Strukturelle und funktionelle Analysen des Echinomycin-Resistenz verleihenden Proteins Ecm16 aus Streptomyces lasalocidi

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 7980 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Echinomycin ist ein Naturprodukt, ein DNA-Bisinterkalator-Antibiotikum. Der Echinomycin-Biosynthese-Gencluster in Streptomyces lasalocidi enthält ein Gen, das für das Selbstresistenzprotein Ecm16 kodiert. Hier präsentieren wir die Kristallstruktur von Ecm16, gebunden an Adenosindiphosphat, mit einer Auflösung von 2,0 Å. Die Struktur von Ecm16 ähnelt stark der von UvrA, der DNA-Schadenssensorkomponente des prokaryotischen Nukleotid-Exzisionsreparatursystems, allerdings fehlen Ecm16 die UvrB-bindende Domäne und das zugehörige Zink-bindende Modul, das in UvrA zu finden ist. Eine Mutagenesestudie ergab, dass die Insertionsdomäne von Ecm16 für die DNA-Bindung erforderlich ist. Darüber hinaus ermöglicht die spezifische Aminosäuresequenz der Insertionsdomäne Ecm16, Echinomycin-gebundene DNA von normaler DNA zu unterscheiden und die Substratbindung mit der ATP-Hydrolyseaktivität zu verknüpfen. Die Expression von ecm16 im heterologen Wirt Brevibacillus choshinensis verlieh Resistenz gegen Echinomycin und andere Quinomycin-Antibiotika, einschließlich Thiocoralin, Quinaldopeptin und Sandramycin. Unsere Studie liefert neue Erkenntnisse darüber, wie die Hersteller von DNA-Bisinterkalator-Antibiotika die von ihnen produzierten toxischen Verbindungen abwehren.

Quinomycin-Antibiotika wirken durch nichtkovalente Bindung an die DNA-Doppelhelix1. Es handelt sich um DNA-Bisinterkalatoren, also Verbindungen, die sich reversibel an den DNA-Duplex binden, indem sie ein Paar aromatischer Ringgruppen zwischen benachbarte Basenpaare der DNA einfügen. Aufgrund ihrer starken antimikrobiellen und antitumoralen Wirkung besteht großes Interesse an dieser Verbindungsfamilie, was zu einem umfangreichen biochemischen, strukturellen und klinischen Wissen führt2. Allerdings sind die mechanistischen Details zur bakteriellen Resistenz gegen DNA-Bisinterkalatoren noch begrenzt. Während in pathogenen Bakterien bisher kein Resistenzelement gegen diese Verbindungen entdeckt wurde, ist es ratsam, in der natürlichen Umwelt vorhandene Resistenzmechanismen zu identifizieren und aufzuklären. Die Kenntnis grundlegender Resistenzmechanismen wird es Forschern ermöglichen, neue Therapiestrategien zu entwickeln, bevor die Quinomycin-Resistenz zu einem klinischen Problem wird.

Quinomycin-Antibiotikaproduzenten enthalten typischerweise ein oder mehrere Selbstresistenzgene, die entweder innerhalb des Antibiotika-Biosynthese-Genclusters oder an anderer Stelle im Genom zu finden sind. Beispielsweise enthält das Triostin-produzierende Bakterium ein Gen, das für einen ABC-Transporter kodiert3, und der Thiocoralin-Produzent enthält Gene, die für einen ABC-Transporter sowie ein Thiocoralin-Sequestrierungsprotein kodieren4,5. Interessanterweise enthalten Quinomycin-Produzenten auch ein Gen für UvrA -ähnliches Protein in ihrem biosynthetischen Gencluster (Tabelle 1). UvrA ist ein DNA-Reparaturenzym aus dem universellen prokaryotischen Nukleotid-Exzisionsreparaturweg (NER). Kurz gesagt, UvrA erkennt den DNA-Schaden und rekrutiert UvrB an die Läsionsstelle. UvrB rekrutiert UvrC, das die Phosphodiesterbindung acht Nukleotide stromaufwärts und bis zu fünf Nukleotide stromabwärts des modifizierten Nukleotids spaltet. Als nächstes rekrutiert UvrC die UvrD-Helikase, die das gespaltene DNA-Fragment verdrängt. DNA-Polymerase I synthetisiert den fehlenden DNA-Abschnitt unter Verwendung des unbeschädigten Komplementärstrangs als Matrize, und DNA-Ligase versiegelt die Brüche und vervollständigt so die Reparatur6.

Echinomycin ist ein prototypischer DNA-Biinterkalator, der von mehreren Actinomyceten produziert wird, darunter Streptomyces echinatus und Streptomyces lasalocidi (früher bekannt als S. lasaliensis)7,8,9. Es handelt sich um ein zyklisches Depsipeptid, das zwei Chinoxalingruppen und eine ungewöhnliche Thioacetalbrücke enthält (Abb. 3)10. Echinomycin zeigt eine starke antimikrobielle Aktivität gegen Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus und Vancomycin-resistente Enterokokken11,12, wird jedoch aufgrund von Löslichkeits- und Toxizitätsproblemen nicht klinisch eingesetzt. Der Echinomycin-Biosynthese-Gencluster aus S. lasalocidi enthält Gene, die für Enzyme kodieren, die die Chinoxalingruppe synthetisieren, Enzyme, die das Peptidrückgrat aufbauen, und Gene, die für Proteine mit unbekannter Funktion kodieren13. Eines der funktionell nicht charakterisierten Proteine ist Ecm16, von dem postuliert wurde, dass es einen Selbstschutz gegen Echinomycin bietet, basierend auf der Sequenzidentität (~ 30 %), die es mit den prokaryotischen UvrA-Proteinen teilt, die im NER-Signalweg funktionieren13.

Wir haben bereits über die funktionelle In-vivo- und In-vitro-Charakterisierung von Ecm1614 berichtet. Die Hauptergebnisse dieser Studie sind (1) das Echinomycin-empfindliche Escherichia coli K12 wird bei Transformation mit dem ecm16-kodierenden Plasmid Echinomycin-resistent, (2) Ecm16 erfordert keine Beteiligung der NER-Proteine UvrA, UvrB, UvrC oder UvrD, um Echinomycin bereitzustellen Resistenz, (3) Ecm16 ergänzt die UvrA-Funktion nicht, (4) die ATPase-Aktivität von Ecm16 ist für seine Anti-Echinomycin-Aktivität essentiell, (5) Ecm16 bindet an doppelsträngige DNA in einer von der Nukleotidsequenz unabhängigen Weise und (6) Ecm16 bindet gegenüber Echinomycin-haltiger DNA ~ zweifach stärker als gegenüber Echinomycin-freier DNA. In der aktuellen Studie haben wir die Kristallstruktur von Ecm16 bestimmt, um einen strukturellen Kontext für seine Funktion bereitzustellen. Wir haben auch Mutationsstudien durchgeführt, um die Rolle der Insertionsdomäne von Ecm16 zu untersuchen. In UvrA-Proteinen ist die Insertionsdomäne an der schadensspezifischen DNA-Bindung beteiligt15. Schließlich haben wir die Substratspezifität von Ecm16 untersucht, indem wir ecm16-exprimierende Zellen mit einer Reihe von auf Quinomycin- und Nicht-Quinomycin-DNA gerichteten Antibiotika herausgefordert haben.

Wir haben die Struktur von Ecm16, gebunden an Adenosindiphosphat (ADP), mit einer Auflösung von 2,0 Å bestimmt (Abb. 1a). Unser endgültiges Modell besteht aus dem Ecm16-Homodimer, vier ADP-, zwei Mg2+-, vier Zn2+- und 612 Wassermolekülen (Tabelle 2). Einige Reste, darunter 183–293 der Kette A und 185–295 der Kette B, die die gesamte Insertionsdomäne umfassen, wurden aufgrund fehlender Elektronendichte nicht modelliert (Ergänzungstabelle 1). Jedes Protomer von Ecm16 enthält zwei ABC-ATPase-Motive, die als Nukleotidbindungsdomäne I und II (NBD-I und NBD-II) bezeichnet werden. NBD-I besteht aus der ATP-Bindungs-I-Domäne, der Signatur-I-Domäne und der Insertionsdomäne. Die Insertionsdomäne war in der Kristallstruktur nicht sichtbar, vermutlich weil sie ungeordnet ist. NBD-II besteht aus der ATP-bindenden II-Domäne und der Signatur-II-Domäne. NBD-II fehlt der Helix-Turn-Strang, der den Resten 66–99 von NBD-I entspricht (ergänzende Abbildung 1). Abgesehen von diesen beiden Unterschieden haben NBD-I und NBD-II eine relativ ähnliche Gesamtstruktur (RMSD = 1,5 Å für 208 Cα-Atome). Die Dimerschnittstelle von Ecm16 verbirgt eine Oberfläche von ca. 3900 Å2 und besteht aus Resten der ATP-bindenden I-, Signatur-I- und Signatur-II-Domänen (ergänzende Abbildung 2). Die ventrale Seite von Ecm16 weist eine verlängerte Furche auf, die mit zahlreichen Grundresten ausgekleidet ist (K136, K143, K381, R384, R567, K568, R537, K549, K572, K577) (Ergänzende Abbildung 3). Diese ca. 10 nm lange und ca. 2 nm breite Rille kann möglicherweise eine ca. 32 bp große B-Form-DNA aufnehmen und bietet eine strukturelle Grundlage für die zuvor berichtete DNA-Bindungsaktivität von Ecm1614.

Kristallstruktur von Ecm16. (a) Domänenorganisation und Gesamtstruktur des Ecm16-Homodimers. In der Primärstruktur ist eine Insertionsdomäne vorhanden, in der Kristallstruktur wird sie jedoch nicht beobachtet. ADP-, Zn2+- und Mg2+-Atome sind als Kugeln dargestellt (C: gelb, N: blau, O: rot, P: orange, Zn: grau, Mg: grün). (b) Proximale Nukleotidbindungsstelle. Atom-zu-Atom-Abstände werden in Å angegeben. (c) Distale Nukleotidbindungsstelle. (d) Oben: Zinkbindungsmodul 2. Unten: Zinkbindungsmodul 3. (e) Kristallstruktur von Ecm16 aus Streptomyces lasalocidi (PDB-ID: 7SH1), UvrA aus Bacillus stearothermophilus (PDB-ID: 2R6F) und UvrA2 aus Deinococcus radiodurans (PDB-ID: 2VF8).

Ecm16 verfügt über insgesamt vier Nukleotidbindungsstellen, zwei proximale und zwei distale Nukleotidbindungsstellen (Abb. 1a). Die proximale Nukleotidbindungsstelle befindet sich etwa 19 Å von der Ecm16-Dimerschnittstelle entfernt und ist zwischen der ATP-Bindungsdomäne I und der Signaturdomäne II eingebettet. Die distale Nukleotidbindungsstelle befindet sich ~ 26 Å von der Dimerschnittstelle entfernt und ist zwischen der ATP-Bindungsdomäne II und der Signaturdomäne I eingebettet. Jede ATP-Bindungsdomäne enthält ein Walker-A-Motiv, ein Walker-B-Motiv und die α-Helix ABC-Signatur-Subdomäne, die die LSGGQ-Sequenz enthält, die typischerweise in ABC-Transportern16 und DNA-Reparaturproteinen17 vorkommt. Die ATP-Bindungs- und Signaturdomänen sind durch die Q-Schleife verbunden, die der Ort der wichtigsten Konformationsänderungen und der Kopplung der Energieumwandlungsdomänen von NBD an andere ATPasen ist18. Die Elektronendichte sowohl an der proximalen als auch an der distalen Nukleotidbindungsstelle zeigte das Vorhandensein von ADP (ergänzende Abbildung 4). Um die Identität des an Ecm16 gebundenen Nukleotids weiter zu bestätigen, führten wir eine Flüssigchromatographieanalyse des Proteinextrakts durch. In diesem Experiment wurde nur ADP nachgewiesen (ergänzende Abbildung 5), was darauf hinweist, dass es sich bei dem in der Ecm16-Kristallstruktur beobachteten Nukleotid um ADP und nicht um ATP handelt.

Mg2+-Ionen werden nur an den beiden proximalen Nukleotidbindungsstellen und nicht an den distalen Stellen beobachtet, obwohl Ecm16 in Gegenwart von 10 mM MgCl2 kristallisiert wurde (Abb. 1b, c). Der Grund dafür ist nicht klar, aber eine ähnliche Beobachtung wurde für die Kristallstruktur von UvrA aus Bacillus stearothermophilus19 gemacht. Die Phosphatgruppen von ADP sind an einem ausgedehnten Wasserstoffbindungsnetzwerk beteiligt, an dem die Reste des Walker-A-Motivs beteiligt sind, während der Ribosezucker und die Adeninbase relativ wenige Wechselwirkungen mit Ecm16 eingehen. Der konservierte Histidinrest an Position 501 stapelt sich gut gegen den Adeninring von ADP an der distalen Stelle. Jedes Ecm16-Protomer enthält zwei Zinkbindungsmodule, die den UvrA-Zinkbindungsmodulen 2 und 3 entsprechen, die in allen bisher gemeldeten UvrA-Kristallstrukturen beobachtet wurden. In Modul 2 ist Zn2+ an C176, C179, C296 und C299 koordiniert, während Zn2+ in Modul 3 an C589, C592, C612 und C615 koordiniert ist (Abb. 1d). Diese zinkkoordinierenden Reste sind in den Proteinen UvrA und UvrA2 konserviert14,15.

Die dreidimensionale Struktur von Ecm16 ähnelt der von UvrA aus B. stearothermophilus (RMSD = 2,6 Å für 1002 Cα-Atome) und UvrA2 aus Deinococcus radiodurans (RMSD = 1,7 Å für 933 Cα-Atome) (Abb. 1e, ergänzende Abb. 6). . Die strukturelle Ähnlichkeit von Ecm16, UvrA und UvrA2 erklärt ihre gemeinsamen Funktionalitäten wie DNA-Bindung und ATP-Hydrolyse15,20. Allerdings fehlt Ecm16 wie UvrA2 die UvrB-Bindungsdomäne und das zugehörige Zink-Bindungsmodul 1, die in allen UvrA-Proteinen zu finden sind, was darauf hindeutet, dass Ecm16 nicht über den NER-Weg mit UvrB interagiert. Dies steht im Einklang mit unserem vorherigen Bericht, dass sowohl der Wildtyp als auch die UvrB-Knockout-Stämme von E. coli K12 nach Induktion der Expression von in trans14 kodiertem ecm16 resistent gegen Echinomycin wurden.

Es wurde vorgeschlagen, dass die Insertionsdomäne von UvrA und UvrA2 zur Bindung des DNA-Substrats beiträgt15,20,21. Um zu testen, ob die Insertionsdomäne von Ecm16 für die DNA-Bindung erforderlich ist, haben wir Ecm16-ΔID hergestellt, in dem die Insertionsdomäne durch einen Glycin-Serin-Linker ersetzt wurde (Ergänzende Abbildungen 7, 8). Wir haben die Bindung von Ecm16 und Ecm16-ΔID an eine 32-bp-DNA überwacht, die eine einzelne Echinomycin-Bindungsstelle enthält (Ergänzungstabelle 2). Der Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) zeigte, dass Ecm16 stärker an Echinomycin-gebundene DNA band als normale DNA, wohingegen Ecm16-ΔID an keinen der beiden DNA-Typen band (Abb. 2a). Als nächstes haben wir die DNA-Bindungsaffinität von Ecm16 und Ecm16-ΔID mithilfe der Fluoreszenzpolarisation gemessen. Die Dissoziationskonstante für Ecm16-DNA-Echinomycin und Ecm16-DNA betrug 11,8 nM bzw. 60,2 nM (Abb. 2b, Tabelle 3). Für Ecm16-ΔID wurde keine Bindung für eines der DNA-Substrate beobachtet. Daher zeigten sowohl EMSA als auch Fluoreszenzpolarisation, dass die Insertionsdomäne von Ecm16 für die DNA-Bindung erforderlich ist.

Die Insertionsdomäne von Ecm16 ist für die Echinomycin-Resistenz erforderlich. (a) DNA-Bindungsaktivität von Wildtyp- und Varianten-Ecm16-Proteinen, analysiert mittels elektrophoretischem Mobilitätsverschiebungsassay. Das Reaktionsgemisch enthielt DNA oder DNA-Echinomycin (mit einem Sternchen markiert) in Abwesenheit (Spur 1 und 2) oder Anwesenheit von 100, 200 und 300 nM Ecm16, Ecm16-ΔID und Ecm16*. Originalgele sind in der ergänzenden Abbildung 9 dargestellt. (b) DNA-Bindungsaktivität von Wildtyp- und Varianten-Ecm16-Proteinen, analysiert unter Verwendung eines Fluoreszenzpolarisationsassays. 50 nM Fluorescein-markierte 32-bp-DNA (oben) und 50 nM Echinomycin-DNA (unten) wurden mit zunehmenden Proteinmengen inkubiert. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten dar. (c) Spezifische ATP-Hydrolyseaktivität von Ecm16, Ecm16* und UvrA in Gegenwart von 1 µM DNA, DNA-Echinomycin, DNA-Fluorescein und DNA-Doxorubicin. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten dar. (d) Bestimmung der Echinomycin-Resistenz. Wachstumskurve von E. coli (K12)-Zellen, die nur Vektorkontrolle, p(VCO), p(ecm16), p(ecm16-ΔID) und p(ecm16*)-Plasmide in Abwesenheit oder Anwesenheit von 10 µM Echinomycin tragen . Die Diagramme sind repräsentativ für drei unabhängige Replikate.

Als nächstes bereiteten wir Ecm16 * vor, in dem die Insertionsdomäne von Ecm16 mit der Insertionsdomäne von DrrC, einem Ecm16-Homologen aus Streptomyces peucetius, ausgetauscht wurde (Ergänzende Abbildungen 7, 8). Es wurde berichtet, dass DrrC eine Resistenz gegen das DNA-Monointerkalator-Antibiotikum Daunorubicin verleiht, obwohl der molekulare Mechanismus von DrrC nicht bekannt ist22. Die Insertionsdomäne von Ecm16 und DrrC weist eine gemeinsame Aminosäuresequenzidentität von 32 % auf. Ecm16* band 2,4-fach stärker an Echinomycin-haltige DNA als an normale DNA (KD = 37,7 nM vs. 90,8 nM) (Abb. 2b, Tabelle 3). Dieses Ergebnis zeigt, dass eine homologe Insertionsdomäne für Ecm16 ausreicht, um Echinomycin-gebundene DNA von normaler DNA durch differenzielle Bindung zu unterscheiden. Um zu untersuchen, ob Ecm16* eine Anti-Echinomycin-Aktivität aufweist, wurden Ecm16* exprimierende E. coli K12-Zellen mit 10 µM Echinomycin in Kontakt gebracht. Ecm16*-exprimierende Zellen reagierten empfindlich auf Echinomycin (Abb. 2d), was darauf hinweist, dass die native Insertionsdomäne vorhanden sein muss, um eine Anti-Echinomycin-Aktivität bereitzustellen.

Wir haben zuvor berichtet, dass die ATP-Hydrolyseaktivität von Ecm16 erforderlich ist, um in vivo eine Echinomycin-Resistenz zu erreichen14. Da Ecm16* bevorzugt an Echinomycin-haltige DNA bindet, aber keine Echinomycin-Resistenz verleiht, haben wir vorausgesagt, dass Ecm16* ATP nicht hydrolysieren kann. Um diese Idee zu testen, haben wir die ATP-Hydrolyseaktivität von Ecm16, Ecm16-ΔID, Ecm16* und UvrA in Gegenwart von arzneimittelfreier DNA, Echinomycin-gebundener DNA, Fluorescein-modifizierter DNA und Doxorubicin-gebundener DNA gemessen (Ergänzungstabelle). 2). Echinomycin-gebundene DNA ist vermutlich das native Substrat von Ecm16, Fluorescein-modifizierte DNA imitiert UV-geschädigte DNA und ist ein bekanntes Substrat für UvrA, aber nicht Ecm1614,20, und Doxorubicin-gebundene DNA ist das vermutliche Substrat für DrrC23. Die ATP-Hydrolyseaktivität von Ecm16 stieg in Gegenwart von Echinomycin-gebundener DNA, jedoch nicht in Gegenwart anderer von uns getesteter DNA-Substrate, um das 16-fache (Abb. 2c). Ecm16* und UvrA zeigten eine ähnliche basale ATPase-Aktivität für alle vier DNA-Substrate. Ecm16-ΔID zeigte keine signifikante ATP-Hydrolyseaktivität für alle DNA-Substrate (ergänzende Abbildung 10), was mit der Unfähigkeit von Ecm16ΔID zur DNA-Bindung übereinstimmt (Abb. 2a, b). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass nur das native DNA-Substrat die ATP-Hydrolyseaktivität von Ecm16 stimuliert und dass diese Eigenschaft verloren geht, wenn die Insertionsdomäne gelöscht oder durch die Insertionsdomäne eines homologen Proteins ersetzt wird. Daher spielt die Insertionsdomäne eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Substratspezifität von Ecm16 und bei der Unterstützung der Anti-Echinomycin-Aktivität von Ecm16.

Wir haben die Substratspezifität von Ecm16 untersucht, indem wir getestet haben, ob Ecm16 eine Resistenz gegen andere DNA-bindende Arzneimittelmoleküle bieten kann – Doxorubicin, Mitomycin C, Daunorubicin, Actinomycin D, Cisplatin, Thiocoralin, Chinaldopeptin und Sandramycin. Da die Permeabilität dieser Verbindungen bei gramnegativen (Diderm-)Bakterien begrenzt ist, haben wir anstelle von E. coli K12 das grampositive (Monoderm-)Bakterium Brevibacillus choshinensis verwendet. Ecm16-exprimierende B. choshinensis-Zellen zeigten eine Resistenz nur gegen die DNA-Bisinterkalator-Antibiotika Echinomycin, Thiocoralin, Quinaldopeptin und Sandramycin (Abb. 3). Der Grad der Resistenz durch Ecm16 war bei der höchsten getesteten Antibiotikakonzentration am ausgeprägtesten. Zellen, die den Kontrollvektor enthielten, wuchsen in Gegenwart von 0,1 µM Echinomycin, 4 µM Thiocoralin, 6 µM Chinaldopeptin oder 2 µM Sandramycin sehr langsam, sodass die Verdoppelungszeit nicht bestimmt werden konnte, wohingegen Zellen, die Ecm16 exprimierten, Verdoppelungszeiten aufwiesen, die denen von Zellen ähnlicher waren die nicht mit dem jeweiligen Antibiotikum behandelt wurden (nur 1,1- bis 1,2-fach länger) (Abb. 3). Unser Ergebnis zeigte, dass Ecm16 am wirksamsten gegen Echinomycin ist, aber auch eine gewisse Resistenz gegen andere strukturell ähnliche Quinomycin-Antibiotika bietet.

Wachstumskurvenstudie von B. choshinensis-Stämmen mit pNI Vector-Control-Only (VCO) oder ecm16_pNI-Plasmid. Die Zellen wurden in 2SY-Medium, ergänzt mit 50 µg/ml Neomycin-Antibiotikum, gezüchtet. Der Stamm B. choshinensis wurde mit den angegebenen Konzentrationen an Echinomycin-DNA (0,025, 0,05, 0,1 µM), Thiocoralin (0,5, 2,0, 4,0 µM), Chinaldopeptin (1,5, 3,0, 6,0 µM) und Sandramycin-DNA (0,5, 1,0, 2,0 µM) inkubiert Bis-Interkalatoren. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten dar.

Hier berichten wir über die Kristallstruktur von Ecm16 des Echinomycin-Produzenten S. lasalocidi. Ecm16 ist ein Homolog von UvrA, dem DNA-Schadenssensorprotein aus dem prokaryotischen NER-Signalweg. Der Hauptstrukturunterschied zwischen Ecm16 und UvrA besteht darin, dass Ecm16 die UvrB-Bindungsdomäne und ein Zink-Bindungsmodul fehlen, die in allen bisher gemeldeten UvrA-Strukturen vorhanden sind (PDB-ID: 2R6F, 3PIH, 3UWX, 3UX8, 3ZQJ, 6N9L). Ein weiterer möglicher struktureller Unterschied ist die Konformation der etwa 100 Reste langen Insertionsdomäne. Dies muss jedoch noch überprüft werden, da die Insertionsdomäne in der Ecm16-Kristallstruktur nicht sichtbar ist, vermutlich weil diese Domäne in Abwesenheit eines gebundenen DNA-Substrats mobil ist. Insgesamt ist die dreidimensionale Struktur von Ecm16 und UvrA sehr ähnlich. Sie teilen sich die gleiche Proteinfalte und enthalten beide vier ATP-Bindungsstellen und eine durchgehende DNA-Bindungsfurche. Dementsprechend zeigen Ecm16 und UvrA beide ATPase-Aktivität und binden doppelsträngige DNA14. Ecm16 fehlt jedoch die UvrB-Bindungsdomäne und das zugehörige Zink-Bindungsmodul, was darauf hindeutet, dass Ecm16 und UvrA über unterschiedliche molekulare Mechanismen verfügen, die möglicherweise durch divergente Evolution erworben wurden.

Ecm16ΔID, dem die Insertionsdomäne fehlt, konnte keine DNA binden. Darüber hinaus schützte die Expression von Ecm16ΔID in E. coli K12 die Zellen nicht vor Echinomycin. Ecm16*, das die Insertionsdomäne des Daunorubicin-Resistenzproteins DrrC besitzt, zeigte eine 2,4-fach höhere Bindungsaffinität zu Echinomycin-gebundener DNA als normale DNA. Allerdings zeigte Ecm16* im Gegensatz zu Ecm16 nicht den dramatischen Anstieg der ATP-Hydrolyserate in Gegenwart von Echinomycin-haltiger DNA. Basierend auf diesen Ergebnissen schlagen wir ein zweistufiges Modell zum Nachweis von Echinomycin-gebundener DNA durch Ecm16 vor. Im ersten Schritt unterscheidet Ecm16 Echinomycin-gebundene DNA von normaler DNA durch unterschiedliche DNA-Bindungsaffinität. Dieser erste Screening-Schritt erfordert das Vorhandensein der Insertionsdomäne unabhängig von der Sequenz. Im zweiten Schritt werden Ecm16-gebundene DNA-Substrate weiter anhand ihrer Fähigkeit unterschieden, die ATPase-Aktivität von Ecm16 zu stimulieren. Dieser zweite Schritt scheint eine Insertionsdomäne zu erfordern, die speziell auf Echinomycin abgestimmt ist. Zusätzliche Strukturstudien sind erforderlich, um zu bestimmen, wie diese beiden Schritte auf molekularer Ebene erreicht werden. Insbesondere die atomare Struktur von Ecm16 im Komplex mit Echinomycin-gebundener DNA und mit Echinomycin-freier DNA wird zur Entschlüsselung des molekularen Mechanismus beitragen. Interessanterweise bot Ecm16 auch Schutz gegen die Naturstoff-DNA-Bisinterkalatoren Thiocoralin, Quinaldopeptin und Sandramycin. Dies erinnert an die Fähigkeit des UvrA-Proteins, eine Vielzahl von DNA-Läsionen zu erkennen.

Das Verständnis der Mechanismen der Antibiotikaresistenz ist wichtig, da es die Entwicklung neuer Therapiestrategien ermöglicht. Unsere Arbeit hat begonnen, einen potenziell neuartigen Mechanismus der Antibiotikaresistenz aufzudecken. Es sind jedoch weitere Studien erforderlich, um vollständig zu verstehen, wie Ecm16 Echinomycin-Resistenz verleiht. Dazu gehört die Bestimmung der Struktur von Ecm16, das an verschiedene DNA-Substrate gebunden ist, und die Identifizierung, falls vorhanden, der Partnerproteine von Ecm16. Unter der Annahme, dass Ecm16 Partnerproteine benötigt, handelt es sich wahrscheinlich um Proteine, die über verschiedene phylogenetische Abstammungslinien hinweg konserviert sind, da Ecm16 Echinomycin-Resistenz verleiht, wenn es in drei entfernt verwandten Organismen, S. lasalocidi, E. coli und B. choshinensis, exprimiert wird.

Die in dieser Studie verwendeten Stämme und Plasmide sind in Tabelle S4 aufgeführt. Der Stamm E. coli DH5α (Invitrogen) wurde zum Klonen und zur Plasmidvermehrung verwendet, während Wachstumskurvenstudien mit dem Stamm E. coli (K12) (Invitrogen) durchgeführt wurden. Luria-Bertani (LB)-Brühe (Difco) mit geeignetem Antibiotikum wurde zum Züchten von E. coli-Kulturen bei 37 °C unter konstanter Belüftung und Schütteln bei 200 U/min verwendet. Auf Festmedien kultivierte E. coli-Stämme wurden auf LB-Agar (Fisher BioReagents) ausplattiert und bei 37 °C inkubiert. Zur Induktion der Genexpression in LB-Wachstumskulturen wurden 0,2 % L-Arabinose (Alfa Aesar) zugesetzt. Der Stamm B. choshinensis (Takara Bio) wurde in MT (10 mg ml-1 Glucose, 10 mg ml-1 Phytonpepton, 35 % Ehrlich-Bonito-Extrakt, 2 mg ml-1 Hefeextrakt mit blauem Etikett, 10 µg ml-1 FeSO4) gezüchtet , 10 µg ml−1 MnSO4, 1 µg ml−1 ZnSO4, 4,1 µg ml−1 MgCl2) Medien. Für Wachstumskurvenstudien wurde der Stamm B. choshinensis in 2SY-Flüssigmedium (20 mg ml-1 Glucose, 40 mg ml-1 Bacto-Sojaton, 5 mg ml-1 Bacto-Hefeextrakt, 150 µg ml-1 CaCl2) bei 37 °C kultiviert C unter Schütteln bei 200 U/min. E. coli- und B. choshinensis-Zellen, die unterschiedliche Plasmide enthielten, wurden in Gegenwart von Ampicillin (50 µg ml-1 flüssiges Medium und 100 µg ml-1 festes Medium für E. coli) und Neomycin (50 µg ml-1 für B. choshinensis) gehalten ). B. choshinensis-Stämme wurden als Stammkulturen bei –80 °C gehalten. Stammkulturen wurden in LB-Medium mit 40 % Glycerin eingefroren.

Codon-optimierte Gene für ecm16 und ecm16-ΔID wurden zur Expression in E. coli unter Verwendung der NdeI- und EcoRI-Stellen (GenScript) in den pUC19-Vektor subkloniert. Die Gene wurden mit den Enzymen NdeI und EcoRI verdaut und gelgereinigt. Der Expressionsvektor pET28a (+) wurde mit NdeI und EcoRI geschnitten und gelgereinigt. Die ecm16- und ecm16-ΔID-Inserts wurden mit dem Quick Ligation Kit (New England Biolabs Inc.) in einem Insert:Vektor-Verhältnis von 3:1 in den pET28a(+)-Vektor ligiert. Ligationsprodukte wurden in chemisch kompetente E. coli DH5α-Zellen transformiert und über Nacht auf LB-kan-Platten (50 µg ml−1) bei 37 °CE gezüchtet. coli BL21 (DE3) (Novagen)-Zellen wurden mit dem Expressionsvektor transformiert und dann kultiviert Exponentielle Phase bei 37 °C in Luria Bertani (LB)-Medium mit 50 µg/ml Kanamycin. Ecm16* wurde unter Verwendung des gleichen Verfahrens unter Verwendung der Restriktionsverdauungsenzyme EcoR1 und HindII an der 5'- bzw. 3'-Stelle in den Vektor pET28a (+) kloniert. Die Expression von ecm16 wurde unter Verwendung von 0,25 mM Isopropyl-d-1-thiogalactopyranosid (Thermo Scientific) bei einer optischen Dichte bei OD600 von 0,6–0,8 induziert. Die Zellen wurden 16 Stunden lang bei 18 °C weiter gezüchtet und dann durch 15-minütige Zentrifugation bei 6000 × g und 4 °C geerntet. Das Zellpellet wurde in Lysepuffer (50 mM HEPES pH 7,5, 200 mM NaCl, 10 mM Imidazol und 5 % Glycerin (v/v), 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 10 µg/ml DNase und 10 mM MgCl2) resuspendiert und lysiert Beschallung. Das Zelllysat wurde 60 Minuten lang bei 4 ° C und 30.000 × g zentrifugiert und unlösliches Material entfernt. Die lösliche Fraktion wurde auf eine 5-ml-Ni-NTA-Säule (GE Healthcare) geladen, die mit Bindungspuffer (50 mM HEPES pH 7,5, 200 mM NaCl) äquilibriert und mit 250 ml Waschpuffer (50 mM HEPES pH 7,5, 200 mM NaCl) gewaschen wurde , 30 mM Imidazol und 5 % (v/v) Glycerin) und gebundenes Protein wurde mit Elutionspuffer (50 mM HEPES pH 7,5, 200 mM NaCl, 250 mM Imidazol) eluiert. Die eluierte Proteinlösung wurde auf eine 5 ml HiTrap QHP HP-Säule (GE Healthcare) aufgetragen und gebundenes Protein wurde unter Verwendung eines linearen 50–500 mM NaCl-Gradienten eluiert. Zuletzt wurden die Ecm16-Proben durch Größenausschlusschromatographie in 50 mM HEPES, pH 7,5, 50 mM NaCl unter Verwendung eines Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) gereinigt. Die Reinheit des Proteins wurde durch SDS-PAGE untersucht. Proteinproben wurden unter Verwendung eines Amicon 10-kDa-MWCO-Zentrifugalfilters konzentriert. Alle Reinigungsschritte wurden bei 4 °C durchgeführt. Die Varianten Ecm16-ΔID und Ecm16* wurden auf die gleiche Weise wie das Wildtyp-Ecm16-Protein hergestellt.

Für In-vivo-Studien mit E. coli wurden codonoptimiertes ecm16 und ecm16-ΔID aus zuvor konstruierten pET28a-Vektoren mit SacI- und EcoRI-Stellen unter Verwendung von Phusion-Polymerase (New England Biolabs) amplifiziert. Die Gene wurden elektrophoretisch auf einem 0,7 %igen Agarosegel aufgetrennt und gelgereinigt. Nach der Reinigung wurden die Gene mit SacI und EcoRI (New England Biolabs) verdaut und in einen ähnlich verdauten pBAD-Myc-HisA-Vektor (Thermo Fisher) kloniert. Nach der Verdauung wurde der Vektor mit alkalischer Phosphatase aus Garnelen (New England Biolabs) behandelt. Sowohl der verdaute Vektor als auch die verdauten Fragmente wurden elektrophoretisch auf einem 0,7 %igen Agarosegel aufgetrennt und erneut gelgereinigt. Die Fragmente wurden mit T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) in den pBAD-Vektor ligiert, dann in elektrokompetente DH-5α-Zellen transformiert und über Nacht gezüchtet Auf LB-amp-Platten (100 µg ml−1) bei 37 °C wurden coli BW25113 (Coli Genetic Stock Center) Zellen mit dem Expressionsvektor transformiert und dann bei 37 °C in LB-Medium mit 50 µg/ml Ampilcillin bis zur Exponentialphase kultiviert . Die Konstruktion von BW25113-Zellen mit ecm16* wurde ähnlich wie BW25113-ecm16 und BW25113-ecm16-ΔID durchgeführt, mit der Ausnahme, dass HindIII- und EcoRI-Stellen für den Restriktionsverdau verwendet wurden.

Das UvrA-Gen aus Thermotoga maritima wurde in den pET28a (+)-Vektor kodiert und in E. coli Rosetta (DE3) pLysS-Zellen transformiert. Die Proteinexpression wurde mit 50 µM Isopropyl-ß-d-galactosid (IPTG) induziert und 5 Stunden lang bei 30 °C inkubiert. Bakterienzellen wurden in Puffer, der 50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 5 % (v/v) Glycerin enthielt, resuspendiert und mit Ultraschall behandelt. Das Lysat wurde 45 Minuten lang bei 18.000 U/min zentrifugiert und der Überstand auf eine His-Trap-Rohöl-5-ml-Säule (GE Healthcare) aufgetragen. UvrA wurde mit einem 200 ml Imidazol-Gradienten von 0 bis 500 mM Konzentration eluiert. Das gereinigte Protein wurde mit Puffer verdünnt, der 50 mM Tris pH 8,0, 2 mM DTT und 5 % (v/v) Glycerin enthielt, und auf eine 5 ml HiTrap Q HP-Säule (GE Healthcare) aufgetragen. UvrA wurde mit 50 ml linearem NaCl-Gradienten von 50 mM bis 1 M eluiert. Das Protein wurde durch Größenausschlusschromatographie unter Verwendung von Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare), äquilibriert mit Puffer, der 50 mM Tris pH 8,0, 200 mM NaCl enthielt, weiter gereinigt. 2 mM DTT und 5 % (v/v) Glycerin. Das Volumen der gesammelten Proteinprobe wurde auf eine Endkonzentration von 10 mg/ml reduziert und in flüssigem Stickstoff schockgefroren.

Ecm16-Kristalle wurden bei 18 °C durch Dampfdiffusion unter Verwendung der Methode des hängenden Tropfens gezüchtet, indem 1 µl Proteinlösung (8 mg ml−1 Ecm16, 10 mM MgCl2, 1 mM ADP) mit 1 µl Äquilibrierungspuffer (0,1 M MES pH) gemischt wurden 6,5, 0,2 M Natriumthiocyanat und 12 % PEG (w/v) 20 K). Die Kristalle wurden vor dem Schockgefrieren in denselben Puffer überführt, der 20 % v/v Ethylenglykol enthielt.

Erste Röntgenbeugungsexperimente wurden an der Stanford Synchrotron Radiation Lightsource durchgeführt. Der endgültige Röntgenbeugungsdatensatz wurde an der Strahllinie 17-ID-B der Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory, gesammelt und mit autoPROC24 verarbeitet. Der molekulare Austausch wurde unter Verwendung der PHASER25- und UvrA2-Struktur (PDB: 2VF7)15 als Suchmodell durchgeführt. Die Strukturverfeinerung wurde mit PHENIX26 und REFMAC27 durchgeführt. Die Modellerstellung erfolgte mit COOT28 mit alternativen Verfeinerungssitzungen mit PHENIX26.

Das für die Expression in B. choshinensis optimierte Codon-ecm16-Gen wurde synthetisiert (GenScript) und unter Verwendung der BamHI- und XbaI-Stellen in den pUC19-Vektor eingefügt. pNI, ein Shuttle-Vektor zwischen B. choshinensis und E. coli, wurde von Takara Bio erworben. Der pNI-Vektor befindet sich unter dem P2-Promotor, einem Teil der 5'-Sequenz stromaufwärts des Zellwandproteins, das in B. choshinensis stark exprimiert wird. ecm16 wurde gemäß dem oben beschriebenen Ligationsprotokoll in den pNI-Vektor eingefügt. Ligationsprodukte wurden in chemisch kompetente E. coli DH5α-Zellen transformiert und über Nacht auf LB-amp-Platten (50 µg ml−1) bei 37 °C gezüchtet. Der ecm16_pNI-Klon wurde durch einen Restriktionsenzymverdau mit BamHI und XbaI verifiziert. Die Plasmide ecm16_pNI oder pNI wurden in B. choshinensis unter Verwendung der New Tris-PEG (NTP)-Methode gemäß den Richtlinien des Herstellers (Takara Bio)29 transformiert. Kurz gesagt, 100 ng Plasmid, gemischt mit Lösung A (Takara Bio), wurden dem kompetenten B. choshinensis-Zellpellet zugesetzt und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Als nächstes wurde PEG-haltige Lösung B zugegeben, verwirbelt und zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in MT-Medium resuspendiert und anschließend 3 Stunden lang bei 37 ° C inkubiert. Die Zellen wurden dann auf MT-Agarplatten mit Neomycin (50 µg ml−1) ausplattiert und über Nacht bei 37 °C kultiviert. 4–5 Kolonien wurden in 3 ml 2SYNm-Flüssigmedium inokuliert und 48 Stunden lang bei 30 °C unter Orbitalschütteln bei 120 U/min gezüchtet. Die Zellen wurden zentrifugiert und die Zellpellets in 1 × Phosphatpuffer (100 mM Natriumphosphat bei pH 7,0) resuspendiert. Die Expression von Ecm16 in B. choshinensis wurde durch SDS-PAGE-Analyse bestätigt.

Stammlösungen von 908 µM Echinomycin (MilliporeSigma) und 864 µM Thiocoralin (Cayman Chemical) wurden in Methanol hergestellt. Stammlösungen von 805 µM Chinaldopeptin (Cayman Chemical) und 819 µM Sandramycin (Cayman Chemical) wurden in DMSO hergestellt. Für Wachstumskurven- und biochemische Studien wurden alle Verbindungen mit H2O verdünnt. Für E. coli-Wachstumskurvenexperimente wurden Kulturen über Nacht in LB-Flüssigmedium, ergänzt mit 30 µg ml−1 Ampicillin, bei 37 °C und 200 U/min gezüchtet. Die gesättigte Kultur wurde mit einer 0,2 %igen Arabinoselösung 30 Minuten lang induziert und zum Animpfen von 2 ml doppelten Replikatproben mit 0,02 OD600 in 13-mm-Glasröhrchen verwendet. OD600-Messungen wurden 6 Stunden lang alle 30 Minuten durchgeführt. Für die Wachstumsprofilierung von B. choshinensis in 2SYNm-Medien wurde OD600 mit einem Multi-Well-Plattenlesegerät (Synergy HT, BioTek) gemessen. Typischerweise wurden 3 µl der Übernachtkultur mit einer OD600 von 1,0–1,2 verwendet, um eine Vertiefung mit 200 µl frischem 2SYNm-Medium zu beimpfen, und das Wachstum wurde alle 30 Minuten 10 Stunden lang in einer Platte mit 96 Vertiefungen überwacht.

PAGE-gereinigtes 32-bp-DNA-Substrat (Integrated DNA Technologies) wurde in Annealing-Puffer (30 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM Kaliumacetat) gelöst. Diese DNA enthielt die 5'-ACGT-3'-Echinomycin-Bindungsstelle (Tabelle S2). Der Echinomycin-DNA-Komplex wurde durch Inkubation von Echinomycin und DNA im Molverhältnis von 1,1:1 gebildet. Verschiedene Konzentrationen von gereinigtem Ecm16, Ecm16-ΔID, Ecm16* (0, 100, 200 und 300 nM) wurden mit 50 nM DNA im inkubiert Vorhandensein oder Fehlen von Echinomycin im Bindungspuffer (50 mM HEPES, pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,1 mg ml−1 Rinderserumalbumin) für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Die Reaktionsmischung wurde in einem 6 %igen nativen Polyacrylamidgel bei 4 °C unter Verwendung von 1 × TBE (40 mM Tris-Acetat, 0,5 mM EDTA) als Laufpuffer für 30 Minuten bei 40 mA aufgetrennt. Die Gele wurden mit 1× SYBR-Gold-Nukleinsäurefärbung in 1× TBE-Puffer gefärbt und mit einem Ultraviolett-Transilluminator (Azure c200) abgebildet.

Mit Fluorescein markiertes 32-bp-DNA-Oligonukleotid (Integrated DNA Technologies) wurde in Bindungspuffer (50 mM HEPES, pH 7,5, 50 mM NaCl) gelöst und auf eine Endkonzentration von 50 nM in die Reaktionsvertiefung aliquotiert. Gereinigtes Ecm16 oder Ecm16-ΔID oder Ecm16* in Gegenwart oder Abwesenheit von Echinomycin wurde seriell in Bindungspuffer verdünnt und jeder Reaktionsvertiefung bis zu einem Endvolumen von 100 µl in einer Konzentration von 4 bis 512 nM zugesetzt. Um die Änderung der Lichtpolarisation der FAM-markierten DNA zu erkennen, wurden Fluoreszenzmessungen in einem 384-Well-Format auf einer schwarzen Platte mit geringem Volumen (Corning) unter Verwendung eines Plattenlesegeräts Synergy HT (BioTek) mit Anregungs- und Emissionswellenlängen von 490 durchgeführt nm bzw. 520 nm. Die angegebenen Polarisationswerte sind der Durchschnitt aus drei unabhängigen Experimenten. Die Daten wurden im Graph Pad Prism 5 unter Verwendung der Hill-Gleichung analysiert. Die berechneten Dissoziationskonstanten (KD) sind in Tabelle 3 aufgeführt.

Die ATPase-Aktivität gereinigter Proteine wurde mit dem EnzChek™ Phosphat-Assay-Kit (Thermo Fisher) bestimmt. In diesem Assay wird anorganisches Phosphat, das durch ATP-Hydrolyse entsteht, von der Purinnukleosidphosphorylase (PNP) genutzt, um 2-Amino-6-mercapto-7-methylpurin (MESG) in Ribose-1-phosphat und 2-Amino-6-mercapto-7 umzuwandeln -Methylpurin. Die Produktbildung wird durch Messung der Absorption bei 360 nm verfolgt. Vor dem ATPase-Assay wurde Echinomycin mit 32-bp-DNA im Molverhältnis 1,1:1 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Gereinigtes Ecm16 (0,2 µM) wurde mit 1 µM DNA oder Echinomycin-DNA-Komplex bei verschiedenen ATP-Konzentrationen (0,125, 0,325, 0,75, 1,0, 1,5 und 2,0 µM) in Reaktionspuffer (50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM NaCl, 10) inkubiert mM MgCl2). MESG-Substrat (200 µM) und PNP-Enzym (500 µM) wurden hinzugefügt und die UV-Absorption bei 360 nm wurde alle 30 s mit einem Mikroplattenlesegerät (Synergy HT, BioTek) bei 22 °C gemessen. Um die optische Dichte bei 360 nm in die Menge an abgebautem ATP umzurechnen, wurde eine Kalibrierungskurve erstellt, indem OD360 nm mit Phosphatstandards aufgetragen wurde.

Die Ecm16-Koordinaten und Strukturfaktoren wurden in der Proteindatenbank mit dem Zugangscode 7SH1 hinterlegt.

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Wir danken Dr. Marcin Nowotny für die Bereitstellung des Expressionsplasmids für Thermotoga maritima UvrA. Röntgenbeugungsdaten wurden an der Advanced Photon Source und an der Stanford Synchrotron Radiation Lightsource gesammelt. Advanced Photon Source, eine Benutzereinrichtung des DOE Office of Science, die vom Argonne National Laboratory unter der Vertragsnummer DE-AC02-06CH11357 für das DOE Office of Science betrieben wird. Die Nutzung der Stanford Synchrotron Radiation Lightsource, SLAC National Accelerator Laboratory, wird vom US Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences unter der Vertragsnummer DE-AC02-76SF00515 unterstützt. Das SSRL Structural Molecular Biology Program wird vom DOE Office of Biological and Environmental Research sowie von den National Institutes of Health und dem National Institute of General Medical Sciences (einschließlich P41GM103393) unterstützt. Diese Arbeit wurde durch den University of Texas System STARs Award (C.-YK), Projects of International Cooperation in Shaanxi Province of China 2023-GHYB-08 (XC), Open Project Program des State Key Tumor Biology Laboratory CBSKL2022KF13 (XC) unterstützt ).

Chu-Young Kim

Aktuelle Adresse: Department of Biochemistry, School of Molecular and Cellular Biology, University of Illinois Urbana-Champaign, Urbana, IL, USA

Abteilung für Chemie und Biochemie, The University of Texas at El Paso, El Paso, TX, USA

Priyanka Gade, Anwar Ullah und Chu-Young Kim

Abteilung für Mikrobiologie, School of Molecular and Cellular Biology, University of Illinois Urbana-Champaign, Urbana, IL, USA

Amanda Erlandson und Paola E. Mera

Schlüssellabor für synthetische und natürliche Funktionsmoleküle des Bildungsministeriums, Hochschule für Chemie und Materialwissenschaften, Nordwestuniversität, Xi'an, 710127, China

Xi Chen

Stanford Synchrotron Radiation Lightsource, SLAC National Accelerator Laboratory, Menlo Park, CA, USA

Irimpan I. Mathews

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PG, AU, XC, IIM und C.-YK führten Röntgenkristallographieexperimente durch. PG, AE, PEM und C.-YK führten biochemische und zelluläre Studien durch. PEM und C.-YK konzipierten und überwachten die Studie und analysierten die Daten. PG und C.-YK haben das Manuskript unter Mitwirkung aller Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Paola E. Mera oder Chu-Young Kim.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Gade, P., Erlandson, A., Ullah, A. et al. Strukturelle und funktionelle Analysen des Echinomycin-Resistenz verleihenden Proteins Ecm16 aus Streptomyces lasalocidi. Sci Rep 13, 7980 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34437-9

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Eingegangen: 14. September 2022

Angenommen: 29. April 2023

Veröffentlicht: 17. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34437-9

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