Atlas der mRNA-Translation und des mRNA-Zerfalls für Bakterien

Nature Microbiology Band 8, Seiten 1123–1136 (2023)Diesen Artikel zitieren

8233 Zugriffe

150 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Die Regulierung der Messenger-RNA-Stabilität ist für die programmierte Genexpression in Bakterien von entscheidender Bedeutung und wird durch eine Vielzahl molekularer Mechanismen erreicht. Durch Massensequenzierung von 5′-monophosphorylierten mRNA-Zerfallszwischenprodukten (5′P) zeigen wir, dass der kotranslationale mRNA-Abbau sowohl bei grampositiven als auch bei gramnegativen Bakterien erhalten bleibt. Wir zeigen, dass bei Arten mit 5′–3′-Exonukleasen die Exoribonuklease RNase J das nachlaufende Ribosom verfolgt, um in vivo einen Einzelnukleotid-Zehenabdruck der 5‘-Position des Ribosoms zu erzeugen. Bei anderen Arten, denen 5′–3′-Exonukleasen fehlen, verändert die Positionierung der Ribosomen die endonukleolytischen Spaltungsstellen. Mithilfe unseres Metadegradom-Sequenzierungsansatzes (5′P-Degradom) charakterisieren wir 5′P-mRNA-Zerfallszwischenprodukte in 96 Arten, darunter Bacillus subtilis, Escherichia coli und Synechocystis spp. und Prevotella copri und identifizieren ribosomenblockierende Reaktionen auf Codon- und Genebene auf Stress und medikamentöse Behandlung. Wir wenden die 5′P-Sequenzierung auch auf komplexe klinische Mikrobiome und Umweltmikrobiome an und zeigen, dass die Metadegradomsequenzierung eine schnelle, artspezifische posttranskriptionelle Charakterisierung von Reaktionen auf Arzneimittel- oder Umweltstörungen ermöglicht. Schließlich erstellen wir einen Degradomatlas für 96 Arten, um die Analyse der Mechanismen des RNA-Abbaus in Bakterien zu ermöglichen. Unsere Arbeit ebnet den Weg für die Anwendung der Metadegradomsequenzierung zur Untersuchung der posttranskriptionellen Regulation in nicht kultivierbaren Arten und komplexen mikrobiellen Gemeinschaften.

Der Abbau und die Translation von Messenger-RNA (mRNA) sind eng miteinander verbunden, und Veränderungen in der Ribosomendynamik modulieren direkt die Stabilität von Messenger-RNA1,2,3,4. In Eukaryoten sind Proteinsynthese und mRNA-Zerfall durch die 5′–3′-Exonuklease Xrn1 verbunden, die dem letzten translatierenden Ribosom folgt und in vivo einen Zehenabdruck seiner Position erzeugt5,6. Der RNA-Abbau in Bakterien ermöglicht die Anpassung an veränderte Umgebungen, unser Verständnis des RNA-Abbaus in Bakterien wurde jedoch durch die Vielfalt der RNA-Abbaumechanismen behindert. Es wurde angenommen, dass der bakterielle RNA-Abbau über eine endonukleolytische Spaltung beginnt, gefolgt von einem 3′–5′-Abbau7,8,9,10. Obwohl über die exonukleolytische 5′–3′-RNA-Aktivität von RNase J in Bacillus subtilis11 und seinen Homologen in anderen Spezies9 berichtet wurde und bekannt ist, dass die Translationseffizienz die mRNA-Stabilität in Bakterien moduliert3,12, verstehen wir nicht, wie der kotranslationale mRNA-Abbau das Bakterium formt Degradom oder ob dieser Prozess bei Arten mit unterschiedlicher mRNA-Abbaumaschinerie unterschiedlich ist.

Um die Regulierung der RNA-Biologie in Bakterien besser zu verstehen, untersuchten wir den mRNA-Abbau in Referenzbakterienstämmen und komplexen Mikrobiomen mithilfe optimierter 5'-monophosphorylierter (5′P) mRNA-Zerfallszwischenstufen (Degradom)-Sequenzierung (5PSeq). Wir untersuchten den Grad, in dem natürlich vorkommendes 5'P die Ribosomendynamik in vivo widerspiegelt, und charakterisierten das 5'P-Degradom als Reaktion auf Umweltstress und medikamentöse Behandlung in Referenzstämmen und komplexen Stuhlkulturen. Wir haben mRNA-Abbaumuster in 96 kultivierbaren und nicht kultivierbaren Arten, einschließlich des Modellorganismus B. subtilis, analysiert und berichten hier über unsere Ergebnisse.

Wir analysierten das 5′P-mRNA-Degradom in einzelnen Arten und komplexen Bakteriengemeinschaften unter Verwendung optimierter 5PSeq)5,13,14,15 (Ergänzungstabellen 1 und 2 und Methoden). Zuerst untersuchten wir das 5′P-Degradom offener Leserahmen (ORFs) in Arten mit 5′–3′-Zerfall. B. subtilis kodiert für die 5′–3′-Exonuklease RNase J11. Obwohl RNase J nicht homolog zum eukaryotischen XRN1 ist, stellten wir die Hypothese auf, dass es über seine 5′–3′-Exonukleaseaktivität das letzte translatierende Ribosom in mRNAs „jagen“ könnte, die einem kotranslationalen Zerfall unterliegen, ähnlich wie XRN1 in Hefe5,16. Unsere Analyse ergab eine Periodizität von 3 Nukleotiden (nt) der 5'P-Zählungen (Abb. 1a) mit einer 5'P-Präferenz für das zweite Nukleotid jedes Codons (F1), sowohl auf Metagen- als auch auf Einzelgenebene (Abb. 1a). und erweiterte Daten Abb. 1a). 5′P-Abbauzwischenprodukte reichern sich 11 bzw. 14 nt vor den Translationsstart- und -stoppstellen an, wie es von langsam initiierenden und terminierenden Ribosomen zu erwarten ist. Dieses Muster ist analog zu den Stellen – 14 nt vom Anfang und –17 nt vom Ende in der Keimhefe5,15. Diese um 3 nt kleinere Schutzgröße kann durch den bekannten Unterschied in der Ribosomengröße zwischen Eukaryoten und Bakterien erklärt werden17. Wir haben die Assoziation von 5'P-Zerfallszwischenprodukten mit translatorischen Ribosomen durch die Anwendung von 5PSeq auf polyribosomale Fraktionen von Saccharosedichtegradienten bestätigt und ähnliche Muster beobachtet (Extended Data, Abb. 1b). Um seinen biologischen Ursprung zu demonstrieren, haben wir bestätigt, dass die In-vitro-Fragmentierung derselben RNA die in vivo beobachtete 3-nt-Periodizität um >99,5 % (Fast Fourier Transform (FFT)-Signal fällt auf 0,11) und durch Start/Stopp-assoziierte Zehenabdrücke eliminiert (Abb . 1a). Um schließlich zu untersuchen, ob RNase J in diesem Prozess eine Rolle spielt, wiederholten wir die Analyse in einem B. subtilis-RNase-JA-Deletionsstamm (rnjA). Dies ergab, dass die RNase-JA-Aktivität das beobachtete 5'P-Verteilungsmuster untermauert, das aus dem kotranslationalen mRNA-Abbau resultiert (Abb. 1b).

a, Metacounts (5PSeq-Lesevorgänge pro Million (RPM)) von 5'-Kartierungspositionen relativ zu Translationsinitiations- und Terminationsstellen von ORFs aus B. subtilis. Es werden keine Behandlungskontrolle (NT) (grün), CAM-behandelt (gelb) und zufällig fragmentiert (in rot) angezeigt. Identifizierte RNasen werden in der oberen rechten Ecke hervorgehoben (die nicht identifizierten sind hellgrau gefärbt). Die ursprünglichen 5PSeq-Positionen werden angegeben (es wurde keine P-Site-Korrektur angewendet). FFT für die beobachtete Periodizität und ein Histogramm, das den relativen 5PSeq-Rahmenschutz für alle Codons darstellt, werden ebenfalls angezeigt. b, 5′P-Metacount für den ∆rnjA-Stamm, wie in a. c, Spaltungsmotivpräferenz an 5'P-Stellen und ± vier Basen für repräsentative Arten aus den Phyla Bacillota, Cyanobacteria, Pseudomonadota und Bacteroidota, berechnet mit dem Shannon-Entropie-basierten Maß für den Nukleotidbeitrag, wie im R-Paket ggseqlogo64 implementiert. Rechts ist das Vorhandensein der in jeder Art identifizierten RNasen hervorgehoben. RNE/G (Ribonuklease-E/G-Familienproteine) weist auf das Vorhandensein der konservierten katalytischen Domäne zwischen beiden Ribonukleasen hin. EPA, tRNA-Bindungsstellen E, P und A am Ribosom.

Als nächstes untersuchten wir Arten mit oder ohne in ihrem Genom annotierte 5'–3'-RNA-Exonukleasen (Extended Data Abb. 2)9, um die Rolle anderer Nukleasen beim mRNA-Abbau zu beurteilen. Zuerst haben wir Bacillota (Bacillus amyloloquefaciens, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri), Cyanobakterien (Synechocystis sp. PCC 6803) und Pseudomonadota (Caulobacter crescentus) getestet, die alle für RNase J kodieren. Wir beobachteten ein klares 3-nt-Periodizitätsmuster über die gesamte Länge kodierende Regionen, wobei sich 5'P-Reads häufig am zweiten Nukleotid (F1) jedes Codons und 11 bzw. 14 nt stromaufwärts des Start- bzw. Stoppcodons ansammeln (Extended Data Abb. 2), wie für B. subtilis beobachtet (Abb . 1a). Interessanterweise wurde bei Synechocystis sp. PCC 6803 Das Ribosomenschutzmuster wurde durch ein zusätzliches Nukleotid ersetzt (d. h. Akkumulation bei –12 nt vom Start und –15 nt von den Stoppcodons) (Extended Data Abb. 2d). Dies könnte entweder durch eine unterschiedliche Größe oder Konformation des Ribosomenschutzes oder durch das Vorhandensein potenzieller Cofaktoren erklärt werden18,19. Wir haben auch Pseudomonadota-Arten getestet, darunter Escherichia coli (DH5α und MG1655) und anaerobe Bacteroidota (Alistipes finegoldii, Prevotella copri, Prevotella timonensis und Parabacteroides merdae), von denen keine 5'–3'-Exonukleaseaktivität aufweist. Wir beobachteten ein 3-nt-Periodizitätsmuster in den untersuchten Bacteroidota, die Homologe der RNE/G-Proteinfamilie (RNE/G)20 und RNase Y aufweisen. In E. coli, das RNase E anstelle von RNase Y aufweist, beobachteten wir eine subtile 3-nt-Periodizität (Erweiterte Daten, Abb. 2f), was beim Stamm MG1655 weniger auffällig war, wo sich weniger 5'P-Lesevorgänge in der kodierenden Region ansammeln (Erweiterte Daten, Abb. 2g). Im Gegensatz zu Arten mit 5'–3'-Exonuklease akkumulieren diejenigen, denen RNase J fehlt, endonukleolytische 5'P-Stellen um die Start- und Stoppcodons. Darüber hinaus beobachteten wir bei den meisten Arten eine 5'P-Spaltung, die das Startcodon selbst überlappte und sich vom erwarteten Ribosomenschutz 11 nt stromaufwärts unterschied. Die mit dem Startcodon verbundene Spaltung war bei C. crescentus besonders deutlich. Wir schlagen vor, dass es einen Zusammenhang zwischen der Translationsinitiierung und dem mRNA-Zerfall gibt, wobei endonukleolytische Spaltungen häufig an den Startcodons auftreten (Extended Data Abb. 2).

Die beobachtete 3-nt-Periodizität könnte auf das in vivo 5'-3'-Einzelnukleotid-Zehendrucken der Ribosomenposition zurückzuführen sein, wie in Eukaryoten berichtet . Alternativ könnte es eine Folge der Wechselwirkung zwischen Endonuklease-spezifischen Spaltungspräferenzen, unterschiedlicher mRNA-Zugänglichkeit und nicht zufälliger Verteilung von Nukleotiden entlang der kodierenden Regionen sein. Frühere Arbeiten haben die Sequenzpräferenz von RNase E21,22 und RNase Y23,24 in ausgewählten Arten untersucht. Daher haben wir uns entschieden, eine vielfältige Gruppe von Arten mit unterschiedlichen RNA-Abbaumaschinen einzubeziehen, um den Umfang der abgedeckten Arten zu erweitern (Abb. 1c). Das Vorhandensein von RNase J und E ohne Y in Synechocystis sp.25 und C. crescentus ist mit 5′P-mRNA-Abbauzwischenprodukten verbunden, wobei ein A mit vorangestelltem U bevorzugt wird (–1 U/+1 A). Das Vorhandensein von RNase Y- und RNE/G-Proteinhomologen in Bacteroidota lässt auf eine Präferenz für +1 A schließen. In Bacillota, wo die 5'–3'-exonukleolytische Aktivität dominiert, weisen 5'P-mRNA-Abbauzwischenprodukte homogenere Sequenzmotive auf. Es ist möglich, dass RNase J endonukleolytisch erzeugte Spaltstellen trimmt. In Übereinstimmung mit dieser Hypothese zeigt sich in der rnjA-Deletionsmutante von B. subtilis eine 5′P-Präferenz für A (Extended Data Abb. 3a), ähnlich wie bei Bacteroidota, wo die Endonuklease RNase Y der Haupttreiber des RNA-Zerfalls ist (Abb. 1c)26 ,27. Wir testeten die Wirkung von RNase JB (rnjB)- und RNase Y (rny)-Deletionen in B. subtilis und stellten fest, dass ihr Beitrag zum beobachteten Muster minimal war (Extended Data Abb. 3a). Interessanterweise beobachteten wir bei der Durchführung derselben Analyse nach einem Hitzeschock (HS) einen deutlichen Anstieg der +1 G-Präferenz in allen Proben (Erweiterte Daten, Abb. 3b). Dies legt nahe, dass das Zusammenspiel zwischen RNasen und der ribosomalen Position dynamisch ist und als Reaktion auf Umweltherausforderungen verändert werden kann. Wir haben auch getestet, ob die heterologe Expression von Streptococcus pyogenes rnjA ausreicht, um das in E. coli beobachtete endonukleolytische Muster zu verändern. Selbst wenn rnjA auf mRNA-Ebene exprimiert wurde, gemessen mit 5PSeq, blieb das Muster (–1 U/+1 A/+3 G) erhalten (Extended Data Abb. 3c), was darauf hindeutet, dass die RNase E-Aktivität immer noch den mRNA-Zerfall dominiert. Um zu bestätigen, dass die beobachteten Muster durch biologische Mechanismen verursacht werden, zeigen wir einen Verlust der 5'P-Präferenz nach In-vitro-RNA-Fragmentierung in Proben von B. subtilis und E. coli (Extended Data Abb. 3a, c). Wir kommen zu dem Schluss, dass die Sequenzpräferenz der natürlich vorkommenden 5'P-mRNA-Abbauzwischenprodukte bei phylogenetisch verwandten Arten erhalten bleibt und durch das Übersprechen zwischen RNA-Abbauwegen geprägt ist.

Um zu untersuchen, wie Ribosomen die 5′P-Verteilung beeinflussen, haben wir die Ribosomendynamik mit Chloramphenicol (CAM) gestört. Als die Ribosomen bei der Dehnung zum Stillstand kamen, beobachteten wir ein erhöhtes 3-nt-Ribosomenschutzmuster bei B. subtilis, L. plantarum, L. reuteri und B. amyloliquefaciens (Abb. 1a und erweiterte Daten Abb. 2a, c). Wir beobachteten auch einen relativen Überschuss an 5'P-Abbauzwischenprodukten um die 5'-Regionen von ORFs und eine Abnahme des Schutzes um die 3'-Regionen, was eher mit einer spezifischen Hemmung der Translationsverlängerung als mit der Initiierung oder Beendigung vereinbar ist17. Die 5'P-Akkumulation in den 5'-Regionen von ORFs war auch bei Arten ohne 5'-3'-Exonukleaseaktivität erkennbar, bei denen nicht erwartet werden kann, dass die endonukleolytische Aktivität Einzelnukleotid-Auflösungsinformationen zur Ribosomenposition liefert (Extended Data Abb. 2f– k). Unsere Ergebnisse legen nahe, dass das Abwürgen von Ribosomen nach der CAM-Behandlung die In-vivo-Zugänglichkeit von Endonukleasen einschränken und das 5'P-mRNA-Degradom beeinflussen kann. Als nächstes überlegten wir, ob die Häufigkeit von 5'P-mRNA-Zerfallszwischenprodukten als Proxy für codonspezifische Ribosomenpausen in Spezies dienen könnte, die RNase J enthalten. Durch Ausrichtung der 5'P-Reads auf die jeweilige Aminosäure erzeugten wir Aminosäure-spezifisches Metagen Profile (Abb. 2 und Erweiterte Daten Abb. 4). Bei L. plantarum zeigte sich eine deutliche 5'P-Akkumulation, die mit langsamen Ribosomen am Stop- und Cys-Codon verbunden ist, wahrscheinlich verbunden mit der begrenzten Verfügbarkeit von freiem Cys im Wachstumsmedium (Abb. 2a)28,29. Als nächstes haben wir den Translationsprozess gestört und die Auswirkungen auf die 5′P-Akkumulation getestet. Zunächst testeten wir unsere Fähigkeit, codonspezifische Pausen nach einer 10-minütigen Behandlung mit Mupirocin (MUP) zu erkennen, einem Antibiotikum, das auf die Ile-tRNA-Synthetase abzielt. Die MUP-Behandlung führte zu Ribosomenblockaden an Ile-Codons und einer deutlichen Akkumulation von 5'P-Reads 14 nt stromaufwärts von denen in L. plantarum, L. reuteri und B. subtilis (A-Stellenblockade; Abb. 2a und erweiterte Daten Abb. 4a). ). Dies legt nahe, dass Ribosomenpositionen das bakterielle Degradom prägen. Als nächstes untersuchten wir codonspezifische Pausen im Zusammenhang mit einer 5-minütigen CAM-Behandlung bei B. subtillis, L. plantarum, L. reuteri und B. amyloliquefaciens (Abb. 2a, b und erweiterte Daten Abb. 4b). Zusätzlich zu einer allgemeinen Hemmung der Translationsverlängerung führt CAM auch zu einer kontextspezifischen Akkumulation von Ribosomen30,31. Es wurde nämlich bereits früher berichtet, dass die CAM-Behandlung von E. coli die Ribosomenblockierung verstärkt, wenn Ala (und seltener Ser, Thr oder Gly) an der E-Stelle positioniert ist. Unter Verwendung von 5PSeq identifizierten wir bei den getesteten Spezies mit RNase J auch eine CAM-induzierte Ribosomenblockierung 8 nt stromaufwärts von Ala und Ser (Abb. 2a, b und erweiterte Daten Abb. 4b). Wir kommen zu dem Schluss, dass kontextspezifische Ribosomenstillstände nach der CAM-Behandlung in Bakterien konserviert bleiben. Darüber hinaus zeigen unsere Ergebnisse, dass 5′P-Signaturen als molekulare Reporter für Antibiotika verwendet werden können, die auf den Translationsprozess in Arten mit RNase J abzielen.

a–c, Heatmaps für die Aminosäure-spezifische 5′P-RNA-Abdeckung, farbcodiert von blau (niedrig) bis gelb (hoch). Der Abstand zu bestimmten Aminosäuren wird als Anzahl der Nukleotide angegeben. Ribosomen, die bei –14 pausieren, weisen auf einen Stillstand an der A-Stelle hin. Ausgewählte Aminosäuren werden auch als Liniendiagramme dargestellt. a, L. plantarum pausiert nach der CAM- (gelb) und MUP-Behandlung (lila) im Vergleich zur NT-Kontrollprobe, die bei OD600 = 0,6–0,8 (OD = 0,6) entnommen wurde. b: B. subtilis kontextspezifische CAM-Pausen, die durch die vorletzte Aminosäure (der Peptidkette) induziert werden, dargestellt an der Position –8 (CAM, gelb). c, L. plantarum macht nach einer Stressbehandlung eine Pause. d,e, PCA des Ribosomenschutz-Phänotyps (Methoden) unterscheidet zwischen Stress und medikamentöser Behandlung bei L. plantarum (d) und B. subtilis (e). Die getrennten Cluster unbehandelter B. subtilis können durch Unterschiede in ihrer Wachstumsphase bei der Ernte erklärt werden (OD600 0,2–0,3 bzw. 0,6–0,8).

Als nächstes untersuchten wir 5'P-RNA-Abbauprofile unter Stressbedingungen in B. subtillis, L. plantarum und L. reuteri (Abb. 2c und Extended Data Abb. 4). Wir identifizierten deutliche Ribosomenpausen in L. plantarum an Tyr-Codons sowohl unter Hitzeschock- als auch unter Nährstoffmangelbedingungen (LNUT) sowie an His- und Arg-Codons im stationären Wachstum (STAT; Abb. 2c). 5P-seq bietet einen Überblick über die Ribosomen-abhängige Akkumulation von 5'P-Abbauzwischenprodukten an allen Aminosäurepositionen. Wir haben diese Daten verwendet, um für jede Probe einen allgemeinen Aminosäure-spezifischen „Ribosomenschutz-Phänotyp“ zu generieren (Methoden). Durch die Kombination dieses Phänotyps mit der Hauptkomponentenanalyse (PCA) konnten wir Kontrollproben, gestresste und medikamentenbehandelte Proben in L. plantarum trennen (Abb. 2d). In ähnlicher Weise trennt dieselbe Strategie medikamentöse Behandlung, Stressbedingungen und Zeitverlaufsmessung der stationären Phase in B. subtilis (24 Stunden, 48 Stunden und 8 Tage) (Abb. 2e). Somit können codonspezifische Ribosomenschutzphänotypen genutzt werden, um medikamentöse Behandlung und andere Stresszustände zu unterscheiden. Um codonspezifische Ribosomenstillstände als Reaktion auf Umweltveränderungen zu analysieren, konzentrierten wir uns auf 5'P-Reads, die mit Ribosomen-A-Stellenstillständen verbunden sind (Extended Data Abb. 4c, d). Nach einem Hitzeschock in L. plantarum stellten wir fest, dass Gln-Codons eine höhere 5′P-Abdeckung aufweisen, was auf codonspezifische Ribosomenblockaden hindeutet. Beim stationären Wachstum waren Arg-Codons (CGG, CGA, AGG und AGA, jedoch weniger als CGG und CGU) mit Ribosomenstillständen assoziiert (Extended Data, Abb. 4e). Interessanterweise, wenn man die gleiche Strategie auf B. subtilis anwendet. (Extended Data Abb. 4d) Wir beobachteten, dass Hitzeschock auch mit Ribosomenstillständen an Gln-Codons (CAA und CAG) und stationärem Wachstum mit Stillständen an Arg-Codons (CGC) verbunden war (Extended Data Abb. 4f). Dies deutet darauf hin, dass Umwelteinflüsse zu ähnlichen codonspezifischen Ribosomenblockaden führen können, die entweder auf stressspezifische Defekte der tRNA-Verarbeitung und -Biosynthese32,33 oder auf Veränderungen in den Aminosäurepools29,34,35 zurückzuführen sein können.

Zusätzlich zu globalen Mustern liefert 5PSeq auch Informationen zu genspezifischen Ribosomenstopps. Wir haben die relative Stärke von 3-nt-Schutzmustern über Gene hinweg gemessen (genspezifischer Frame Protection Index (FPI); Methoden). Dies liefert ein Maß für den relativen Stillstand des letzten translatierenden Ribosoms unabhängig von der mRNA-Häufigkeit für jedes Gen (das heißt, es werden Spitzen und Täler entlang der mRNA-Sequenz verglichen). Arzneimittel- und Stressbehandlungen führen zu Veränderungen im FPI einzelner Gene, die an bakteriellen Reaktionen beteiligt sind (Erweiterte Daten, Abb. 5 und Ergänzungstabelle 3). Beispielsweise führt ein Hitzeschock zu einem erhöhten FPI (höhere 3-nt-Periodizität) für mRNAs, die mit der Sporenwand assoziiert sind (False Discovery Rate (FDR) < 0,022) und auch zu Salzstress mit Oxidoreduktase-Aktivität (FDR < 0,011). Während des stationären Wachstums stieg der FPI von Genen, die mit der Sporenwand in Zusammenhang stehen (FDR < 2,2 × 10–16), während der FPI von Genen, die an der Lys-Biosynthese und der ribosomalen RNA-Verarbeitung beteiligt sind, abnahm (FDR < 0,024 bzw. < 0,044). Interessanterweise nahm der relative FPI der ribosomalen Proteingene deutlich ab, wenn er CAM oder MUP ausgesetzt wurde (FDR < 2,2 × 10–16), was auf eine relative Veränderung des Ribosomenschutzes in Bezug auf den Rest des Transkriptoms als Reaktion auf die Medikamente hindeutet. Diese Ergebnisse zeigen, dass 5P-seq auch auf genspezifischer Ebene über die Ribosomenposition und Translationsregulation während Stress informieren und schnelle phänotypische Translationsreaktionen auf eine medikamentöse Behandlung erkennen kann.

Die Quantifizierung der relativen Häufigkeit von mRNA-Abbauzwischenprodukten kann mithilfe von 5PSeq durchgeführt werden. Wir untersuchten, wie das Degradom bei mehreren Arten durch unterschiedliche Störungen global verändert wurde. Zunächst untersuchten wir die genomweite Häufigkeit von 5'P-RNA-Molekülen (Extended Data Abb. 6a). Die 5′P-RNA-Verteilung über das B. subtilis-Chromosom war für alle getesteten RNase-Mutanten relativ stabil, wir beobachteten jedoch einen Anstieg der RNAs, die aus intragenen Regionen nach einem Hitzeschock stammten. In E. coli beobachteten wir Unterschiede zwischen Stämmen, wobei 5'P-RNA-Moleküle bevorzugt mit der kodierenden Region in DH5α und mit 5'-untranslatierten Regionen (UTRs) in MG1655 assoziiert waren, was mit den beobachteten Unterschieden in 5'P-RNA um kodierende Regionen übereinstimmt (Erweiterte Daten Abb. 2). Wir beobachteten auch einen Anstieg der 5'P-RNA aus intergenen Regionen in E. coli. Als nächstes untersuchten wir die Variation der 5'P-Abbauzwischenprodukte auf Einzelgenebene, ein Maß, das die Häufigkeit jeder reifen RNA mit der Wahrscheinlichkeit des Zerfalls integriert (Extended Data, Abb. 6 und Ergänzungstabelle 3). Wir quantifizierten die genspezifische Häufigkeit von 5'P-mRNA-Fragmenten in B. subtilis und zeigten, dass Hitzeschock die Abbauzwischenprodukte für Sporenkeimungsgene (FDR < 7,68 × 10–4), Salzstress und His-Biosynthese (FDR < 2,2 × 10) erhöhte –16). Stationäres Wachstum führte zu einer Abnahme der mit der Translation verbundenen 5′P-mRNA-Fragmente sowohl in B. subtilis als auch in L. plantarum (FDR < 2,2 × 10–16). In E. coli führte der Hitzeschock zu einem Rückgang der mit der Translation verbundenen Abbauzwischenprodukte (FDR < 2,2 × 10–16) und zu einem Anstieg der mit dem Glukosekatabolismus verbundenen Abbauprodukte (FDR < 0,016). Als nächstes untersuchten wir, wie spezifische RNasen in B. subtilis die Häufigkeit genspezifischer 5'P-mRNA-Degradomfragmente beeinflussen. In Übereinstimmung mit unserer Metagenanalyse trennte sich die rnjA-Deletion vom Wildtyp-Stamm und den rnjB- und rnY-Deletionsmutanten in einer PCA mit genspezifischer Häufigkeit von mRNA-Abbauzwischenprodukten (Erweiterte Daten, Abb. 6b und Ergänzungstabelle 4). Wir beobachteten auch eine Abnahme der mit der Translation verbundenen Abbauzwischenprodukte (FDR <2, 2 × 10–16) (Ergänzungstabelle 3). Die rnjB-Deletion führte zu einer Abnahme der Abbauzwischenprodukte, die mit dem Phosphoenolpyruvat-abhängigen Zucker-Phosphotransferase-System assoziiert sind (FDR < 2,2 × 10–16), und die rny-Deletion führte zu einer Abnahme der Abbauzwischenprodukte, die mit der Chemotaxis assoziiert sind (FDR < 2,2 × 10–16).

Um die regulatorischen Funktionen von RNasen zu charakterisieren, untersuchten wir die Auswirkung ihrer Erschöpfung auf die Häufigkeit regulatorischer RNAs und 5'-UTRs (Extended Data Abb. 6c, d und Ergänzungstabelle 4). Die Deletion von rnjA führte zu einem Anstieg der Histidyl-tRNA-Synthetase 5′ UTR (FDR < 8,86 × 10–7), des für Ser-tRNA-Ligase spezifischen T-Box-Riboschalters (FDR < 3,18 × 10–7) und der kleinen regulatorischen RNA roxS ( FDR <7,9 × 10–4) unter vielen anderen (Einzelheiten und andere RNasen finden Sie in den erweiterten Daten Abb. 6c, d und in der Ergänzungstabelle 4). Interessanterweise identifizierten wir zusätzlich zur Abdeckung in der kodierenden Region auch 5'P-Peaks, die die Transkriptionsstartstellen in B. subtilis und E. coli überlappen (Extended Data Abb. 6e, f).

Nachdem wir gezeigt hatten, dass 5PSeq die Ribosomendynamik in Bakterien abbildet, haben wir es als nächstes auf gemischte Proben angewendet. Obwohl menschliche Mikrobiome eine Rolle bei Gesundheit und Krankheit spielen36,37, ist unser Verständnis der posttranskriptionellen Regulation des Mikrobioms begrenzt. Ribosomenprofilierung, basierend auf Polyribosomenfraktionierung, gefolgt von In-vitro-Ribosomen-Footprinting und -Sequenzierung, wurde zur Kartierung der Ribosomenposition19 verwendet, ihre Anwendung auf das Mikrobiom ist jedoch technisch anspruchsvoll38 und durch die geringe Größe der Ribosomenschutzfragmente nach der In-vitro-RNA-Verdauung begrenzt (~23). –24 Nächte)17,39. Die Degradomsequenzierung bietet potenzielle Vorteile, darunter (1) längere, in vivo erzeugte Ribosomen-geschützte Fragmente, die die Auflösung eng verwandter Arten in einer Probe ermöglichen können (Extended Data Abb. 7a); (2) Einfachheit, ohne dass eine subzelluläre Fraktionierung erforderlich ist40; (3) anwendbar auf gelagerte RNA-Proben5,41; und (4) Bereitstellung von Informationen über die In-vivo-Ribosomenposition, codonspezifische Ribosomenstopps und Aminosäurebeschränkungen bei Arten, die RNase J enthalten, was schätzungsweise etwa 60 % der Bakterienarten ausmacht9.

Um die Anwendbarkeit von 5PSeq auf Bakteriengemeinschaften zu demonstrieren, analysierten wir zunächst 5′P-mRNA-Abbauzwischenprodukte in einer Mischung aus zwei eng verwandten Arten, L. reuteri und L. plantarum. Wir haben unterschiedliche Mengen an RNA aus MUP-behandeltem L. plantarum mit unbehandeltem L. reuteri gepoolt (1:1–1:10.000; Abb. 3a). MUP-assoziierte Ile-Ribosomenpausen können sogar im Verhältnis 1:10.000 (0,01 % Häufigkeit) nachgewiesen werden. Die Grenze wird durch die Sequenzierungstiefe bestimmt (d. h. im 1:10.000-Mix wurden nur 82 Lesevorgänge den kodierenden Sequenzen von L. plantarum zugeordnet). Nachdem wir unsere Fähigkeit bestätigt hatten, artspezifische Störungen zu erkennen, untersuchten wir als nächstes die Ribosomendynamik in definierten mikrobiellen Gemeinschaftsstandards (Extended Data, Abb. 7b). Anschließend untersuchten wir klinische und umweltbedingte Mikrobiomproben und untersuchten das Metadegradom vaginaler Mikrobiome anhand zuvor isolierter RNA-Proben42. Zusätzlich zur RNA-basierten Angabe der Artenhäufigkeit haben wir Abbauprofile für die meisten identifizierten Arten erhalten (Abb. 3b). Diese Daten ermöglichten die Untersuchung von In-vivo-Phänotypen des Ribosomenschutzes bei verschiedenen Arten und Patienten. Schließlich haben wir unsere Methode auf komplexere Mikrobiome angewendet (menschliches Fäkalienmikrobiom und Kompost; erweiterte Daten Abb. 7c, d).

a, Liniendiagramme, die die 5P|Seq-Metagenhäufigkeit in Bezug auf Ile-Codons für L. reuteri (hellblau) und L. plantarum (lila) zeigen, gemischt in unterschiedlichen Verhältnissen (1:1–1:10.000; L. plantarum versus L.reuteri). ). Die MUP-Behandlung von L. plantarum (unten) führte im Vergleich zur L. reuteri NT-Kontrolle zu deutlichen Ile-Pausen. L. plantarum und L. reuteri weisen eine Genomähnlichkeit von 63–80 % zwischen ihren kodierenden Regionen auf. b, 5PSeq-Analyse zuvor isolierter vaginaler Mikrobiome. Die Anzahl der jeder Art und jedem gesunden Spender zugeordneten Lesevorgänge ist durch Kreise gekennzeichnet. Relativer Frame-Schutz und FFT sowie das Vorhandensein/Fehlen ausgewählter RNasen, wie in Abb. 1.

Wir gingen davon aus, dass 5P-seq in der Lage sein könnte, artspezifische posttranskriptionelle Reaktionen auf medikamentöse Behandlungen unabhängig von Veränderungen in der mRNA-Häufigkeit zu erkennen. Wir analysierten das Metadegradom komplexer fäkaler Mikrobiomkulturen, die reich an Bacillota und Bacteroidota sind, als Reaktion auf Medikamente, die auf die Translation abzielen (Abb. 4 und erweiterte Daten, Abb. 8a). Wir verwendeten CAM, MUP, Doxycyclin (DOX, Hemmung der Translationsverlängerung) und Erythromycin (ERY, Störung der Aminoacyltranslokation). Zuerst konzentrierten wir uns auf Bacillota (enthaltend RNase J), ​​wo die Metadegradomsequenzierung eine höhere Auflösung liefert. Wie aus unseren früheren Analysen bei isolierten Arten zu erwarten war, führte die Verwendung von CAM und MUP zu kontextspezifischen Ständen bei Ile und Ala in Bacillota, wie etwa bei Enterococcus faecalis (Klasse Bacilli), Clostridium tyrobutiricum (Klasse Clostridia) und Anaeroglobus geminatus (Klasse). Negativicutes) (Abb. 4a,b). Für DOX beobachteten wir eine deutliche 5'P-RNA-Akkumulation – 11 nt vom Startcodon entfernt, was auf den Schutz von Ribosomen hinweist, die auf der Ebene der Initiation pausiert waren (Abb. 4c). Bei ERY beobachteten wir einen Ribosomen-Stillstand im Zusammenhang mit positiv geladenen Aminosäuren, einschließlich Lys (K) und Arg (R). Dies geschah insbesondere für die Motive (R/K) × (R/K) (Abb. 4d) und Pro (Extended Data Abb. 8b), in Übereinstimmung mit früheren Berichten 43, 44, 45, 46. Effekte wurden bereits 5 Minuten nach der Behandlung beobachtet, mit maximalen Effekten nach 30 Minuten (Abb. 4). Diese verzögerte Reaktion steht im Einklang mit einer langsameren Wachstumsrate der Stuhlkulturen und einer Verzögerung der translatorischen Reaktion. Interessanterweise hatte jedes Medikament unterschiedliche Auswirkungen auf die Bakterienarten in den Mischkulturen, was darauf hindeutet, dass der bakterienspezifische physiologische Zustand und die Kulturzusammensetzung die Fähigkeit von Zellen, auf Translationsstörungen zu reagieren, modulieren können: Beispielsweise reagierte Enterococcus faecium46 in unseren Experimenten nicht auf Medikamente (Erweiterte Daten Abb. 8c).

a–d, Liniendiagramme, die die 5PSeq-Metagenhäufigkeit in Bezug auf ausgewählte Merkmale zeigen. Der Abstand zu bestimmten Aminosäuren wird durch die Anzahl der Nukleotide angegeben. Beispielarten aus drei verschiedenen Klassen – E. faecalis (Bacilli), C. tyrothricin (Clostridia) und A. geminatus (Negativicutes) – aus dem Stamm Bacillota werden vorgestellt. a, Verteilung der 5'-Endpunkte relativ zu Ile-Codons in mit MUP behandelten Proben nach 5 und 30 Minuten im Vergleich zur NT-Kontrolle. b, Wie in a, jedoch für Ala-Codons nach CAM-Behandlung. c, Wie in a, jedoch für Startcodons nach DOX-Behandlung. d, Wie in a, jedoch für das erste Codon von Lys (K)- und Arg (R)-angereicherten Tripeptidmotiven der Form (R/K) × (R/K) in mit ERY behandelten Proben.

In unseren Mikrobiom-Experimenten haben wir auch Diversität in den Blockierungsmechanismen von Bacillota-Ribosomen identifiziert. Arten der Klassen Clostridia und Negativicutes – zum Beispiel C. tyrobutiricum und der opportunistische Erreger A. geminatus – haben eine zusätzliche Schutzsignatur 2 nt vor einem Ribosomenstillstand (Abb. 4). Dies trat bei allen getesteten Medikamenten auf und die betroffenen Ribosomen stagnierten entweder bei der Elongation oder bei der Initiierung. Darüber hinaus war es bei phylogenetisch verwandten Arten konserviert, was darauf hindeutet, dass blockierte Ribosomen in diesen Arten mit zusätzlichen Cofaktoren interagieren oder eine alternative Konformation aufweisen, die die Ribosomenschutzmuster in vivo verändert.

Schließlich testeten wir die Wirkung von Antibiotikabehandlungen auf das Metadegradomprofil von Bacteroidota- und Pseudomonadota-Arten, denen die 5′–3′-Exonukleaseaktivität fehlt. Obwohl wir keine Einzelnukleotidinformationen über das differenzielle Abwürgen von Ribosomen erwartet hatten, führten Antibiotikabehandlungen zu einer Akkumulation von 5'P-Stellen um das Startcodon, wie für CAM und ERY in Bacteroides uniformis und Bacteroides fragilis, für DOX in Bacteroides thetaiotaomicron und für beobachtet MUP und CAM in E. coli (Extended Data Abb. 8d). Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass die Metadegradomsequenzierung artspezifische Informationen zur posttranskriptionellen Regulation in komplexen Mikrobiomproben liefern kann.

Um die Bandbreite der Einsatzmöglichkeiten unserer Methode zu veranschaulichen, haben wir einen Atlas des mRNA-Zerfalls im bakteriellen Lebensbaum erstellt (Abb. 5). Wir analysierten 96 Arten in 58 Gattungen (Abb. 5 und Ergänzungstabellen 5–7) und stellten eine Übereinstimmung zwischen mRNA-Abbaumustern und taxonomischer Klassifizierung sowie das Vorhandensein einer 3-nt-Periodizität in den meisten Gattungen fest (Abb. 5, inneres Balkendiagramm in Rot). Gattungen, die RNase J enthalten, wie die in Bacillota (in grün), weisen eine klare 3-nt-Periodizität mit einer allgemeinen Präferenz für 5'P im Frame F1 auf (z. B. spp. Lactobacillus, Bacillus und Megasphaera). Andererseits weisen Bacteroidota, die stärker auf die endonukleolytische Spaltung angewiesen sind, mit Proteinen der RNase E- und G-Familie und RNase Y 5′P-Stellen auf, die häufig mit dem letzten Nukleotid des Codons (F2; Abb. 5, beige gefärbt) assoziiert sind , zum Beispiel Parabacteroides, Alistipes und Bacteroides. Viele Arten weisen komplexere Codon-assoziierte 5′P-Muster auf. Beispielsweise haben Ureaplasma (Mycoplasmatota) und Akkermansia (Verrucomicrobia) 5′P-Stellen in F1 und F2, während Caulobacter (Pseudomonadota) und Prevotella (Bacteroidota) mit F1 und F0 assoziiert sind. Es ist wichtig zu beachten, dass sowohl die 5′P-Präferenz als auch der Ribosomenschutz durch Umweltbedingungen oder medikamentöse Behandlungen19 sowie durch die Taxonomie beeinflusst werden können. Einige Arten, für die wir eine Deep-Sequencing-Abdeckung erstellt haben (Abb. 5, innerer grauer Kreis), wie z. B. E. coli (Vertreter der Klasse Gammaproteobacteria), zeigen keine klare Präferenz für 5'P in Bezug auf Codonpositionen. In Übereinstimmung mit unserer vorherigen Analyse der Sequenzpräferenz für 5'P-Stellen (Abb. 1c) stellen wir fest, dass Arten mit RNase J eine geringe 5'P-sequenzspezifische Präferenz aufweisen. Arten, die stärker von der endonukleolytischen Aktivität von RNase G abhängig sind, verbrauchen häufig –1 U/+1 A, während Arten, die von RNase Y abhängig sind, eine deutliche Anreicherung von +1 A aufweisen. Um das Zusammenspiel zwischen RNA-Abbaumaschinerie und Ribosomenposition weiter zu analysieren, haben wir untersucht Schutz blockierter Ribosomen an Ile-Codons nach MUP-Behandlung (äußerer violetter Kreis, Abb. 5). Wir konzentrierten uns auf Bacillota und beobachteten zusätzlich zur erwarteten Schutzgröße (d. h. 14 nt, wie in Abb. 2) Schutzmaßnahmen bei –16 nt in der Gattung Clostridia, was auf unterschiedliche Mechanismen als Reaktion auf blockierte Ribosomen bei phylogenetisch verwandten Arten hinweist. Diese Ergebnisse zeigen, dass die globale Untersuchung des In-vivo-mRNA-Abbaus in Kombination mit Translationsstörungen ein nützliches Instrument zur Entdeckung sowohl derzeit uncharakterisierter Mechanismen der Translationsregulation als auch der artspezifischen Reaktion auf Antibiotikabehandlungen ist.

Taxonomischer Baum der untersuchten Arten. Kreise, von innen nach außen, grau (Anzahl der zugewiesenen Lesevorgänge); Rot (Stärke der 3-nt-Periodizität), Rahmenpräferenz (F0, Beige; F1, Grün; F2, Hellblau); Identifizierung ausgewählter Enzyme, die am RNA-Abbau auf Gattungsebene RNJA, RNY und RNE/G beteiligt sind; Ribonukleasen aus der E/G-Proteinfamilie; Akkumulation von 5'P-Endpunkten 13–17 nt vor Ile-Codons nach 30-minütiger MUP-Behandlung; Spaltungsmotive 4 nt um 5'P-Endpunkte ausgewählter Arten (Bacillota wird ohne Spaltungspräferenz übersprungen (Abb. 1c)). Insgesamt waren 58 Gattungen in Proben aus kultivierten Bakterien und komplexen Umgebungen vorhanden, darunter Vaginalabstriche, Kot, Kotkulturen und Kompost. In komplexen Proben wurden Arten mit mindestens 1.000 Lesevorgängen in den kodierenden Regionen (300 im Fall von Kompost) berücksichtigt und die entsprechenden Gattungen analysiert (Methoden).

Um die Nutzung unserer Ressource zur Untersuchung des Zusammenspiels zwischen RNasen und des Übersetzungsprozesses zwischen Bakterien zu erleichtern, stellen wir eine interaktive, durchsuchbare Website zur weiteren Erkundung bereit (http://metadegradome.pelechanolab.com).

Wir untersuchten Zwischenprodukte des mRNA-Abbaus in isolierten Arten und komplexen Mikrobiomen mithilfe einer optimierten 5PSeq-Methode und stellten fest, dass der kotranslationale mRNA-Abbau bei Bakterien weit verbreitet ist. Bei Arten, die RNase J enthalten, lieferten 5'P-mRNA-Zerfallszwischenprodukte Ribosomenschutzinformationen mit Einzelnukleotidauflösung. Unser Ansatz ermöglicht die Untersuchung von Codon- und Gen-spezifischen Ribosomenstopps in vivo, ohne dass eine medikamentöse Behandlung, subzelluläre Fraktionierung oder ein In-vitro-RNA-Abbau erforderlich ist. Wir zeigen, dass optimiertes 5PSeq die durch die Umwelt ausgelöste Translationsregulation bei mehreren Arten sowohl auf codon- (Abb. 2) als auch auf genspezifischer Ebene (Ergänzungstabelle 3) erkennen kann. Bei Arten ohne 5'–3'-Exonukleaseaktivität führte eine Störung des Translationsprozesses zu Veränderungen der 5'P-Verteilung entlang der Gene. Dies deutet darauf hin, dass trotz des Fehlens einer 5'–3'-Exonuklease, die in der Lage ist, die Ribosomenposition mit Einzelnukleotidauflösung zu zeichnen, Änderungen in der Ribosomenposition bei diesen Arten auch das co-translationale mRNA-Degradom prägen. Wir nutzten kotranslationale Zerfallsprozesse in Bakterien, um zu zeigen, dass 5PSeq schnelle posttranskriptionelle Reaktionen (innerhalb von 5 Minuten) auf Störungen des Translationsprozesses durch medikamentöse Behandlung erkennen kann, unabhängig von Veränderungen in der mRNA-Häufigkeit. Da der co-translationale mRNA-Zerfall weit verbreitet, aber bei Bakterienarten unterschiedlich ist, kann eine 5PSeq-Signatur angewendet werden, um artspezifische posttranskriptionelle Reaktionen auf Störungen zu erfassen. Wir schlagen vor, dass die Anwendung unserer Methode möglicherweise die Untersuchung der Umwelt- oder chemischen Regulation der Translation ermöglicht, ohne dass eine Kultivierung oder subzelluläre Fraktionierung erforderlich ist. Mit unserer optimierten Methode zeigen wir, dass die Ribosomenposition entscheidend für die Gestaltung der Grenzen und der Häufigkeit bakterieller Degradome ist. Wir zeigen, dass Umweltveränderungen, die zu stressspezifischen Defekten in der tRNA-Biosynthese oder -Verarbeitung32 oder zu Veränderungen in der Aminosäureverfügbarkeit47 führen, das Degradom in Arten, die RNase J enthalten, auf vorhersehbare Weise verändern. Darüber hinaus legen unsere Arbeiten nahe, dass die Bakterien zusätzlich zur Kontrolle auch eine stringente Reaktion haben Transkription und Translation35,48, verändert auch das bakterielle Degradom. Wir zeigen auch, dass Ribosomenblockaden und damit verbundene kotranslationale Zerfallsmuster über Stressbedingungen hinweg stark reguliert werden und zur Untersuchung genspezifischer Veränderungen unabhängig von Änderungen in der mRNA-Häufigkeit verwendet werden können. Beispielsweise beobachteten wir deutliche Veränderungen in der genspezifischen 3-nt-Periodizität (FPI) für Gene, die mit der Translation und Sporenwandbildung in B. subtilis assoziiert sind (Extended Data Abb. 5). Durch die Analyse des Beitrags verschiedener RNasen zum Degradom in B. subtilis identifizierten wir auch die genspezifische Regulation regulatorischer 5'-UTRs und kleiner regulatorischer RNAs (Ergänzungstabelle 4) sowie deren Wechselwirkung mit bakteriellen Riboschaltern . Diese Informationen werden für die zukünftige Analyse regulatorischer Elemente in mRNA-Leadern nützlich sein und die molekulare Analyse ihres Wirkmechanismus erleichtern. Wichtig ist, dass die in diesem Manuskript durchgeführte Metadegradomanalyse direkt auf eine Vielzahl kultivierbarer und nicht kultivierbarer Arten anwendbar ist, bei denen die RNase-Häufigkeit leicht abgeleitet werden kann (Ergänzungstabelle 6) und so den Weg für die molekulare Zerlegung des RNA-Zerfalls in Nicht-Modellbakterien ebnet Spezies.

Schließlich zeigen wir, dass 5PSeq in großem Umfang auf komplexe klinische und umweltbedingte Mikrobiome angewendet werden kann, um artspezifische Metadegradomprofile zu erhalten. Durch den Wegfall der Notwendigkeit komplexer experimenteller Protokolle und der Bakterienkultivierung werden Forscher in der Lage sein, Ribosomenschutz-Phänotypen in nicht kultivierbaren Bakterienarten zu analysieren, die schätzungsweise mehr als die Hälfte der menschlichen Bakteriengemeinschaften ausmachen50. Unser Ansatz kann translatorische Reaktionen sogar bei Arten erkennen, die in einer Bakteriengemeinschaft in einer Häufigkeit von 0,01 % vorhanden sind, und ermöglicht durch die Verwendung der längeren Ribosomen-Zehenabdrücke die Analyse komplexer Bakteriengemeinschaften mit Auflösung einzelner Arten. Um seinen Nutzen und seine Fähigkeit zur Ergänzung aktueller metagenomischer Ansätze zu demonstrieren, charakterisieren wir die Ribosomendynamik in komplexen Stuhlkulturen nach einer Antibiotikabehandlung. Unsere Arbeit zeigt, dass 5PSeq schnelle posttranskriptionelle Reaktionen auf Antibiotika, die auf den Translationsprozess abzielen, leicht identifizieren kann. Dies bestätigt unsere Fähigkeit, codonspezifische Veränderungen in komplexen mikrobiellen Proben zu untersuchen und ebnet den Weg für die Verwendung von Degradomsignaturen als molekulare Reporter für artspezifische Reaktionen auf Medikamente. Wir bieten einen Atlas des bakteriellen mRNA-Abbaus für 96 Arten aus 58 Gattungen. Unsere Ergebnisse unterstreichen die Vielfalt der mRNA-Abbaumaschinerie bei Prokaryoten und zeigen den Nutzen der Kombination von Translationsstörung und dem 5′P-mRNA-Degradom. Wir gehen davon aus, dass die Untersuchung des Metadegradoms durch die Kombination der 5'P-RNA-Sequenzierung (Ergänzungstabelle 4) mit einer Messung der exprimierten RNasen (Ergänzungstabelle 7) in Zukunft die mechanistische Charakterisierung regulatorischer 5'-Leader in weniger gut charakterisierte Art.

Zusammenfassend zeigt unsere Analyse des mRNA-Abbaus im gesamten bakteriellen Lebensbaum, wie das Metadegradom wertvolle Informationen zur artspezifischen Physiologie liefert, einschließlich Reaktionen auf Medikamente, intrazelluläre Aminosäureverfügbarkeit und Umweltreaktionen. Metadegradomanalysen werden die Charakterisierung der posttranskriptionellen Regulation in Mikrobiomen ermöglichen und Aufschluss über die Biologie mikrobieller Gemeinschaften geben.

Bakterienkulturen über Nacht (nicht über der optischen Dichte 1 (OD600 = 1)) wurden verwendet, um die Hauptkultur auf eine Ausgangs-OD600 von 0,03–0,05 zu verdünnen. Sofern nicht anders angegeben, wurden die Kulturen durch Zentrifugation bei Erreichen der logarithmischen Phase (OD600 = 0,4–0,8) geerntet. Sofern nicht anders angegeben, wurden Bakterienkulturen bei 37 °C unter Rotation unter Verwendung der empfohlenen Wachstumsmedien gezüchtet. Insbesondere wurden L. plantarum (ATCC 8014) und L. reuteri (DSM 17938) in MRS-Brühe (Sigma-Aldrich) gezüchtet Plantarum-Stressbehandlungen wurden wie folgt durchgeführt: Kulturen in der stationären Phase wurden 27 Stunden nach der Inokulation gezüchtet und bei OD600 = ~4,5 geerntet. Um Proben für unbehandelte Kontrolle, Hitzeschock und nährstoffarme, biologische Replikatkulturen (40 ml) zu erzeugen. wurden bis zur mittleren logarithmischen Phase gezüchtet (OD600 = 0,3–0,6), geteilt (10 ml für unbehandelte Kontrolle, 15 ml für Hitzeschock und 15 ml für nährstoffarme Probe) und die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet. Unbehandelte Kontrollpellets wurden schockgefroren sofort zur RNA-Analyse. Vor dem Hitzeschock wurden die Zellen in vorgewärmter MRS-Brühe resuspendiert und in einem Thermomixer 15 Minuten lang bei 60 °C inkubiert. Nährstoffarme Zellpellets wurden gründlich mit 50 ml 0,5 × LB-Medium (Sigma) gewaschen, zentrifugiert und der Überstand vollständig entfernt. Die Zellen wurden dann in vorgewärmtem 0,5 × LB-Medium (Sigma) resuspendiert und nach einer Gesamtinkubationszeit von 15 Minuten bei 37 °C geerntet. Subtilis (168 trpC2) wurde in 2 × YT (1,6 % (Gew./Vol.) Trypton (Bacto) kultiviert. 1 % (Gew./Vol.) Hefeextrakt (Bacto) und 0,5 % (Gew./Vol.) NaCl. Für ein verlängertes Wachstum haben wir Proben in der Mitte des Protokolls, 24 Stunden, 48 Stunden und 8 Tage nach der Inokulation gesammelt. Salzstress wurde durch Mischen durchgeführt gleiche Volumina von 2 M NaCl mit B. subtilis (OD600 = 0,5–0,6) aus mittlerer log-Phase, gefolgt von 10-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur und Ernte durch Zentrifugation. Biologische Replikatkulturen von L. plantarum, L. reuteri, E. coli (Invitrogen, Nr. 18265-017) und B. amyloliquefaciens wurden in LB-Medium bis zur logarithmischen Phase gezüchtet, dann wurden die Kulturen geteilt, um Proben für unbehandelte Kontrolle und zufällig fragmentierte Kontrolle zu erzeugen. CAM wurde zur mittleren logarithmischen Phase hinzugefügt. gewachsene L. plantarum- und L. reuteri-Kulturen mit einer Endkonzentration von 100 µg ml–1, 5 Minuten lang bei 37 °C inkubiert und anschließend auf Eis mit weiteren 100 µg ml–1 CAM5 geerntet. Die MUP-Behandlung (Endkonzentration 65 µg ml–1) von L. plantarum und L. reuteri im mittleren Logarithmus wurde 10 Minuten lang bei 37 °C nach Zentrifugation und Schockgefrieren des Pellets durchgeführt. C. crescentus (Stamm NA1000) wurde in PYE-Medium mit 0,2 % (Gew./Vol.) Pepton (Bacto) und 0,1 % Hefeextrakt (Bacto) bei 30 °C bis zur mittleren logarithmischen Temperatur gezüchtet, gefolgt von Zentrifugation und Schockgefrieren Zellpellet. Der Synechocystis-Stamm PCC6083 wurde in BG11-Wachstumsmedium bei 30 °C bei einer Lichtintensität von 30 µE und 1 % atmosphärischem CO2 kultiviert und in der mittleren Log-Phase geerntet51. Hitzeschockbehandlungen für E. coli-, B. subtilis-Wildtyp- und RNase-Knockout-Stämme wurden wie folgt durchgeführt: Der Stamm E. coli (MG1655) wurde in LB-Medium bei 37 °C bis zur späten logarithmischen Phase (0,6–0,8) gezüchtet; Die Stämme B. subtilis Wildtyp (168trpC2), rnjA, rnjB und rny-Deletion41,52 wurden bei 37 °C in LB kultiviert (ergänzt mit 100 µg ml–1 Spectinomycin für rnjA und 5 µg ml–1 Kanamycin für rnjB und rny-Deletion). Stämme) zur Protokollierung der Wachstumsphase (0,2–0,3). Die Kultur wurde in zwei Teile geteilt, das Zellpellet durch Zentrifugation gesammelt und die unbehandelte Kontrollprobe sofort schockgefroren. Der Hitzeschock wurde durch Resuspendieren der Zellen in auf 65 °C vorgewärmtem LB-Medium und anschließende 10-minütige Inkubation bei 65 °C durchgeführt. Die Proben wurden durch Zentrifugation geerntet und zur RNA-Analyse in einem Ethanol-/Trockeneisbad schockgefroren.

Zur antibiotischen Behandlung von E. coli wurde der Stamm MG1655 in LB bei 37 °C bis zur Exponentialphase gezüchtet und die Kulturen zur Probenahme der unbehandelten Kontrolle MUP (65 µg ml–1) und CAM (100 µg ml–1) in drei Teile geteilt. Die Kulturen wurden 10 Minuten lang bei 37 °C mit Antibiotika inkubiert, durch Zentrifugation geerntet und zur RNA-Analyse in einem Ethanol/Trockeneisbad schockgefroren.

Zur Expression von RNase J in E. coli wurden die obersten zehn Zellen mit einem Plasmid transformiert, das die RNase JA-Kodierungssequenz aus S. pyogenes enthielt (Plasmid pEC622:pEC85 mit rnjA-Promotor + rnjA (exprimiert RNase J1 zur Komplementierung in S. pyogenes (pEC85). repliziert in E. coli), ein Geschenk von E. Charpentier. Die Stämme A. finegoldii (DSM 17242), P. copri (DSM 18205), P. merdae (DSM 19495) und P. timonesis (DSM 22865) wurden anaerob kultiviert in GAM-Brühe (HyServe) für 24 Stunden. Wo angegeben, wurden die Spezies entweder mit MUP (65 µg ml–1) oder CAM (100 µg ml–1) für 10 Minuten behandelt. Nach der Inkubation wurden 1-ml-Aliquots entnommen und die Zellen katalytisch behandelt durch Zugabe von RNAprotect Bacteria Reagent (Qiagen) inaktiviert und durch Zentrifugation geerntet.

Um die Auswirkungen von Medikamenten auf die Dynamik des Metadegradoms zu überwachen, haben wir zwei anaerob kultivierte menschliche Darmmikrobiome im Laufe der Zeit mit vier Medikamenten verglichen. Darmmikrobiome von gesunden Patienten wurden gesammelt und in 40 % Glycerin resuspendiert und 500-µl-Aliquots wurden bei –80 °C gelagert. Ein Aliquot wurde zum Beimpfen von 10 ml Starterkultur verwendet, die 24 Stunden lang in MCDA-Brühe gehalten wurde. 53 Minuten lang in Abwesenheit von Sauerstoff und in Gegenwart von 2,5–3,0 % Wasserstoff bei 37 °C. Um sicherzustellen, dass sich die mikrobielle Gemeinschaft in einer metabolisch aktiven Wachstumsphase befand, verdünnten wir die Starterkulturen 24 Stunden vor Beginn des Experiments mit frischem MCDA-Medium im Verhältnis 1:10 in einem Gesamtvolumen von 30 ml unter den oben angegebenen anaeroben Bedingungen aber ohne zu zittern. Zur Antibiotikabehandlung wurden 6 ml Stuhlkultur in ein 15-ml-Falcon-Röhrchen überführt, entweder ohne Antibiotika oder ergänzt mit CAM (80 µg ml–1), MUP (650 µg ml–1), DOX (5 µg ml–1). oder ERY (5 µg ml–1). Nach 5-minütiger, 30-minütiger oder 48-stündiger Inkubation wurden 1-ml-Aliquots entnommen und wachsende Zellen durch Zugabe von RNAprotect-Bakterienreagenz (Qiagen) katalytisch inaktiviert (t0 vor der Behandlung und 5 Minuten, 30 Minuten und 48 Stunden nach der Behandlung) und durch Zentrifugieren geerntet. Die Anzahl der Wiederholungen für jede Probe ist in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt.

Die Extraktion der RNA (sofern nicht anders angegeben) wurde wie in Lit. beschrieben durchgeführt. 54, mit geringfügigen Änderungen. Kurz gesagt, Zellpellets wurden in gleichen Volumina LET (25 mM Tris pH 8,0, 100 mM LiCl, 20 mM EDTA) und wassergesättigtem Phenol pH 6,6 (Thermo Fisher) resuspendiert. Die Zellen wurden mit säuregewaschenen Glasperlen (Sigma-Aldrich) durch 3-minütiges Vortexen im MultiMixer lysiert. Nach der Zugabe gleicher Volumina Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol pH 4,5 (25:24:1) und nukleasefreiem Wasser wurde die Lyse durch weitere 2 Minuten Vortexen und anschließende Zentrifugation verlängert. Die resultierende wässrige Phase wurde in zwei Schritten unter Verwendung von Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) und anschließend Chloroform gereinigt. Nach der Zentrifugation wurde die saubere wässrige Phase mit Natriumacetat-Ethanol ausgefällt. Für Lactobacillus-Mischungen (Abb. 3a) wurde aus L. plantarum (unbehandelte Kontrolle und MUP-behandelt) extrahierte mikrobielle RNA vor dem RNA-Ligationsschritt des 5P-seq-Bibliotheksprotokolls in unterschiedlichen Verhältnissen mit aus L. reuteri (unbehandelt) extrahierter RNA gemischt. . Technische Replikate des Microbial Community Standard (Zymobiomics, Nr. D6300, Chargen-Nr. ZRC 190633), bestehend aus acht deaktivierten Bakterienstämmen, wurden durch Extraktion von RNA aus 75–125 µl aufgetauter Zellsuspension erzeugt. Vaginalabstrichproben wurden mechanisch unter Verwendung von Perlen in 1.000 µl DNA/RNA-Shield (ZymoResearch) lysiert und das Lysat vor der Verwendung zwei Monate lang bei –80 °C gelagert. Das Lysat wurde aufgetaut und 250 µl zur Extraktion mikrobieller RNA verwendet. Der Kot eines gesunden Spenders wurde gesammelt und in 40 % Glycerin transportiert. Technische Replikate der RNA wurden am oben genannten Tag extrahiert, wobei geringfügige Änderungen wie folgt aufgeführt sind. Kurz gesagt, 500 µl Stuhl/Glycerin-Suspension wurden mit einem gleichen Volumen LET-Puffer gemischt, der SDS (25 mM Tris pH 8,0, 100 mM LiCl, 20 mM EDTA, 10 % SDS) und wassergesättigtes Phenol pH 6,6 (Thermo Fisher) enthielt ). Die Lyse wurde durch Vortexen mit Carbidkügelchen durchgeführt; Die Dauer wurde nach Zugabe gleicher Volumina Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol pH 4,5 (25:24:1) und nukleasefreiem Wasser auf 10 Minuten verlängert. Alle weiteren Schritte wurden wie oben beschrieben durchgeführt. RNA aus dem kultivierten Darmmikrobiom-Zeitverlaufsexperiment wurde wie angegeben extrahiert, mit Modifikationen am LET-Puffer, der SDS enthielt (25 mM Tris pH 8,0, 100 mM LiCl, 20 mM EDTA, 10 % SDS). Kompost-RNA wurde mit 2 g Ausgangsmaterial (von Sundbyberg, Schweden) unter Verwendung des RNeasy PowerSoil Total RNA Kit (Qiagen) extrahiert, wie in den Richtlinien des Herstellers empfohlen. Die RNA-Qualität wurde durch Laden von entweder 1 µg Gesamt-RNA auf 1,2 % Agarosegel oder 12 ng Gesamt-RNA auf einen BioAnalyzer unter Verwendung eines RNA Nano 6000-Chips (Agilent Technologies) beurteilt. Vor der 5P-seq-Bibliotheksvorbereitung wurde die RNA mit dem Qubit RNA BR (Broad-Range) Kit (Thermo Fisher Scientific) gemäß den Richtlinien des Herstellers quantifiziert.

Die Reinigung der DNA erfolgte durch Lyse von Zellen aus der Darmmikrobengemeinschaft mit Glasperlen (Sigma), kombiniert mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol-Extraktion und Ethanolpräzipitation. Das Arbeitsablaufprotokoll war identisch mit dem oben beschriebenen RNA-Extraktionsverfahren, jedoch mit der Substitution von LET (25 mM Tris pH 8,0, 100 mM LiCl, 20 mM EDTA, 10 % SDS) durch 10 mM Tris-HCl pH 8,0 und der Substitution von Phenol /Chloroform/Isoamylalkohol pH 4,5 mit UltraPure Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol pH 8,0 (Invitrogen)

Die Polyribosme-Fraktionierung wurde mit geringfügigen Änderungen wie zuvor beschrieben55 durchgeführt. Kurz gesagt, B. subtilis (168trpC2) wurde in LB-Medium bis zur mittleren logarithmischen Phase bei 37 °C kultiviert und auf Eis mit 100 µg ml–1 CAM mit 5-minütiger Zentrifugation geerntet. Das resultierende Pellet wurde in 1 × TN (50 mM Tris/HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 100 μg ml–1 CAM und eine vollständig EDTA-freie Proteaseinhibitortablette) unter Verwendung von Glasperlen unter Vortexen für 2 Minuten lysiert , gefolgt von 5-minütiger Inkubation auf Eis. Lyse und Inkubation wurden zweimal wiederholt. Zelltrümmer wurden durch 5-minütige Zentrifugation bei 1.500 g und 4 °C entfernt und der Überstand auf einen 15–50 %igen Saccharosegradienten mit einem 80 %igen Kissen geladen. Nach 90-minütiger Ultrazentrifugation bei 36.000 U/min wurde Abs254 überwacht und fraktioniert. Anschließend wurde RNA aus Saccharosefraktionen durch Zugabe gleicher Volumina Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol pH 4,5 (25:24:1) und nukleasefreiem Wasser extrahiert, gefolgt von 2-minütigem Vortexen und Zentrifugieren. Die wässrige Phase wurde durch Zugabe von Chloroform, Vortexen und Zentrifugieren weiter gereinigt und die resultierende wässrige Phase mit Natriumacetat/Ethanol ausgefällt.

Unsere 5P-seq-Bibliotheken wurden wie zuvor beschrieben5,41 mit geringfügigen Modifikationen hergestellt, wobei 150–9.000 ng Gesamt-RNA als Input verwendet wurden. Zur Herstellung zufällig fragmentierter Proben (Negativkontrollen) wurde ribosomale RNA von DNA-freier RNA abgereichert und anschließend durch Inkubation für 5 Minuten bei 80 °C in Fragmentierungspuffer (40 mM Tris-Acetat pH 8,1, 100 mM KOAc, 30 mM MgOAc) fragmentiert. . Die Reaktion wurde mit zwei Volumina RNACleanXP-Kügelchen (Beckman Coulter) gereinigt, wie vom Hersteller empfohlen. Freie 5'-OH-Stellen wurden mit 5 U T4-Polynukleotidkinase (NEB) rephosphoryliert und gemäß Herstellerempfehlung 60 Minuten bei 37 °C inkubiert. Rephosphorylierte fragmentierte RNA wurde unter Verwendung von Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (24:25:1) gereinigt, gefolgt von einer Natriumacetat/Ethanol-Fällung. Von diesem Schritt an wurden Verfahren für die zufällige fragmentierte und standardmäßige 5P-seq-Bibliotheksvorbereitung zusammengeführt41. RNA wurde entweder an das rP5_RND- oder rP5_RNA-Oligo (Ergänzungstabelle 1) ligiert, das eindeutige molekulare Identifikatoren enthielt. Ribosomale RNA wurde mit dem Ribozero rRNA Removal Kit (Illumina) abgereichert, das für Bakterien, Hefen und menschliche Proben geeignet ist. Die rRNA-abgereicherte Probe wurde unter Verwendung von 1,8 Volumina Ampure-Perlen (Abcam) gereinigt und durch Hitze (80 °C) 5 Minuten lang in 5-fachem Fragmentierungspuffer (200 mM Tris-Acetat pH 8,1, 500 mM KOAc, 150 mM MgOAc) fragmentiert. Nachfolgende Proben wurden unter Verwendung zufälliger Hexamere zum Priming revers transkribiert. Die resultierende komplementäre DNA wurde an Streptavidin-Kügelchen (M-280) gebunden und enzymatischen Reaktionen der DNA-Endreparatur und dem Auffüllen von Adenin in die 5'-überstehenden Enden von DNA-Fragmenten unter Verwendung von Klenow-Fragment (NEB) unterzogen. Der gemeinsame Adapter (P7-MPX) wurde ligiert und 5P-seq-Bibliotheken wurden durch PCR (15–17 Zyklen) amplifiziert, unter Verwendung von 1,8 Volumina Ampure-Perlen (Abcam) gereinigt und mit Qubit (Thermo Fisher) quantifiziert. Die Größe der Bibliothek wurde anhand von Bioanalysegerät-Spuren geschätzt. 5P-seq-Bibliotheken wurden durch Mischen gleicher Mengen jeder Probe gepoolt, gefolgt von der Anreicherung von 300–500-nt-Fragmenten.

Während der in diesem Manuskript beschriebenen Arbeit entwickelte unser Labor eine vereinfachte 5P-seq-Strategie mit hohem Durchsatz, die auf eine Teilmenge von Proben angewendet wurde, wie in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt. Mit dieser Strategie zusammengestellte Bibliotheken wurden wie kürzlich beschrieben generiert15,56. Kurz gesagt, DNA-freie RNA wurde mit RNA-Oligos ligiert, die einzigartige molekulare Identifikatoren enthielten. Die ligierte RNA wurde durch Priming mit Oligos, die ein zufälliges Hexamer und eine Illumina-kompatible Region enthielten, revers transkribiert. RNA wurde durch Zugabe von NaOH eliminiert. Ribosomale RNA wurde durch Zugabe interner rRNA-DNA-Oligo-Depletionsmischungen (Ergänzungstabelle 1) zur cDNA und Durchführung einer Behandlung mit duplexspezifischer Nuklease (DSN, Evrogen) abgereichert. rRNA-abgereicherte cDNA wurde PCR-amplifiziert (15–17 Zyklen). Die Abreicherung der rRNA mit Ribozero Illumina (für Bakterien und Hefen) erfolgte nach dem Schritt der einzelsträngigen RNA-Ligation. Ribosomal-abgereicherte RNA wurde gereinigt und unter Verwendung der oben genannten Oligos revers transkribiert und anschließend durch PCR amplifiziert. Die Bibliotheken wurden durch Fluoreszenz (Qubit, Thermo Fisher) quantifiziert, ihre Größe mit einem Agilent Bioanalyser geschätzt und entweder mit einem NextSeq500- oder NextSeq2000 Illumina-Sequenzer sequenziert.

DNA-Bibliotheken wurden aus Zeitpunkten unbehandelter (t0) und 48 Stunden (t48h) behandelter Stuhlkulturen gemäß den Richtlinien des Herstellers (ThruPlex DNA-Seq Kit, Takara Bio) erstellt. Kurz gesagt, die DNA wurde mit einem fokussierten Ultraschallgerät ME220 (Covaris) auf eine durchschnittliche Größe von 350 nt (Mikroröhrchen AFA Fiber Crimp-Cap, PN 520053) geschert. Gescherte DNA (30 ng) wurde verwendet, um eine DNA-Endreparaturreaktion durchzuführen, gefolgt von Bibliothekssynthese und PCR-Amplifikation (zehn Zyklen) mit den Primern NEBi5 und PE2. DNA-Bibliotheken wurden mit Ampure XP gereinigt, durch Fluoreszenz (Qubit, Thermo Fisher) quantifiziert und mit einem NextSeq2000 Illumina-Sequenzer sequenziert.

Die Demultiplexierung und Fastq-Generierung von Sequenzierungs-BCL-Bilddateien wurde mit bcl2fastq (v.2) mit Standardoptionen durchgeführt. Adapter- und Qualitätskürzung wurde mit dem bbduk-Programm der BBTools-Suite (https://sourceforge.net/projects/bbmap/) mit Optionen (qtrim=r, ktrim=r, hdist=3, hdist2 = 2, K =) durchgeführt 20, mink=14, trimq=16, minlen=30, maq=16), unter Verwendung des BBTools-Standardadaptersatzes und PolyG- oder PolyA-Sequenzen für kurze Lesevorgänge. Um die Rechenzeit zu reduzieren, wurden Lesevorgänge mit identischem Unique Molecular Identifier (UMI) und Insert-Sequenz vor dem Mapping mithilfe des Deduplizierungsprogramms der BBTools-Suite mit Standardparametern dedupliziert. UMI-Sequenzen, die in den ersten acht Basen jedes Lesevorgangs gefunden wurden, wurden mit UMI-tools (v.1) mit Standardoptionen (unter Verwendung von --bc-pattern NNNNNNNN) extrahiert.

Bakteriengenome wurden am 21. März 2019 aus der Datenbank des National Center for Biotechnology Information Assembly (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/) mit den folgenden Suchbegriffen heruntergeladen: „bacteria“[Filter] AND (aktuell). [Filter] UND („repräsentatives Genom“[Filter] ODER „Referenzgenom“[Filter]) UND (alle[Filter] NICHT „abgeleitet vom Überwachungsprojekt“[Filter] UND alle[Filter] NICHT anomal[Filter])). Die Liste wurde weiter gefiltert, um nur einen Stamm pro Art aufzunehmen, wobei den als „Referenz“ gekennzeichneten Genomen Vorrang eingeräumt wurde. Die resultierenden 5.804 Genome (Ergänzungstabelle 4) wurden zur Erstellung des Referenzindex verwendet. Der Index wurde mit dem bbmap-Programm der BBTools-Suite mit Standardoptionen (und k = 10) erstellt. Neben dem Referenzindex, der die 5.804 Bakteriengenome enthält, wurden separate Indizes für einzeln kultivierte Arten und Gruppen auf Gattungsebene erstellt. Die Genome für die letztgenannten Gruppen wurden aus dem anfänglichen Satz von 5.804 Genomen ausgewählt. Der Abgleich erfolgte mit dem bbmap-Programm der BBTools-Suite mit den Parametern (32 bit=t -da -eoom k = 11 strictmaxindel=10 intronlen=0 t = 16 trd=t minid=0.94 nzo=t). Ausrichtungsdateien wurden mit SAMtools57 sortiert und indiziert. Die auf UMIs basierende Deduplizierung wurde dann mit UMI-tools (v.1)58 mit den Optionen (--soft-clip-threshold 1 --edit-distance 2 --method unique) durchgeführt. Die BAM-Dateien wurden dann verarbeitet, um die Anzahl der Lesevorgänge pro Art aufzuzählen. Wir verwendeten ein vorab gespeichertes Wörterbuch mit Chromosomen- und Artennamen sowie ein benutzerdefiniertes Skript, um die Zählungen für jede Art durchzuführen. Die Verteilung der Zählungen zwischen Genen, die für rRNA, tRNA, mRNA und andere RNA-Typen kodieren, wurde mit Bedtools berechnet (https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/). Zählungen an mRNA-kodierenden Genen wurden verwendet, um die Top-Arten in komplexen Proben auszuwählen, wie unten beschrieben.

Einzelne kultivierte Arten wurden direkt ihren Referenzindizes zugeordnet. Alle Zymobiomics-Mischungen sowie vaginale, fäkale und Kompost-Mikrobiomproben wurden auf den bakteriellen Referenzindex abgestimmt, der die 5.804 Arten umfasste. Wir haben in allen Proben Arten mit mindestens 1.000 Lesevorgängen in den kodierenden Regionen ausgewählt, mit Ausnahme von Kompost, wo wir die Auswahl auf 300 Lesevorgänge gelockert haben, da es weniger Arten mit hohen Zählungen gab. Insgesamt wurden aus allen Proben 83 Bakterienarten mit spezifizierter Abdeckung identifiziert, die zu 46 Gattungen gehören. Für diese 46 Gattungen wurden Referenzindizes erstellt (Arten wurden aus der vorab ausgewählten Liste von 5.804 ausgewählt) und alle komplexen Kot- und Kompostproben wurden separat mit diesen Referenzen abgeglichen.

Deduplizierte Alignment-Dateien sowie Genomsequenz- und Annotationsdateien wurden als Eingabe für unser kürzlich entwickeltes fivepseq-Paket14 zur Analyse und Visualisierung der 5'-Endpunktverteilung von Lesevorgängen mit angewendeten Standardoptionen bereitgestellt. Fivepseq liefert Informationen über das Vorhandensein einer 3-nt-Periodizität (FFT), die Verteilung der 5'-Zählungen relativ zu CDS-Start/Stopp oder zu Nukleotiden innerhalb jedes Codons (Translationsrahmen) sowie Codon- und Aminosäure-spezifische Schutzmuster. Da fivepseq pro Lauf nur ein Genom analysiert, wurden Alignment-Dateien für komplexe Proben für jedes Genom einzeln als Eingabe für fivepseq verwendet. Für die Analyse auf Gattungsebene wurden Sequenz- und Anmerkungsdateien für einzelne Arten zu einer einzigen verkettet. Schließlich haben wir unter http://metadegradome.pelechanolab.com eine Online-Ressource mit interaktiver Durchsuchung von Berichten zusammengestellt, die aus unbehandelten Bakterien mit hoher Abdeckung erstellt wurden.

Um einen Ribosomenschutz-Phänotyp zu generieren, nahmen wir die Summe der Zählungen, die 30 bis 1 nt vor jeder Aminosäure positioniert waren, und verketteten pro Aminosäure skalierte Zählungen, um einen Vektor zu erhalten, der den Ribosomenschutz in jeder Probe beschreibt. Diese Vektoren wurden als Eingabe für PCA verwendet, das mit der prcomp-Funktion des R-Pakets stats (v.3.6.1) durchgeführt wurde. PCA-Diagramme wurden mit dem Autoplotly-Paket (v.0.1.2) in R erstellt.

Bacillus subtilis-Annotationen für Transkriptionsstartstellen (TSS) und UTRs wurden von BSGatlas59 erhalten. E. coli-Anmerkungen für TSS und UTRs wurden von RegulonDB60 erhalten. 5'P-Reads wurden einem bestimmten TSS zugeordnet, wenn sie mit diesem TSS innerhalb eines Fensters von ±5 Basenpaaren überlappten. Für die Leseverteilung (Extended Data Abb. 6a) und Heatmaps (Extended Data Abb. 6e, f) wurden Replikate gepoolt und entweder rohe oder bibliotheksgrößennormalisierte Lesezahlen über Replikate gemittelt. Die strangspezifische Abdeckung von 5'P-Lesevorgängen wurde mit deepTools (v.3.3.2)61 berechnet und als Heatmaps dargestellt. Zur differenziellen Analyse von 5′P-Reads in verschiedenen Gen-Annotationsmerkmalen wurden die in jedem Gen-Annotationsmerkmal mithilfe von featureCounts aus dem R-Paket Rsubread (v.2.6.4)62,63 gezählt. Differentialanalysen wurden mit edgeR (v.3.34.1)63 durchgeführt.

Die 5'P-Spaltungsmotive wurden aus der Sequenzzusammensetzung der Transkripte berechnet, wobei die Nukleotide der Region 4 stromaufwärts und stromabwärts der 5'-Kartierungspositionen aller Lesevorgänge einbezogen wurden. Wenn mehrere Lesevorgänge derselben Position zugeordnet wurden, haben wir die Basiszusammensetzung dieser Region mehrmals berücksichtigt. Unter Verwendung der erhaltenen Basisfrequenzen haben wir dann mit dem R-Paket ggseqlogo64 Sequenzlogos erstellt und dabei die Shannon-Entropie (Bits) verwendet, um den Beitrag jedes Nukleotids an jeder Position zu berechnen.

Taxonomische Bäume wurden mit dem Graphlan-Tool (v.0.9.7) (https://huttenhower.sph.harvard.edu/graphlan) erstellt. Taxonomische Abstammungsinformationen für alle 84 in unseren Proben identifizierten Bakterienarten wurden mit dem Efetch-Programm von NCBI E-Utilities aus der NCBI-Taxonomiedatenbank heruntergeladen. Die Bäume wurden mit Informationen zur Bibliotheksgröße, der 3-nt-Periodizität, dem bevorzugten Ribosomenschutzrahmen und dem Vorhandensein von Enzymanmerkungen für jede Gattung versehen (Ergänzungsdaten 1). Die Bibliotheksgröße entsprach der maximalen Anzahl von mRNA-Reads pro Art und Probe im Bereich von 0–1 (≥ 1 Million) Reads. Die 3-nt-Periodizität wurde unter Berücksichtigung des Absolutwerts des FFT-Signals für die 3-nt-Periodizitätswelle und der Präferenz für den Ribosomenschutzrahmen berechnet, wie durch das fivepseq-Paket berechnet. Für die FFT wurde die maximale Anzahl von Signalen für Transkripte verwendet, die entweder am Anfang oder am Ende ausgerichtet waren. Die Präferenz für den Ribosomenschutzrahmen wurde anhand des FPI-Werts bewertet, der vom fivepseq-Paket als 2 × F/(∑1F1 − Fi) für jeden Rahmen Fi berechnet wurde. Der Rahmen mit dem maximalen absoluten FPI-Wert wurde als (falsch) bevorzugt angesehen, und die Signifikanz dieser Präferenz wurde anhand der T-Test-P-Werte bewertet, indem die Zählungen im gegebenen Rahmen mit den beiden anderen kombiniert verglichen wurden (FPI- und P-Werte finden sich in der (Frame_stats.txt-Datei der fivepseq-Ausgabe). Ein positiver FPI-Wert bedeutet, dass eines der Nukleotide in jedem Codon im Durchschnitt eine höhere Anzahl aufweist (wird bevorzugt), während ein negativer Wert bedeutet, dass eines der Nukleotide im Durchschnitt eine niedrige Anzahl aufweist (wird fälschlicherweise bevorzugt) und die anderen beiden Nukleotide eine höhere Anzahl erhalten: Wenn beispielsweise F1 bevorzugt wird, hat es einen positiven FPI-Wert und wird im Baum als einzelner bevorzugter Schutzrahmen hervorgehoben, während, wenn beispielsweise F2 (falsch) bevorzugt wird (einen negativen FPI-Wert hat), der Baum hervorgehoben wird F0 und F1 als bevorzugte Frames. Sowohl die FFT- als auch die FPI-Werte lagen im Bereich von 0–1, und das Maximum der beiden Werte wurde verwendet, um die Stärke der 3-nt-Periodizität zu beschreiben. Enzymanmerkungen wurden aus der EggNOG-Datenbank (v.5.0)65 erhalten. Das Vorhandensein jedes Enzyms in jeder Gattung wurde als Zahl zwischen 0 und 1 gezählt, abhängig vom Anteil der Arten innerhalb der Gattung, die mit dem Enzym annotiert wurden. Der Baum hebt diese Werte mit entsprechender Deckkraft hervor.

Die Funktionsanalyse wurde an Listen von Genen mit unterschiedlicher Häufigkeit oder unterschiedlichem Rahmenschutz zwischen Stress- und Kontrollbedingungen durchgeführt. Der FPI für jedes Transkript wurde wie oben beschrieben berechnet. Die fache Änderung der FPIs wurde als Differenz des mittleren FPI zwischen dem Stress-/Mutantenzustand und der unbehandelten/Wildtyp-Kontrolle für jedes Transkript berechnet. Die unterschiedliche Häufigkeit der 5'-Endpunktzahlen für jedes Transkript wurde als Ausdruck log2 (Fold Change) mit dem DESeq2 R-Paket66 unter Verwendung der adaptiven Student-t-Test-Prior-Schrumpfungsschätzung (apeglm) berechnet.

Die Gen-Set-Anreicherungsanalyse wurde mit dem R-Paket WebGestaltR67 basierend entweder auf der Fold-Change-Differentialexpression oder auf FPI-Werten durchgeführt. GMT-formatierte Dateien für jede Art wurden durch Modifikation der Uniprot-Proteinanmerkungen erhalten und als Anreicherungsdatenbanken verwendet. Annotations-GFF-Dateien für jede Art wurden als Grundlage für die Erstellung der Referenzgenlisten verwendet. Die Signifikanz der P-Werte wurde mit einem hypergeometrischen Test berechnet und FDR zur Korrektur mehrerer Tests verwendet.

Die Sammlung und Verarbeitung sequenzierter Vaginalproben wurde vom Regional Ethical Review Board in Stockholm genehmigt (Nr. 2017/725-31). Das Prüfungsgremium verzichtete auf eine ethische Genehmigung für Stuhlproben und -kulturen, da nur anonymisierte Proben von gesunden Spendern verwendet wurden und keine Proben in einer Biobank gelagert wurden. Vor der Probenentnahme wurde von allen Spendern eine Einverständniserklärung eingeholt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Sequenzierungsdaten sind bei GEO unter der Zugangsnummer hinterlegt. GSE153497. Alle in dieser Studie generierten Ausgabedateien von fivepseq werden im SciLifeLab Data Repository abgelegt: https://doi.org/10.17044/scilifelab.22284709. Abdeckungsspuren für Vaginalproben sind unter https://doi.org/10.17044/scilifelab.22305991 hinterlegt. Quelldaten sind in Figshare unter https://doi.org/10.17044/scilifelab.22305955 hinterlegt.

Die Code-Veröffentlichung für das Programm fivepseq v.1.2.0 ist unter https://github.com/lilit-nersisyan/fünfpseq/releases/tag/v1.2.0 verfügbar. Die restlichen Skripte und Quelldatendateien, die zur Generierung der Zahlen verwendet wurden, sind bei GitHub unter https://github.com/lilit-nersisyan/Atlas-of-mRNA-translation-and-decay-for-bacteria/, Version v.1.0, hinterlegt (https://doi.org/10.17044/scilifelab.22305955).

Morris, C., Cluet, D. & Ricci, EP Ribosomendynamik und mRNA-Umsatz, eine komplexe Beziehung unter ständiger zellulärer Beobachtung. Wiley Interdisziplinär. Rev. RNA 12, e1658 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Presnyak, V. et al. Die Codon-Optimalität ist ein wichtiger Faktor für die mRNA-Stabilität. Zelle 160, 1111–1124 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Boël, G. et al. Der Einfluss des Codons auf die Proteinexpression in E. coli korreliert mit den mRNA-Spiegeln. Natur 529, 358–363 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Huch, S. & Nissan, T. Zusammenhänge zwischen Translation und allgemeinem mRNA-Abbau in Hefe. Wiley Interdisziplinär. Rev. RNA 5, 747–763 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pelechano, V., Wei, W. & Steinmetz, LM Der weit verbreitete co-translationale RNA-Zerfall enthüllt die Ribosomendynamik. Zelle 161, 1400–1412 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tesina, P. et al. Struktur des 80S-Ribosom-Xrn1-Nukleasekomplexes. Nat. Struktur. Mol. Biol. 26, 275–280 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

McLaren, RS, Newbury, SF, Dance, GSC, Causton, HC & Higgins, CF mRNA-Abbau durch prozessive 3'-5'-Exoribonukleasen in vitro und die Auswirkungen auf den prokaryotischen mRNA-Zerfall in vivo. J. Mol. Biol. 221, 81–95 (1991).

CAS PubMed Google Scholar

Condon, C. & Bechhofer, DH regulierten die RNA-Stabilität bei Gram-Positiven. Curr. Meinung. Mikrobiol. 14, 148–154 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tejada-Arranz, A., de Crécy-Lagard, V. & de Reuse, H. Bakterielle RNA-Degradosomen: molekulare Maschinen unter strenger Kontrolle. Trends Biochem. Wissenschaft. 45, 42–57 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Deutscher, MP Abbau von RNA in Bakterien: Vergleich von mRNA und stabiler RNA. Nukleinsäuren Res. 34, 659–666 (2006).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mathy, N. et al. 5'-zu-3'-Exoribonuklease-Aktivität in Bakterien: Rolle von RNase J1 bei der rRNA-Reifung und 5'-Stabilität von mRNA. Zelle 129, 681–692 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Saito, K. et al. Ribosomenkollisionen induzieren die mRNA-Spaltung und Ribosomenrettung in Bakterien. Natur 603, 503–508 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pelechano, V., Wei, W. & Steinmetz, LM Genomweite Quantifizierung von 5'-phosphorylierten mRNA-Abbauzwischenprodukten zur Analyse der Ribosomendynamik. Nat. Protokoll. 11, 359–376 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nersisyan, L., Ropat, M. & Pelechano, V. Verbesserte rechnerische Analyse der Ribosomendynamik aus 5'P-Degradomdaten mit fivepseq. NAR-Genom. Bioinform. 2, lqaa099 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, Y. & Pelechano, V. Hochdurchsatz-5′P-Sequenzierung ermöglicht die Untersuchung von abbauassoziierten Ribosomenblockaden. Cell Rep. Methods 1, 100001 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tesina, P. Struktur des 80S-Ribosom-Xrn1-Nukleasekomplexes. Nat. Struktur. Mol. Biol. 26, 275–280 (2019).

Mohammad, F., Green, R. & Buskirk, AR Eine systematisch überarbeitete Ribosomen-Profiling-Methode für Bakterien zeigt Pausen bei der Einzelcodon-Auflösung. eLife 8, 42591 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Lareau, LF, Hite, DH, Hogan, GJ & Brown, PO. Bestimmte Stadien des Translationsverlängerungszyklus, die durch Sequenzierung Ribosomen-geschützter mRNA-Fragmente aufgedeckt wurden. eLife 3, e01257 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Ingolia, NT, Ghaemmaghami, S., Newman, JRS & Weissman, JS Genomweite In-vivo-Analyse der Translation mit Nukleotidauflösung unter Verwendung von Ribosomenprofilierung. Wissenschaft 324, 218–223 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kaberdin, VR, Singh, D. & Lin-Chao, S. Zusammensetzung und Erhaltung der mRNA-abbauenden Maschinerie in Bakterien. J. Biomed. Wissenschaft. 18, 23 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kaberdin, VR Untersuchung der Substratspezifität von Escherichia coli RNase E mit einem neuartigen Oligonukleotid-basierten Assay. Nukleinsäuren Res. 31, 4710–4716 (2003).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gill, EE et al. Hochdurchsatznachweis der RNA-Verarbeitung in Bakterien. BMC Genomics 19, 223 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Khemici, V., Prados, J., Linder, P. & Redder, P. Die den Zerfall auslösende endoribonukleolytische Spaltung durch RNase Y wird durch Sequenzpräferenz und subzelluläre Lokalisierung streng kontrolliert. PLoS Genet. 11, e1005577 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Broglia, L. et al. Ein RNA-seq-basierter Vergleichsansatz enthüllt das transkriptomweite Zusammenspiel zwischen 3′-zu-5′-ExoRNasen und RNase Y. Nat. Komm. 11, 1587 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cavaiuolo, M., Chagneau, C., Laalami, S. & Putzer, H. Einfluss von RNase E und RNase J auf den globalen mRNA-Metabolismus im Cyanobacterium Synechocystis PCC6803. Vorderseite. Mikrobiol. 11, 1055 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Lehnik-Habrink, M. et al. RNA-Prozessierung in Bacillus subtilis: Identifizierung von Zielen der essentiellen RNase Y. Mol. Mikrobiol. 81, 1459–1473 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Shahbabian, K., Jamalli, A., Zig, L. & Putzer, H. RNase Y, eine neuartige Endoribonuklease, initiiert den Riboswitch-Umsatz in Bacillus subtilis. EMBO J. 28, 3523–3533 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bloom, SM et al. Die Cysteinabhängigkeit von Lactobacillus iners ist ein potenzielles therapeutisches Ziel für die Modulation der vaginalen Mikrobiota. Nat. Mikrobiol. 7, 434–450.

Glaasker, E., Konings, WN & Poolman, B. Glycin-Betain-Flüsse in Lactobacillus plantarum während Osmostase und hyper- und hypoosmotischem Schock. J. Biol. Chem. 271, 10060–10065 (1996).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Choi, J. et al. Dynamik des kontextspezifischen Translationsstopps durch Chloramphenicol und Linezolid. Nat. Chem. Biol. 16, 310–317 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Svetlov, MS et al. Kontextspezifische Wirkung von Makrolid-Antibiotika auf das eukaryotische Ribosom. Nat. Komm. 12, 2803 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huh, D. et al. Eine stressinduzierte Tyrosin-tRNA-Depletionsreaktion vermittelt eine Codon-basierte Translationsrepression und Wachstumsunterdrückung. EMBO J. 40, e106696 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Trinquier, A. et al. tRNA-Reifungsdefekte führen zur Hemmung der rRNA-Prozessierung über die Synthese von pppGpp. Mol. Zelle 74, 1227–1238 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hoffmann, T. et al. Osmotische Kontrolle der opuA-Expression in Bacillus subtilis und ihre Modulation als Reaktion auf intrazelluläre Glycin-Betain- und Prolin-Pools. J. Bakteriol. 195, 510–522 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Parker, DJ et al. Wachstumsoptimierte Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Spiegel verhindern eine maximale tRNA-Aufladung. Zellsystem 11, 121–130 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Integrativ, HMP Das Integrative Human Microbiome Project: dynamische Analyse von Mikrobiom-Wirt-Omics-Profilen in Zeiten menschlicher Gesundheit und Krankheit. Cell Host Microbe 16, 276–289 (2014).

Proctor, LM et al. Das Integrative Human Microbiome Project. Natur 569, 641–648 (2019).

Artikel Google Scholar

Fremin, BJ, Sberro, H. & Bhatt, AS MetaRibo-Seq misst die Translation in Mikrobiomen. Nat. Komm. 11, 3268 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, GW, Burkhardt, D., Gross, C. & Weissman, JS Die Quantifizierung der absoluten Proteinsyntheseraten enthüllt Prinzipien, die der Allokation zellulärer Ressourcen zugrunde liegen. Zelle 157, 624–635 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, Y. & Pelechano, V. Anwendung der Hochdurchsatz-5'P-Sequenzierung zur Untersuchung des co-translationalen mRNA-Zerfalls. STAR-Protokoll. 2, 100447 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pelechano, V., Wei, W. & Steinmetz, LM Genomweite Quantifizierung von 5′-phosphorylierten mRNA-Abbauzwischenprodukten zur Analyse der Ribosomendynamik. Nat. Protokoll. 11, 359–376 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ährlund-Richter, A. et al. Veränderungen in der Prävalenz des zervikalen humanen Papillomavirus (HPV) in einer Jugendklinik in Stockholm, Schweden, ein Jahrzehnt nach der Einführung des HPV-Impfstoffs. Vorderseite. Zellinfektion. Mikrobiol. 9, 59 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Kannan, K. et al. Die allgemeine Art der Translationshemmung durch Makrolid-Antibiotika. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 111, 15958–15963 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Davis, AR, Gohara, DW & Yap, MNF Sequenzselektivität der Makrolid-induzierten Translationsabschwächung. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 111, 15379–15384 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Arenz, S. & Wilson, DN Bakterielle Proteinsynthese als Ziel für die Antibiotikahemmung. Kalter Frühling Harb. Perspektive. Med. 6, a025361 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhou, Antimikrob. Widerstehen. Infizieren. Kontrolle 9, 130 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Subramaniam, AR et al. Ein Serinsensor für Mehrzelligkeit in einem Bakterium. eLife 2, e01501 (2013).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Schäfer, H. et al. Die Alarmone (p)ppGpp sind Teil der Hitzeschockreaktion von Bacillus subtilis. PLoS Genet. 16, e1008275 (2020).

Serganov, A. & Nudler, E. Ein Jahrzehnt der Riboschalter. Zelle 152, 17–24 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vartoukian, SR Kultivierungsstrategien für das Wachstum unkultivierter Bakterien. J. Oral Biosci. 58, 143–149 (2016).

Artikel Google Scholar

Jahn, M. et al. Das Wachstum von Cyanobakterien wird durch die Fülle an Licht- und Kohlenstoffassimilationsproteinen eingeschränkt. Cell Rep. 25, 478–486 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Figaro, S. et al. Bacillus subtilis-Mutanten mit Knockouts der Gene, die für die Ribonukleasen RNase Y und RNase J1 kodieren, sind lebensfähig, weisen jedoch erhebliche Mängel in der Zellmorphologie, Sporulation und Kompetenz auf. J. Bakteriol. 195, 2340–2348 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Domingo, MC, Huletsky, A., Giroux, R., Picard, FJ & Bergeron, MG vanD- und vanG-ähnliche Gencluster in einer Ruminococcus-Art, die aus der menschlichen Darmflora isoliert wurde. Antimikrob. Agenten Chemother. 51, 4111–4117 (2007).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Caponigro, G., Muhlrad, D. & Parker, R. Ein kleiner Abschnitt des MAT-Alpha-1-Transkripts fördert den mRNA-Zerfall in Saccharomyces cerevisiae: eine stimulierende Rolle für seltene Codons. Mol. Zelle. Biol. 13, 5141–5148 (1993).

Huch, S., Gommlich, J., Muppavarapu, M., Beckham, C. & Nissan, T. Die Membranassoziation von mRNA-Entkappungsfaktoren ist in aufkeimenden Hefen unabhängig von Stress. Wissenschaft. Rep. 6, 25477 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, Y. & Pelechano, V. Anwendung der Hochdurchsatz-5'P-Sequenzierung zur Untersuchung des co-translationalen mRNA-Zerfalls. STAR-Protokoll. 2, 100447 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, H. et al. Das Sequence Alignment/Map-Format und SAMtools. Bioinformatik 25, 2078–2079 (2009).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Smith, T., Heger, A. & Sudbery, I. UMI-Tools: Modellierung von Sequenzierungsfehlern in Unique Molecular Identifiers zur Verbesserung der Quantifizierungsgenauigkeit. Genomres. 27, 491–499 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Geissler, AS et al. BSGatlas: ein einheitlicher Atlas zur Annotation des Genoms und Transkriptoms von Bacillus subtilis mit verbessertem Informationszugriff. Mikrob. Genom. 7, 000524. (2021).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Santos-Zavaleta, A. et al. RegulonDB v 10.5: Herausforderungen angehen, um klassisches und Hochdurchsatz-Wissen über die Genregulation in E. coli K-12 zu vereinheitlichen. Nukleinsäuren Res. 47, D212–D220 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ramírez, F. et al. deepTools2: ein Webserver der nächsten Generation für die Deep-Sequencing-Datenanalyse. Nukleinsäuren Res. 44, W160–W165 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Liao, Y., Smyth, GK & Shi, W. Das R-Paket Rsubread ist einfacher, schneller, billiger und besser für die Ausrichtung und Quantifizierung von RNA-Sequenzierungs-Reads. Nukleinsäuren Res. 47, e47 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Robinson, MD, McCarthy, DJ & Smyth, GK EdgeR: ein Bioconductor-Paket für die differenzielle Expressionsanalyse digitaler Genexpressionsdaten. Bioinformatik 26, 139–140 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wagih, O. ggseqlogo: ein vielseitiges R-Paket zum Zeichnen von Sequenzlogos. Bioinformatik 33, 3645–3647 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Huerta-Cepas, J. et al. eggNOG 5.0: eine hierarchische, funktionell und phylogenetisch annotierte Orthologie-Ressource basierend auf 5090 Organismen und 2502 Viren. Nukleinsäuren Res. 47, D309–D314 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Love, M., Huber, W. & Anders, S. Moderierte Schätzung der Faltungsänderung und -dispersion für RNA-seq-Daten mit DESeq2. Genombiol. 15, 550 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Liao, Y., Wang, J., Jaehnig, EJ, Shi, Z. & Zhang, B. WebGestalt 2019: Toolkit zur Gen-Set-Analyse mit überarbeiteten Benutzeroberflächen und APIs. Nukleinsäuren Res. 47, W199–W205 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Referenzen herunterladen

Wir danken den Mitgliedern der Laboratorien Pelechano, Kutter und Friedländer sowie I. Piazza und V. Hauryliuk für nützliche Diskussionen. Wir danken D. Omnus, J. Karlsen und F. Righetti für ihre Unterstützung, E. Loh, K. Jonas, P. Hudson, C. Condon und V. Hauryliuk für die Bereitstellung von Bakterienstämmen und dem Labor von Emmanuelle Charpentier für die Bereitstellung des pEC622-Plasmids . Dieses Projekt wurde durch den Starting Grant der Swedish Foundation (Ragnar Söderberg Foundation), den Swedish Research Council (Nr. VR 2016-01842, 2019-02335, 2020-01480 und 2021-06112) und ein Wallenberg Academy Fellowship (Nr. 2016.0123) finanziert. , Vinnova (Nr. 2020-03620) und Karolinska Institutet (SciLifeLab Fellowship, SFO- und KI-Fonds) zum VP; das EU-Programm H2020-MSCA-IF-2018 (im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 845495 – TERMINATOR) und ein MoESCS RA Science Committee Starting Grant (Nr. 21SCG-1F006) für LN; ein RED-Postdoktorandenstipendium (Nr. 2021, SciLifeLab-KI) an MW; der schwedische Forschungsrat (Nr. 2021-01683 und 2021-06112) an JD; die Söderbergs-Stiftung an LE; Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (Nr. PGC2018-098073-A-I00 MCIU/AEI/FEDER, UE) an JH-C.; das National Key R&D Program of China (Nr. 2017YFC0908405) und die National Natural Science Foundation of China (Nr. 81870187) an WW; und ein ERC Advanced Investigator Grant (Nr. 742804) an LMSVP und WW danken für die Unterstützung durch ein gemeinsames China-Schweden-Mobilitätsstipendium von STINT (Nr. CH2018-7750) bzw. der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81911530167). Die Computeranalyse wurde mit Ressourcen durchgeführt, die von der schwedischen Nationalen Infrastruktur für Computer durch das Uppsala Multidisciplinary Centre for Advanced Computational Science bereitgestellt wurden und teilweise vom Schwedischen Forschungsrat durch die Fördervereinbarung Nr. finanziert wurden. 2018-05973.

Open-Access-Förderung durch das Karolinska-Institut

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Susanne Huch, Lilit Nersisyan.

SciLifeLab, Abteilung für Mikrobiologie, Tumor- und Zellbiologie, Karolinska Institutet, Solna, Schweden

Susanne Huch, Lilit Nersisyan, Maria Ropat, Donal Barrett, Mengjun Wu und Vicent Pelechano

Armenisches Bioinformatik-Institut, Eriwan, Armenien

Lilit Nersisyan & Nelli Vardazaryan

Institut für Molekularbiologie, Nationale Akademie der Wissenschaften Armeniens, Eriwan, Armenien

Lilit Nersisyan & Nelli Vardazaryan

Abteilung für Mikrobiologie, Tumor- und Zellbiologie, Zentrum für translationale Mikrobiomforschung, Karolinska Institutet, Stockholm, Schweden

Jing Wang, Valerie D. Valeriano, Juan Du und Lars Engstrand

Zentrum für Pflanzenbiotechnologie und Genomik, Polytechnische Universität Madrid – Nationales Institut für Agrar- und Lebensmittelforschung und -technologie, Montegancedo-UPM Campus, Madrid, Spanien

Jaime Huerta-Cepas

Bio-Med Big Data Center, CAS Key Laboratory of Computational Biology, Shanghai Institute of Nutrition and Health, University of Chinese Academy of Sciences, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Shanghai, China

Wu Wei

Stanford Genome Technology Center, Stanford University, Palo Alto, CA, USA

Lars M. Steinmetz

Abteilung für Genetik, School of Medicine, Stanford University, Stanford, CA, USA

Lars M. Steinmetz

Europäisches Labor für Molekularbiologie, Abteilung Genombiologie, Heidelberg, Deutschland

Lars M. Steinmetz

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

VP, SH und LN konzipierten und gestalteten die Studie. SH führte experimentelle Arbeiten mit Unterstützung von DB, JW und VDVLN durch, SH, MR und MW führten Datenanalysen mit Unterstützung von JH-C durch. und DBWW und LMS trugen zur anfänglichen Konzeptualisierung und Dateninterpretation bei. LE und JD trugen zur Dateninterpretation, zum Design und zur Überwachung bei. SH, LN und VP haben das ursprüngliche Manuskript entworfen und alle Autoren haben es überarbeitet. VP überwachte die Studie.

Korrespondenz mit Vicent Pelechano.

VP, SH und LN sind Mitbegründer von 3 N Bio AB, die einen Patentantrag für einen Teil der in diesem Manuskript beschriebenen Arbeit eingereicht hat. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Microbiology dankt Irina Artsimovitch und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

A: Genspezifischer 3-nt-Schutz für B. subtilis, wie von fivepseq14 berichtet. Jeder Punkt entspricht einem Gen und die Nähe zu den Dreiecksgrenzen (F0, F1 oder F2) ihrem bevorzugten Schutzrahmen. NT-Kontrollzellen sind in Grün, Polyribosomen-assoziierte mRNA-Abbauzwischenprodukte in Blau, CAM-behandelte Zellen in Gelb und zufällig fragmentierte Zellen in Rot dargestellt. B, 5PSeq-Metagenanalyse von B. subtilis nach Isolierung der Polyribosomenfraktion (wie in Abb. 1).

AL, Metagenanalyse für mehrere Arten mit Metagen-5PSeq-Schutz, Fast Fourier Transform (FFT), relativem Frame-Schutz und identifizierten RNasen (wie in Abb. 1).

A, NT und fragmentierte Kontrollen von B. subtilis-Wildtyp-Stämmen (168 trpC2) sowie rnjA- und rnjB-Knockout-Stämme. B Wildtyp- und RNase-mutierte B. subtilis-Stämme unter Hitzeschock. C. NT-Kontroll- und fragmentierte Proben des E. coli-Dh5α-Stammes und der TOP10 mit heterologer Expression von S. pyogenes RNJA. Die Spaltungsmotivpräferenz wurde mit einem auf der Shannon-Entropie basierenden Maß für den Nukleotidbeitrag berechnet (wie in Abb. 1C).

Liniendiagramme, die Aminosäure-spezifische Ribosomenpausen zeigen, gemessen mit fivepseq. A: Isoleucin (Ile)-Pause (-14 nt) im Vergleich der NT- und MUP-Behandlung bei L. plantarum, L. reuteri und B. subtilis. B: Die relativen kontextspezifischen Alanin (Ala)- und Serin (Ser)-Ribosomenpausen (-8 nt), gemessen mit fivepseq für mehrere Arten als Reaktion auf CAM. Nur in E. coli, dem RNase J fehlt, liefert das 5´P-Degradomprofil keine Informationen zur Einzelnukleotidauflösung des Ribosomenstillstands. CD, Diagramme der Hauptkomponentenanalyse basierend auf 5P-Zählungen 14 nt stromaufwärts von jedem Codon für L. plantarum und B. subtilis unter Stressbedingungen. Die NT-Kontrollproben von B. subtilis wurden in verschiedenen Wachstumsphasen gesammelt (OD600 0,2–0,3 bzw. 0,6–0,8). Der Beitrag jedes Codons wird mit grauen Ladevektoren angezeigt. Die Merkmale mit den längsten Belastungen, die denen mit dem höchsten absoluten Gewicht in PC1 und PC2 entsprechen, werden hervorgehoben. Die Aufwärtspfeile in den Beschriftungen zeigen an, dass die 5P-Zahlen unter Stressbedingungen für das Codon zunehmen. Codons gemeinsamer Aminosäuren zwischen L. plantarum und B. subtilis werden mit stressspezifischen Farben hervorgehoben. EF, relative Arg- und Gln-Pausen (-14 nt) im Wachstum der stationären Phase für L. plantarum (27 Stunden) und B. subtilis (8 Tage).

Bei der Durchführung der Anreicherungsanalyse wird entweder die log2-fache Änderung der Messwerte, die unter Stress eine Verschlechterung erleiden, im Vergleich zu unbehandelten Proben (relative Häufigkeit) oder die log2-fache Änderung des Frame Protection Index (FPI) berücksichtigt. Es werden nur Ergebnisse mit einer Falscherkennungsrate von <0,05 angezeigt. AB subtilis und E. coli im Hitzeschock. BB subtilis bei hohem Salzgehalt. CB subtilis und L. plantarum im stationären Wachstum.

A: Balkendiagramme, die den Prozentsatz (%) (Y-Achse) von 5'-P-Reads zeigen, die ein bestimmtes genetisches Annotationsmerkmal für B. subtilis- (links) und E. coli-Stämme (rechtes Feld) unter normalen und gestörten Bedingungen überlappen. Kontaminierende rRNA-Reads wurden von der Analyse ausgeschlossen. B: Hauptkomponentenanalyse basierend auf bibliotheksgrößennormalisierten 5'-P-Messwerten auf der natürlichen logarithmischen Skala der B. subtilis-Kontrolle und verschiedenen RNase-Knockdowns. Die Achsen stellen die Hauptkomponenten 1 und 2 dar. C, Wärmekarte, die die log2-fache Änderung im 5'-P zeigt, liest die Häufigkeit von miscRNAs für RNase-Knockouts im Vergleich zum Wildtyp-B. subtilis-Stamm. D, wie C, aber für 5' UTRs. E: Wärmekarten, die die strangspezifische Abdeckung von 5'-P-Reads mit normalisierter Bibliotheksgröße zeigen, die sich um die Endstelle (TES) von 5'-UTRs (in diesem Fall das Startcodon) für die B. subtilis-Kontrolle und verschiedene RNase-Knockouts konzentrieren. Jede Heatmap-Zeile zeigt eine 5' UTR. Die gestrichelte Linie zeigt die Startstelle von 5'-UTRs (d. h. TSSs). F, wie E, aber für E. coli.

A: Relative Anzahl eindeutig zugeordneter Lesevorgänge (skaliert innerhalb jeder Stichprobe) als Funktion der verwendeten Leselänge (rechnerisch gekürzt). B, 5PSeq-Analyse aus gefrorener Zellsuspension des ZymoBIOMICS Microbial Community Standard (zur DNA-Analyse bestimmt). Die Anzahl der zugewiesenen Messwerte für jede Art ist in Kreisen markiert. Relativer Rahmenschutz und schnelle Fourier-Transformation (FFT) sowie Vorhandensein/Fehlen von Enzymen wie in Abb. 1. C, 5PSeq-Analyse aus fäkalen Mikrobiomen. Die Anzahl der zugewiesenen Lesevorgänge ist in Kreisen markiert. Beispiel für die in vivo-Aminosäure-spezifische (Ala) 3-nt-Ribosomenschutzperiodizität für ausgewählte Arten. D, dasselbe gilt für das Kompost-Mikrobiom.

A, Relative Zusammensetzung der verwendeten Stuhlkulturen basierend auf der genomischen DNA-Häufigkeit. B: Liniendiagramme, die die 5PSeq-Metagenhäufigkeit in Bezug auf ausgewählte Merkmale zeigen und die artspezifische unterschiedliche Reaktion je nach Herkunftskultur veranschaulichen. C, Beispiel für Bacillota E. faecium, das kaum auf die angewandte medikamentöse Behandlung anspricht. D, Bacteroidota-Arten, denen RNase J fehlt, weisen als Reaktion auf die medikamentöse Behandlung ebenfalls deutliche Veränderungen des 5´P-Degradomprofils auf.

Ergänzende Abbildungen. 1–8, Beschreibungen der Tabellen 1–7 und unbeschnittene Scans von Gelen.

Tabelle 1: In dieser Studie verwendete Oligonukleotide. Tabelle 2: Zusammenfassung der in dieser Studie analysierten Proben und Bibliotheken. Tabelle 3: log2-Werte (fache Änderung) der relativen Häufigkeit von Lesevorgängen, die einem Abbau unterliegen, und FPI-Werte für jedes Gen und eine auf der Genontologie basierende Analyse der Gensatzanreicherung unter Stress im Vergleich zu unbehandelten Bedingungen für B. subtilis (subsp. subtilis 168trpC2), E. coli (Stamm MG1655) und L. plantarum. Die Anreicherungs-P-Werte wurden mit einem hypergeometrischen Test berechnet und mehrere Testanpassungen mit FDR und dem R-Paket WebGestaltR durchgeführt. Tabelle 4: Auswirkung von RNase-Knockout auf die Häufigkeit von RNA, die aus verschiedenen genomischen Merkmalen in B. subtilis stammt. Die Tabelle enthält log2 (fache Änderung) für UTRs, TSS, kodierende Regionen und verschiedene RNAs und tRNAs. Tabelle 5: Liste von 5.804 prokaryotischen Genomassemblierungen, die von NCBI abgerufen und für die Ausrichtung verwendet wurden. Tabelle 6: Liste der Arten mit relativ hoher Abdeckung, die in allen untersuchten Proben identifiziert wurden. Tabelle 7: geschätzte Expression von RNasen unter Verwendung von 5P-seq in den untersuchten Proben, in RPM.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Huch, S., Nersisyan, L., Ropat, M. et al. Atlas der mRNA-Translation und des mRNA-Zerfalls für Bakterien. Nat Microbiol 8, 1123–1136 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01393-z

Zitat herunterladen

Eingegangen: 16. Juni 2022

Angenommen: 19. April 2023

Veröffentlicht: 22. Mai 2023

Ausgabedatum: Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01393-z

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt