arten antiviraler Medikamente; (h) DeSEQ2-Analyse der SARS-CoV-2-Replikonbehandlung mit dem S3/S5-siRNA-Cocktail. Wir beobachteten einen starken Rückgang der Abdeckung um die Spaltstellen S3 (~23,5 kBase) und S5 (~28 kBase) entlang der Replikonsequenz (FDR-Werte 4 × 10−83 bzw. 6 × 10−22). Fehlerbalken in den Feldern ef stellen die Standardabweichung dar, basierend auf drei Replikaten.

Als nächstes suchten wir aus unseren leistungsstärksten Kandidaten nach der optimalen Kombination von siRNA-Paaren. Zu diesen Cocktails gehörten vier siRNAs aus dem Sens.AI-Screening, ergänzt durch drei der vielversprechendsten siRNAs aus der Open-Source-Entdeckungspipeline. Wir haben 14 verschiedene 2-siRNA-Cocktails im Lebendvirus-Assay getestet und die Ergebnisse mit der Repression durch S3 allein verglichen, da es als Monotherapie den höchsten Repressionsgrad gezeigt hatte (Abb. 3d). Wir haben fünf Cocktails identifiziert, bei denen die beiden siRNA-Komponenten einen synergistischen Effekt zeigten, der im Vergleich zur Repression durch S3 allein bei derselben Konzentration um ein Vielfaches multipliziert wurde. Es stellte sich heraus, dass S5 in den meisten dieser Cocktails eine wiederkehrende Komponente war und wir beschlossen, in Zukunft zwei dieser Cocktails zu priorisieren: S5/S3 und S5/Hel14.

Um diese siRNA-Cocktails weiter zu validieren, haben wir ihre Aktivität in einer Luft-Flüssigkeits-Schnittstellenkultur getestet, die im Vergleich zu den VeroE6-Zellen die Atemwege besser nachahmt. Wir haben die ALI-Kultur von der apikalen Seite mit 100 nM jedes Cocktails transfiziert. Als Negativkontrolle transfizierten wir Zellen auch mit einer Schein-siRNA, die auf eGFP abzielte. Nach 24 Stunden haben wir die Zellen von der apikalen Seite her mit 600xTCID50 des lebenden SARS-CoV-2 (Vorfahrenstamm) herausgefordert. Schließlich haben wir die Viruslast 48, 72 und 96 Stunden nach der Erstinfektion mittels qPCR gemessen und dabei die RdRP- und E-Gene untersucht. Unter diesen Bedingungen fanden wir für beide Cocktails eine starke Hemmung der Virusreplikation (Abb. 3e).

Unsere Cocktails erwiesen sich als äußerst resistent gegenüber neu auftretenden VoCs. Zuerst haben wir die Cocktails gegen die angestammte Sorte und die Delta-Variante getestet. Die Cocktails führten zu einer erheblichen Repression gegen Delta, die ihrer Wirkung auf den angestammten Stamm entsprach (>95 % Repression) (Abb. 3f). Interessanterweise war S5 tolerant und zeigte Wirksamkeit gegen den Delta-Stamm, obwohl dieser eine Mutation an Position 14 seiner Zielstelle aufweist. Zweitens haben wir den S5/Hel14-Cocktail mit einer ähnlichen Einstellung gegen Omicron BA.1 getestet. Ähnlich wie in anderen Berichten33 replizierte sich die Omicron-Variante in vitro nicht so schnell wie andere VoCs. Da diese niedrigeren Replikationsraten den dynamischen Bereich unserer Tests verringerten, fügten wir zwei Positivkontrollen hinzu, Chloroquin und Molnupiravir, die sich beide als wirksame Inhibitoren von Omicron BA.1 erwiesen. Die Aktivität des S5/Hel14-Cocktails war in der Omicron-Variante tatsächlich verringert. Dennoch hemmte es die Virusreplikation in einem ähnlichen Ausmaß wie durch die Positivkontrollbehandlungen (Abb. 3g). Dieser Befund deutete darauf hin, dass die geringere Hemmung wahrscheinlich auf einen geringeren dynamischen Bereich aufgrund der langsamen Virusreplikation zurückzuführen war und nicht auf eine verringerte Wirksamkeit des RNAi-Cocktails selbst. Schließlich testeten wir die Aktivität der Cocktails gegen unser neuartiges Replikonsystem, das die Funktion, aber nicht die Infektiosität des Beta-SARS-CoV-2-Stammes rekapitulierte34. Konsistent unterdrückten die Cocktails das Replikon um das 10- bis 15-fache, was darauf hindeutet, dass sie verschiedenen VoCs ein robustes Hemmprofil verleihen34. Wichtig ist, dass die Analyse von Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten zeigte, dass Zellen, die mit dem S3/S5-Cocktail behandelt wurden, ein spezifisches Profil der Lesedepletion an den siRNA-Spaltstellen aufwiesen (Abb. 3h). Diese Daten liefern mechanistische Belege dafür, dass die beobachtete Verringerung der Viruslast in direktem Zusammenhang mit der siRNA-Stummschaltung steht.

Als nächstes untersuchten wir die Kreuzreaktivität unserer RNAi-Strategie gegen zukünftige VoCs angesichts ihrer beabsichtigten Verwendung im Kontext der Pandemievorsorge. Zu diesem Zweck haben wir mithilfe unserer Sens.AI-Strategie einen Sättigungsmutagenese-Assay entwickelt. Wir wiederholten die gleiche RNAi-off/RNAi-on-Strategie wie beim SARS-CoV-2-Screening. Der einzige Unterschied bestand darin, dass wir im vorherigen Screen eine Vielzahl von shRNA-Triggern und eine perfekt passende Zielstelle verwendeten, während wir in diesem Assay den shRNA-Trigger auf S5 fixierten und eine Reihe mutierter Zielstellen erstellten (Abb. 4a). . Mit dieser Strategie haben wir 2.143 Mutationen in der S5-Zielstelle gescreent und praktisch alle möglichen ein und/oder zwei Substitutionen an dieser Stelle eingehend ausgewertet. Nach unserem besten Wissen ist dies die größte In-Cellulose-Sättigungsmutagenese, die jemals mit einem RNAi-Trigger durchgeführt wurde.

a Das in dieser Einstellung verwendete Designschema der Oligos. Die Bibliothek bestand aus S5 als shRNA-Trigger mit 2.143 Mutationen, die alle möglichen Einzel- und Doppelfehlpaarungen in der siRNA-Zielstelle umfassend darstellten; b Die Auswirkung von Fehlpaarungen stratifiziert nach Position für n = 66 shRNAs mit einer einzelnen Fehlpaarung. Die X-Achse repräsentiert Positionen entlang des Führungsstrangs. Blau: Mittelwerte. Gelb: geglätteter Mittelwerteffekt; Quadrate stellen den Mittelwert dar, horizontale Linien stellen den Median dar, Kastenkanten stellen die 25 %- und 75 %-Quartile dar und die Whisker stellen die am weitesten entfernten Datenpunkte innerhalb von bis zu 50 % des Interquartilbereichs dar. c Die Verteilung der Wirkung von Mutationen auf die Aktivität von S5. Die vertikale Linie bei 1,0 (X-Achse) zeigt Werte an, die mit dem Screen-Score einer Zielstelle ohne jegliche Mutation identisch sind. Schwarz: Wirkungsverteilung aller 2143 Einzel- und Doppelmutationen. Grau: die Verteilung aller Einzelmutationen. Orange: die Verteilung aller Doppelübergänge. Rot: die Verteilung aller Doppeltransversionen.

Wir validierten den Sättigungsmutagenese-Screen, indem wir frühere Trends zu siRNA-Zielfehlpaarungen replizierten. Wir haben die Ergebnisse basierend auf der Anzahl der Nichtübereinstimmungen geschichtet. Im Durchschnitt reduzierte eine einzelne Nichtübereinstimmung am Zielstandort die Sens.AI-Werte um 6 % im Vergleich zu keiner Nichtübereinstimmung. Wie erwartet war dieser Wert deutlich kleiner (t-Test, p < 3 × 10−10) als der für doppelte Fehlpaarungen beobachtete Wert, was die Sens.AI-Werte im Durchschnitt um 31 % reduzierte. Als nächstes analysierten wir die Auswirkung der Position einer einzelnen Fehlpaarung auf die Aktivität von S5 (Abb. 4b). In ähnlicher Weise zeigte die Samenregion im Einklang mit früheren Studien35 die größte Empfindlichkeit gegenüber Fehlpaarungen, wohingegen die Spaltungsstelle eine relativ geringere Empfindlichkeit gegenüber diesen Mutationen aufwies.

Insgesamt zeigte unser Hochdurchsatz-Screening, dass die S5-Zielstelle eine Vielzahl von Mutationen ohne signifikanten Wirksamkeitsverlust tolerieren konnte (Abb. 4c; ergänzende Abb. 6). Die meisten Einzelmutationen (56 %) verbesserten den Sens.AI-Score und es wurde erwartet, dass sie die S5-Potenz erhöhen, was auf die Ago2-Dissoziationsdynamik zurückzuführen sein könnte35. Im Gegensatz dazu schätzten wir, dass S5 im Falle einer Doppelmutation an der Zielstelle den größten Teil seiner Wirksamkeit verlieren würde. Um die Dynamik dieser Doppelmutationen besser zu verstehen, haben wir die geschätzte Wirkung von Doppeltransitionen mit Doppeltransversionen verglichen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass doppelte Übergänge deutlich besser toleriert wurden. Die meisten Doppelübergänge führten zu einer Reduzierung des Sens.AI-Scores um <32 %, wohingegen die meisten Doppeltransversionen zu einer Reduzierung dieses Scores um >51 % führten. Basierend auf früheren Studien kommt der erstere Mutationstyp siebenmal häufiger vor als der letztere36, was darauf hindeutet, dass S5 den häufiger vorkommenden Typ von Doppelmutationen an der Zielstelle bis zu einem gewissen Grad tolerieren könnte.

Um die präventive Wirksamkeit unserer siRNA-Cocktails in einem Krankheitsmodell von COVID-19 zu bewerten, verabreichten wir syrischen Hamstern den S5/Hel14-Cocktail als Präventivmaßnahme gegen eine Lebendvirus-Provokation. Wir haben uns entschieden, diesen Cocktail anstelle des S3/S5-Cocktails zu verwenden, da S3 auf die Spike-kodierende Region abzielt, die als Impfstoff- und mAb-Fluchtmechanismus anfällig für Mutationen ist. Wir verwendeten ein Dosierungsschema, das aus einer Dosis von etwa 400 ug/kg des siRNA-Cocktails pro Tag an den Tagen –7, –3 und –1 unter Verwendung unserer proprietären lungenselektiven Verabreichungsformulierung bestand. Darüber hinaus verwendeten wir das gleiche Dosierungsschema, um eine andere Gruppe von Hamstern als Negativkontrolle mit einer bekannten und hochwirksamen siRNA gegen das Hepatitis-C-Virus (HCV) zu behandeln. Da es kein intranasales Medikament gibt, das wir als Positivkontrolle verwenden könnten, verabreichten wir der Positivkontrolle am Tag −1 intraperitoneal (ip) Bamlanivimab37 (LY-COV555, das von der FDA eine Notfallzulassung für die Behandlung von COVID-19 erhalten hatte). Gruppe. Jede Gruppe bestand aus sechs männlichen Hamstern und wir provozierten sie intranasal am Tag 0 mit 4 × 103 PFUs des SARS-CoV-2-Vorfahrenstamms WA-1.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass der siRNA-Cocktail Schutz vor einer SARS-CoV-2-Infektion bietet, wenn er als Präexpositionsprophylaxe (PrEP) im Goldstandard-Modell der Syrischen Hamsterkrankheit eingesetzt wird (Abb. 5a). Die negative Kontrollgruppe wies am Tag 5 nach der Infektion einen durchschnittlichen Gewichtsverlust von >7 % auf, was mit früheren Studien übereinstimmt38,39,40. Die mit siRNA behandelte Gruppe profitierte im Vergleich zu dieser Negativkontrollgruppe von einem signifikanten Schutz vor Gewichtsverlust (p < 0,05; Bootstrap-Hypothesetest und Bonferroni-Anpassung) (Abb. 5b). Dieser Gewichtsverlust war statistisch nicht von der Positivkontrollgruppe zu unterscheiden, die mit Bamlanivimab behandelt wurde. Darüber hinaus beobachteten wir eine um eine Größenordnung starke Unterdrückung der Viruslast in der Lunge der aktiven Behandlungsgruppe (Tag 5) im Vergleich zur Negativkontrolle, gemessen durch qPCR-Messung des RdRP-Gens (ΔVLlung = 10,3x, Plung < 0,001; Bootstrap-Hypothesetest und Bonferroni-Anpassung) (Abb. 5c). In ähnlicher Weise beobachteten wir auch eine signifikante Unterdrückung, wenn auch in geringerem Ausmaß, der Viruslast in den Nasenlöchern (ΔVLlung = 2,5x, Plung < 0,05; Tests der Bootstrap-Hypothese und Bonferroni-Anpassung) (Abb. 5d). In beiden Fällen war der Antikörper wirksamer als die siRNA-Behandlung, was darauf hindeutet, dass weitere Studien zur Dosisoptimierung erforderlich sind, um den siRNA-Cocktail vollständig zu einem brauchbaren Prophylaxemittel zu entwickeln.

a Dosierungsschema. Syrische Hamster (n = 6, pro Gruppe), die mit einer nicht zielgerichteten siRNA (Negativkontrolle, grau), dem LY-CoV555-Antikörper (Positivkontrolle, gelb) oder unserem Leit-siRNA-Cocktail (Behandlung, rot) vorbehandelt wurden, wurden infiziert 4 × 103 PFUs des angestammten SARS-CoV-2-Stamms; b Gewichtsveränderung nach der Infektion. Boxplot der Gewichtsveränderung nach Behandlungsgruppe im Verhältnis zur Zeit nach der Infektion; c, d Viruslast am Tag 5 nach der Infektion. Alle Messungen basierten auf qPCR des RdRP-Gens fünf Tage nach der Infektion aus homogenisierten Lungen c und Nasenlöchern d. In allen Panels wird der p-Wert wie folgt dargestellt: *<0,05,**<0,001. Strg: Kontrolle; VL: Viruslast; Neg.: negativ; Pos.: positiv; Aussage: Behandlung; ns: nicht signifikant. In den Feldern b–d stellen horizontale Linien den Median dar, Kastenkanten stellen die 25 %- und 75 %-Quartile dar und die Whisker stellen die am weitesten entfernten Datenpunkte innerhalb von bis zu 50 % des Interquartilbereichs dar. P-Werte wurden mit parametrischem Bootstrap (Methoden) berechnet.

Wir haben den gleichen siRNA-Cocktail auch in drei weiteren Formaten getestet: chemisch modifizierte siRNAs, die intranasal verabreicht wurden (Variante Nr. 1; ergänzende Abbildung 7), dieselben chemisch modifizierten siRNAs, die durch Verneblung verabreicht wurden (Variante Nr. 2), und nackte siRNAs, die durch Verneblung verabreicht wurden (Variante Nr. 3) (Methoden). Beide Behandlungsvarianten Nr. 1 und Nr. 2 zeigten eine signifikante Verringerung der Viruslast der Lunge (Plung-Variation Nr. 1 < 0,001; Plung-Variation Nr. 2 < 0,001; Bootstrap-Hypothesetest und Bonferroni-Anpassung) (ergänzende Abbildung 8a). Darüber hinaus stellten wir eine geringere, aber signifikante Verringerung der Viruslast der Nasenlöcher fest (Plung-Variation Nr. 1 < 0,001; Plung-Variation Nr. 2 < 0,05; Tests der Bootstrap-Hypothese und Bonferroni-Anpassung) (ergänzende Abbildung 8b). Allerdings schützte keine dieser Variationen vor Gewichtsverlust, wie am Tag 5 gemessen (ergänzende Abbildung 8c), was darauf hindeutet, dass sie möglicherweise eine langsamere Pharmakokinetik aufweisen als der primäre Behandlungsarm oder eine Verträglichkeitsproblematik hervorrufen.

Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass die siRNA-Behandlung die oberen Atemwege wirksam vor einer SARS-CoV-2-Infektion schützen und die Infektion deutlich abschwächen kann, was sich in Messungen der Viruslast und klinischen Manifestationen widerspiegelt, die prototypisch durch Gewichtsverlust veranschaulicht werden.

Die Prophylaxe, insbesondere die Art, die gegen das Auftreten neuartiger besorgniserregender Varianten (VoCs) resistent ist, wurde wiederholt als fehlender Bestandteil im Arsenal der Therapien zur Bekämpfung der anhaltenden COVID-19-Pandemie identifiziert. siRNAs stellen eine attraktive Modalität für die prophylaktische Behandlung dar, und tatsächlich haben verschiedene Forscher während des ersten SARS-Ausbruchs siRNAs identifiziert, die auf das Virusgenom abzielen. Dennoch passten von mehr als 9000 veröffentlichten Sequenzen nur 12 siRNAs perfekt zum SARS-Cov2-Genom. In dieser Studie berichten wir zum ersten Mal unseres Wissens über ein systematisches, genomweites RNAi-Screening gegen SARS-CoV-2. Wir haben über 16.000 RNAi-Trigger in einem massiv parallelen Reporter-Assay getestet und die besten Ergebnisse in einem In-vitro-Lebendvirus-Assay validiert. Darüber hinaus haben wir 88 siRNAs getestet, die mithilfe von Open-Source-In-silico-Entdeckungsmethoden identifiziert wurden. Anschließend haben wir mehrere siRNA-Paare als Cocktailbehandlungen im Lebendvirus-Assay getestet, um Fälle zu identifizieren, in denen die siRNA-Komponenten in Kombination synergistische Effekte erzielen. Diese Cocktails erwiesen sich als wirksam gegen drei verschiedene Virusstämme, nämlich Beta, Delta und den Urstammstamm. Ein umfassendes Screening aller 2.143 Einzel- und Doppelmutationen an einer der Zielstellen bestätigte außerdem die geringe Wahrscheinlichkeit eines Aktivitätsverlusts gegenüber zukünftigen VoCs. Schließlich haben wir die Wirksamkeit dieser Cocktails als Präventivpräventivmittel gegen eine SARS-CoV-2-Infektion bei syrischen Hamstern gezeigt.

Unsere Studie weist auch gewisse Einschränkungen auf. Erstens waren die siRNA-Cocktails in ihrer aktuellen Konstellation als Akutprophylaxe konzipiert. Es ist unklar, wie lange sie wirksam bleiben und daher möglicherweise am besten in Situationen geeignet sind, in denen ein hohes Expositionsrisiko besteht, z. B. bei Arbeitern an vorderster Front, bei Immundepression (vorübergehend oder chronisch), bei einem Ausbruch im Haushalt und während die Höhe oder eine Infektionswelle. Zweitens schützte unser siRNA-Cocktail syrische Hamster zwar vor Krankheiten, die Wirkung wurde jedoch hauptsächlich in den oberen Atemwegen beobachtet. Obwohl dies der Hauptort der Infektion ist und hinsichtlich der Eindämmung der Übertragung vielversprechend ist, bedarf es weiterer Anpassungen für den Einsatz in einer Behandlungsumgebung, die eine Optimierung für die Verabreichung an die unteren Atemwege und bis zum Lungenparenchym erfordern würde. Drittens haben wir zum Zweck dieser Machbarkeitsstudie ein Präexpositionsbehandlungsschema eingeführt, das aus einer mehrtägigen Verabreichung vor der Infektion bestand. Unser Ziel ist es, das Behandlungsschema weiter zu optimieren, bevor es zu NHPs und schließlich zu klinischen Studien am Menschen übergeht.

Trotz dieser Vorbehalte leistet die aktuelle Studie einen wesentlichen Beitrag zu den weltweiten Bemühungen zur Eindämmung von COVID-19 sowie künftigen anderen Viruspandemien mit ähnlichem Ausmaß an Mortalität und Morbidität. Hier veranschaulichen wir die Wirksamkeit intranasal verabreichter siRNA-Cocktails als präexpositionspräventive Mittel, die der wahrscheinlichen Mutationsentwicklung der verantwortlichen Krankheitserreger standhalten. Dies ist besonders ermutigend angesichts der alarmierenden Geschwindigkeit, mit der wir derzeit das Auftauchen neuer SARS-CoV-2-Varianten beobachten, die gegen Therapien der neutralisierenden mAb- und Impfstoffklassen resistent sind. Wichtig ist, dass unser vorgeschlagener Ansatz weder durch Spike-Mutationen beeinträchtigt wird noch auf einem funktionierenden Immunsystem beruht. Stattdessen nutzt es den natürlichen RNAi-Weg, der in den Epithelzellen der Atemwege aktiv ist, die den Schwerpunkt der Infektionsübertragung darstellen, und ist völlig orthogonal zu Impfstoffen und anderen immunmodulatorischen Ansätzen. Schließlich erfordern das globale Ausmaß der aktuellen Pandemie und die restriktiven Anforderungen an die Lagerung und den Versand in der Kühlkette, die mit vielen der Impfstoffe und mAb-zugelassenen Therapien verbunden sind, dringend eine dauerhafte Lösung, die auch für schwer erreichbare ländliche Gebiete zugänglich wäre. weniger wohlhabende Bevölkerungsgruppen. Unsere intranasale Verabreichung ermöglicht einen breiten Einsatz, der für die Zugänglichkeit nicht auf neuartige oder fortschrittliche medizinische Infrastruktur angewiesen ist. Wir glauben, dass diese Studie einen Paradigmenwechsel im Ansatz zur Pandemievorsorge veranschaulicht, und wir gehen davon aus, dass unsere Entdeckungs- und Validierungspipeline auf andere neu auftretende pathogene Bedrohungen anwendbar sein wird, einschließlich neuartiger Beta-Coronaviren und Influenza.

HEK293FT- (ThermoFisher Scientific) und VeroE6- (ATCC) Zellen (und ihre Derivate) wurden in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) gezüchtet, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (alle Thermo Fisher). Wissenschaftlich), bei 37 °C mit 5 % CO2. Die HEK293FT-Zelllinie wurde von Thermo Scientific (Kat.-Nr. R70007) bezogen. Die Luft-Flüssigkeits-Schnittstellenkultur (MucilAir) wurde von Epithelix erworben.

Die HEK293FT-Dicer Knock-Out (KO)-Zelllinie wurde durch CRISPR/Cas9 in der elterlichen 293FT-Zelllinie entwickelt. Die Leit-RNA (gRNA) hatte die folgende Sequenz: AAGAGCUGUCCUAUCAGAUC. Die gRNA wurde mit einer Phosphorothioat-Modifikation modifiziert, um den Abbau durch Nuklease zu verhindern, und wurde von Merck-Millipore bezogen. 80 pmol gRNA wurden mit 4 µg TrueCut Cas9 Protein (ThermoFisher) komplexiert und mit dem Amaxa-Nukleofektor in die Zellen transfiziert. Die KO-Effizienz wurde mittels Sanger-Sequenzierung bestimmt.

Für jede Kandidaten-siRNA haben wir ihre Zielsequenz innerhalb eines 150-Basenpaar-Kontexts extrahiert. Die Zielsequenz wurde in pLMN-ZsGreen-Neomycin (Transomics) an der 3'UTR eines konstitutiv exprimierten mCherry-Reporterproteins kloniert. HEK293FT-Zellen wurden mit Lipofectamine 3000 (Life Technologies) gemäß den Richtlinien des Herstellers transfiziert, entweder mit dem Sensor allein oder mit dem Sensor plus siRNA in der relevanten Konzentration. Ein zweites Plasmid, das eGFP exprimiert, wurde im Molverhältnis 1:1 co-transfiziert und diente als interne Kontrolle für die Transfektionseffizienz. Die Zellen wurden 48 Stunden nach der Transfektion mit einem MACSquant VYB-Durchflusszytometer (Milteyi Biotec) gesammelt und analysiert. Die Wirksamkeit jedes Kandidaten wurde als mittleres Verhältnis von mCherry zur eGFP-Strahlungsamplitude bewertet. Ergänzende Abbildung 9 zeigt die in diesen Experimenten verwendete Gating-Strategie.

Die shRNA-Sensor-Bibliothek wurde in einem zweistufigen Verfahren zusammengestellt. Eine Bibliothek von etwa 20.000 Oligonukleotiden, in der jede shRNA über einen Linker mit EcoRI- und MluI-Restriktionsstellen mit ihrem zugehörigen Sensor verbunden war, wurde von Twist Bioscience bezogen. Die Bibliothek wurde zunächst PCR-amplifiziert und unter Verwendung von XhoI und MfeI in einen retroviralen Empfängervektor kloniert. Letzteres enthielt das Hygromycin-resistente miR30, einschließlich seines 5'-Anteils (5'mir30). Im zweiten Schritt wurde eine 3'mir30-PGK-Venus-Kassette zwischen die shRNA und ihren Sensor eingefügt und über die EcoRI- und MluI-Stellen im Linker integriert.

Alle Plasmide für den Reporter-Assay und den destabilisierten Dicer wurden auf einem lentiviralen pZIP-Gerüst von Transomics (pZIP-SFFV-ZsGreen-Puro) aufgebaut, das zuvor modifiziert wurde, um die SFFV-ZsGreen-Kassette allein mit dem EF1alpha-Promotor zu tauschen. Für den Reporter-Assay haben wir über Gibson Cloning eine Expressionskassette stromabwärts des EF1aplha-Promotors geklont, die entweder aus einem 3xFLAG-EGFP-NLS- oder einem mCherry-STOP-150bp-Sensorfragment bestand. Für den destabilisierten ddDicer wurden die Destabilisierungsdomäne41 und der menschliche Dicer142 über PCR amplifiziert und in pZIP-EF1aplha über eine 3-Wege-Gibson-Klonierung zusammengesetzt. Das endgültige Konstrukt hatte die folgende Struktur EF1a::dd-Dicer1-IRES-Puro.

Alle In-vitro-Studien mit einem lebenden Virus wurden in einer Einrichtung der Eindämmungsstufe 3 des Cambridge Institute Therapeutic Immunology and Infectious Disease (CITIID) gemäß genehmigten Standardarbeitsanweisungen und -protokollen durchgeführt.

Das klinische Isolat von Sars-cov-2/human/Liverpool/REMRQ001/2020, ein als WT bezeichnetes Isolat der ersten Welle, wurde in Vero-E6 vermehrt und in dieser Studie hauptsächlich für Lebendvirusinfektionen verwendet. Zusätzliche Experimente wurden mit neu entstandenen Delta- und Omicron-Varianten durchgeführt. Die vermehrten lebenden infektiösen SARS-CoV-2-Viren B.1.1.617.2 (Delta) und B.1.1.529 (Omicron) wurden freundlicherweise von Professor Wendy Barclay (Imperial College London) und Dr. Jonathan Brown (Imperial College London) als Teil der Veranstaltung zur Verfügung gestellt der vom G2P-UK National Virology Consortium durchgeführten Arbeit. Das mit der Omicron-Variante übereinstimmende Virusisolat, das freundlicherweise von Gavin Screaton an der Universität Oxford gespendet wurde, wurde drei Tage lang auf Vero-ACE2-TMPRSS2 (VAT)-Zellen vermehrt, bis eine zytopathische Wirkung beobachtet wurde.

Transfizierte Vero E6-Zellen mit Kontroll-GFP oder experimenteller siRNA/s wurden in 96-Well-Zellen hergestellt. Sofern nicht anders angegeben, wurden 10.000 VeroE6-Zellen mit 100 nM siRNA-Behandlung transfiziert und 24 Stunden nach der siRNA-Behandlung mit SARS-Cov-2 infiziert. Die Zellen wurden in biologischen Dreifachansätzen entweder mit der SARS-CoV-2 WT-, Delta- und Omicron-Variante bei moi 1 oder 0,1 TCID50 pro Zelle in 50 µl DMEM mit oder ohne bekannte SARS-CoV-2-Inhibitoren infiziert. Infektionen wurden bis zu 48/72 Stunden nach der Infektion (pi) inkubiert und Zellkulturüberstände wurden bei 0, 24, 48 und/oder 72 Stunden pi geerntet, wobei virale RNAs durch RT-qPCR quantifiziert und/oder infektiöse Viruseinheiten durch titriert wurden TCID50. Danach wurden 40 µl des Mediums direkt in 160 µl TRIzol™ LS-Reagenz (ThermoFisher) gesammelt. Virale RNA wurde mit den Direct-zol-96-RNA-Kits (ZYMO-Forschung) extrahiert und als Vorlage für qRTPCR zur Messung der viralen Kopienzahl verwendet. Chloroquindiphosphat (BioVision) wurde in einer Endkonzentration von 50 uM und Molnupiravir (Focus Biomolecules) in einer Endkonzentration von 20 uM verwendet. Die Sequenzierung des Beta-Replikons wurde zuvor beschrieben34.

Zehnfache Reihenverdünnungen der gesammelten Virusüberstände wurden in DMEM-Kulturmedien hergestellt. Von diesen Verdünnungen wurden 50 µl auf Monoschichten von Vero E6-Zellen geimpft, die auf 96-Well-Platten gezüchtet und bei 37 °C in einem 5 % CO2-Inkubator inkubiert wurden. Die Virustiter wurden 4 Tage pi gesammelt und nach der Reed-Muench-Methode als TCID50 ml-1-Werte ausgedrückt43.

Die Kopienzahl des viralen Genoms wurde mittels qPCR unter Verwendung des Charité/Berlin Primer Probe Panel (IDT) und des TaqPath™ 1-Step Multiplex Master Mix (ThemoFisher) gemessen. Anschließend verglichen wir die durchschnittlichen Ct-Werte jeder Erkrankung mit den Ct-Werten der eGFP-siRNA.

Die Oligos für den S5-Mutagenese-Sättigungstest wurden von Twist Bioscience bezogen und wie oben beschrieben in die shRNA-Sensor-Bibliothek kloniert. Ähnlich wie beim vorherigen Screening haben wir auch 948 Kontroll-shRNAs von Fellmann et al.22, 511 mit hoher Wirksamkeit und 437 mit geringer Wirksamkeit eingebaut. Dieses Screening folgte mit einigen Modifikationen einer ähnlichen Struktur wie das genomweite Screening: (a) Wir modulierten die RNAi-Maschinerie mit nur drei Bedingungen: Hochregulierung von Dicer, Herunterregulierung von Dicer und keine Modulation. Um zwischen der starken und der schwachen Kontroll-shRNA zu unterscheiden, wurde eine Pipeline für maschinelles Lernen aufgebaut. Der beste Klassifikator wurde mithilfe einer Kreuzvalidierung ausgewählt und hatte eine durchschnittliche Präzisionsrate von 81,1 % (Wert von 1,14 %). Der Klassifikator weist jedem Trigger-Ziel-Paar im Assay einen Wirksamkeitswert zu. Der Effekt jedes mutierten Ziels wurde als Klassifikatorwert für das mutierte Trigger-Ziel-Paar über dem Wert des perfekt passenden Trigger-Ziel-Paares ermittelt.

Männliche Goldhamster im Alter von 6 bis 8 Wochen wurden an den Tagen -7, -3 und -1 vor der Infektion mit siRNA-Cocktails behandelt. In der Studie wurde eine intranasale (IN) Verabreichung an Hamstern unter Verwendung einer proprietären Formulierung durchgeführt. Jeder Hamster wurde auf eine sterile Operationsunterlage gelegt und leicht ausgestreckt, um das Genick besser festhalten zu können. Der Hamster wurde auf den Rücken gedreht, damit er atmen und sich wohlfühlen konnte. Mit flachem Hals und Kinn und parallel zum Polster wurde die Spitze der Pipette in einem 45-Grad-Winkel in der Nähe des linken Nasenlochs des Hamsters platziert und 5 μl Dosiermaterial wurden 2–3 Sekunden lang in das Nasenloch verabreicht Intervall dazwischen für insgesamt 25 μL/Nasenloch. Der Hamster wurde 5 Sekunden lang in dieser Position gehalten oder bis er das Bewusstsein wiedererlangte, dann wurde die Verabreichung für das andere Nasenloch für insgesamt 50 μl/Hamster wiederholt. Nach dem Eingriff wurde der Hamster in seinen Käfig zurückgebracht und 5–10 Minuten lang auf etwaige Nebenwirkungen überwacht.

Für die Verabreichung über einen Vernebler wurde siRNA in PBS + Gelatine 0,5 mg/ml verdünnt. Das Aerosol wurde mittels Vibrating Mash Nebulization (VMN) hergestellt und die Zerstäubung wurde in einer Biological Safety Cabinet (BSC) durchgeführt.

Wenn angezeigt, wurde 1 mg mAb555 am Tag -1 intravenös verabreicht. Am Tag 0 wurden Hamster durch intranasale Infektion mit dem 4 × 103 PFU-Virus mit SARS-CoV-2 infiziert. Am Tag 5 nach der Infektion wurden die Hamster getötet und die Luftröhre und die Lunge zur weiteren Analyse entnommen.

Wir haben alle p-Werte mittels Bootstrap-Hypothesetests berechnet, indem wir von jedem Hamster den Mittelwert seiner Gruppe subtrahiert haben, Hamster aus jeder Gruppe mit 20.000-facher Ersetzung erneut beprobt haben und den Anteil der Stichproben berechnet haben, bei denen die Differenz zwischen den Mittelwerten größer als der Realwert war Unterschied. Die dargestellten p-Werte sind nach Bonferroni-Korrektur für die vier Arme.

Wir haben das erste Covid-Screening (Abb. 1) mit zwei Replikaten (definiert als separate sortierte Zellen) durchgeführt. Wir führten die Screen-Validierung (Abb. 2) mit zwei Replikaten (definiert als separate Transfektionsexperimente) für jede getestete siRNA bei jeder Konzentration durch. Wir führten das Lebendvirus-Experiment (Abb. 3) mit 3 Replikaten (definiert als separate Zellinfektionsexperimente) für jede siRNA durch und führten eine statistische Analyse mit dem Dunnett-Test durch. Wir haben die Sättigungsmutageneseanalyse (Abb. 4) mit 2.143 verschiedenen siRNAs durchgeführt und dabei drei verschiedene Fehlpaarungen pro Position getestet. Wir führten die In-vivo-Experimente (Abb. 5) mit sechs Hamstern pro Gruppe durch und führten eine statistische Analyse mithilfe von Bootstrap-Hypothesetests durch (Subtrahieren des Mittelwerts seiner Gruppe von jedem Hamster, Neubeprobung der Hamster jeder Gruppe mit 20.000-maligem Ersatz und Berechnen des Bruchteils). von Stichproben, bei denen die Differenz zwischen den Mittelwerten größer war als die tatsächliche Differenz).

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Daten aus den Sensor-Assay-Experimenten, unverarbeitete Daten und Metadatendateien sind auf Anfrage erhältlich. Die Quelldaten für Grafiken und Abbildungen sind in den Zusatzdaten 1-5 enthalten.

Der zur Replikation der Ergebnisse erforderliche Code ist auf Anfrage bei den Autoren erhältlich.

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Diese Studie wurde zum Teil von der Bill & Melinda Gates Foundation und vom intramuralen Programm der National Institutes of Health finanziert. Die darin enthaltenen Erkenntnisse und Schlussfolgerungen stammen von den Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Positionen oder Richtlinien der Bill & Melinda Gates Foundation wider. Diese Arbeit wurde teilweise im Rahmen von CRADA 2020-0597 zwischen VRC/NIAID und Eleven Therapeutics durchgeführt. Ein Teil der Arbeit wurde durch Forschungsstipendien des Wellcome Trust an IG finanziert, Referenznr. 207498/Z/17/Z und MRC/UKRI G2P-UK National Virology Consortium, Referenz-Nr. MR/W005611/1. IG ist Senior Fellow des Wellcome Trust.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Ohad Yogev, Omer Weissbrod, Giorgia Battistoni, Dario Bressan.

Eleven Therapeutics, Cambridge, Vereinigtes Königreich

Ohad Yogev, Giorgia Battistoni, Dario Bressan, Adi Naamati, Ilaria Falciatori und Ahmet Can Berkyurek

Eleven Therapeutics, Tel Aviv, Israel

Omer Weissbrod, Roni Rasnic, Shaul Ilan und Yaniv Erlich

CRUK Cambridge Institute, Universität Cambridge, Li Ka Shing Centre, Cambridge, Vereinigtes Königreich

Giorgia Battistoni, Dario Bressan und Gregory James Hannon

Universität Cambridge, Abteilung für Pathologie, Abteilung für Virologie, Cambridge, Vereinigtes Königreich

Rhys Izuagbe, Myra Hosmillo und Ian Goodfellow

Eleven Therapeutics, Cambridge, MA, USA

Iris Grossmann

Vaccine Research Center, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA

Lauren McCormick, Christopher Cole Honeycutt, Timothy Johnston, Matthew Gagne und Daniel C Douek

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OY und YE haben dieses Papier mit Beiträgen von GB, DB, OW und MGOY verfasst, YE und OW haben die Abbildungen und Tabellen entworfen. OY, GB, DB, AN und IF und ACB führten die In-vitro-Experimente durch. RI, MH und IGG führten die Experimente mit lebenden Viren durch und führten statistische Analysen durch. LM, TJ, CCH und MG führten die In-vivo-Studie fort. YE, OW und RR führten Analysen der Sequenzierungsdaten durch und führten statistische Analysen durch. YE, SI, IG, DD, GJH trugen zur Diskussion und zum Studiendesign bei.

Korrespondenz mit Ohad Yogev.

OY, OW, AN, IF, ACB, RR, SI, IG und YE sind Mitarbeiter von Eleven Therapeutics. GJH ist Mitbegründer von Scientific und hält Anteile an Eleven Therapeutics. GB und DB halten Anteile an Eleven Therapeutics. Als diese Arbeit durchgeführt wurde, fungierte IG als Berater bei Eleven Therapeutics.

Alle In-vivo-Studien wurden gemäß den NIH-Vorschriften und -Standards für die humane Pflege und Verwendung von Labortieren sowie den Animal Care and Use Committees des NIH Vaccine Research Center und BIOQUAL, Inc. (Rockville, Maryland) durchgeführt. Alle Studien wurden bei BIOQUAL, Inc. durchgeführt.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: Zhijuan Qiu. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Yogev, O., Weissbrod, O., Battistoni, G. et al. Von einem genomweiten Screening von RNAi-Molekülen gegen SARS-CoV-2 bis hin zu einer validierten Breitband- und wirksamen Prophylaxe. Commun Biol 6, 277 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04589-5

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Eingegangen: 29. Oktober 2022

Angenommen: 13. Februar 2023

Veröffentlicht: 16. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04589-5

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