Struktur

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 7724 (2022) Diesen Artikel zitieren

2175 Zugriffe

2 Zitate

1 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Ein wesentlicher Schritt bei der bakteriellen Transformation ist die Aufnahme von DNA in das Periplasma, durch die dicke Peptidoglycan-Zellwand grampositiver Bakterien oder die äußere Membran und dünne Peptidoglycanschicht gramnegativer Bakterien. Für diesen Aufnahmeschritt ist ComEA erforderlich, ein DNA-bindendes Protein, das in transformierbaren Bakterien weit verbreitet ist. Hier bestimmen wir Röntgenkristallstrukturen von ComEA aus zwei grampositiven Arten, Bacillus subtilis und Geobacillus stearothermophilus, und identifizieren eine Domäne, die in gramnegativen Bakterien fehlt. Röntgenkristallographische, genetische und analytische Ultrazentrifugationsanalysen (AUC) zeigen, dass diese Domäne die ComEA-Oligomerisierung vorantreibt, die unserer Ansicht nach für die Transformation erforderlich ist. Wir verwenden Multiwellenlängen-AUC (MW-AUC), um die Wechselwirkung zwischen DNA und der ComEA-DNA-Bindungsdomäne zu charakterisieren. Abschließend präsentieren wir ein Modell für die Wechselwirkung der ComEA-DNA-Bindungsdomäne mit DNA, was darauf hindeutet, dass die ComEA-Oligomerisierung eine Zugkraft erzeugen könnte, die die DNA-Aufnahme durch die dicken Zellwände grampositiver Bakterien vorantreibt.

Die natürliche Transformationskompetenz ist ein Mechanismus des horizontalen Gentransfers, der sowohl bei grampositiven als auch gramnegativen Bakterien sowie bei einigen Archaeen weit verbreitet ist (Übersichten siehe 1,2). Der Transformationsprozess besteht aus zwei Hauptschritten: Aufnahme und Transport (Abb. 1A). Unter Aufnahme versteht man die Bewegung umwelttransformierender DNA (tDNA) in das Periplasma, durch die dicke Peptidoglycan-Zellwand grampositiver Bakterien oder die äußere Membran und die dünne Peptidoglycanschicht gramnegativer Bakterien. Transport ist die anschließende Translokation einzelsträngiger tDNA vom Periplasma zum Zytoplasma, wo sie mit dem Chromosom rekombinieren kann, um einen Transformanten zu erzeugen. Die hier vorgestellten Struktur-Funktions-Studien konzentrieren sich auf den ersten Schritt, die DNA-Aufnahme.

A Der Tpilus besteht aus ComGC, für dessen Zusammenbau die ATPase ComGA erforderlich ist. Es wird angenommen, dass der Tpilus am Membranprotein ComGB verankert ist. Der Tpilus bindet schwach an die DNA und zieht sich zurück, um sie in das Periplasma zu ziehen. Hier trifft die DNA auf ComEA, das die Bindung an die Zelle stabilisiert und die weitere Aufnahme der DNA vorantreibt. ComEC soll einen DNA-Strang abbauen und den Kanal für den DNA-Transport in das Zytoplasma bereitstellen. B-Domänenarchitektur von ComEA aus einem repräsentativen grampositiven Bakterium, B. subtilis. C-Domänenarchitektur von ComEA aus einem repräsentativen gramnegativen Bakterium, V. cholerae. Die Reste 1–24 sind nicht dargestellt, um die Tatsache hervorzuheben, dass sie ein vorhergesagtes Sekretionssignal umfassen, das gespalten wird, um reifes ComEAVc zu erzeugen, das frei im Periplasma diffundiert. TM, vorhergesagte Transmembranregion. Die magentafarbene Linie bezeichnet einen Bereich unbekannter Funktion, der in dieser Studie behandelt wird. HhH, Helix-Haarnadel-Helix-Motive. Die Nummerierung der Rückstände entspricht ComEABs oder ComEAVc. Elemente der Figur wurden mit BioRender.com erstellt.

Die Aufnahme wird an der Zelloberfläche eingeleitet, wenn tDNA mit einem Transformationspilus (tpilus) interagiert. Nach diesem Kontakt mit dem Tpilus wird die Bewegung der tDNA in das Periplasma durch ihre Wechselwirkung mit dem weithin konservierten periplasmatischen Protein ComEA gesteuert (Abb. 1A). ComEA wurde bei genetischen Screenings auf Transformationsdefizite bei Bacillus subtilis entdeckt. Anschließend wurde gezeigt, dass es sich um ein unspezifisches DNA-bindendes Protein handelt, das sowohl für die stabile Bindung von tDNA an die Zelle als auch für die tDNA-Aufnahme erforderlich ist3,4. Bei B. subtilis und anderen grampositiven Bakterien ist ComEA über eine N-terminale Transmembranregion an die Membran gebunden4. Dieser Membrananker und eine C-terminale DNA-Bindungsdomäne sind durch eine Region unbekannter Funktion getrennt, die aus ~110 Aminosäuren besteht (Abb. 1B). Im krassen Gegensatz dazu enthält ComEA in den Gram-negativen Zellen nur eine einzige (eigenständige) DNA-Bindungsdomäne, die frei im Periplasma diffundieren kann5,6,7 (Abb. 1C).

Sowohl bei gramnegativen als auch bei positiven Bakterien, mit Ausnahme von Helicobacter pylori8, wird die Aufnahme durch Typ-4-Pili initiiert, die DNA binden und sich zurückziehen, wodurch ein Segment der transformierenden DNA in das periplasmatische Kompartiment gezogen wird9,10. Es wurde vorgeschlagen, dass bei den Gram-negativen Vibrio cholerae und Neisseria gonorrhoeae das Einzeldomänen-ComEA dann an dieses eingeführte tDNA-Segment bindet und so den Verlust von tDNA durch Rückwärtsdiffusion über die äußere Membran verhindert6,11. Somit leitet der Pilus die Aufnahme ein, während ComEA als Brownsche Ratsche fungiert12 und die treibende Kraft für die Aufnahme des Großteils der tDNA in das Periplasma liefert. Bei allen Bakterien wird nach der Aufnahme in das Periplasma ein tDNA-Strang abgebaut und der verbleibende Strang wird durch den ComEC-Membrankanal zum Zytoplasma transportiert (siehe Abschnitt 1, 2). Bei Grampositiven scheinen die membranassoziierte ATPase ComFA und ihr Partnerprotein ComFC die Energie für den Transport bereitzustellen. Äquivalente gramnegative Proteine ​​wurden nicht identifiziert.

Die komplexe Struktur und Membranverankerung von ComEA in den Gram-positiven Zellen legen nahe, dass es möglicherweise anders wirkt als der einfache Brownsche Ratschenmechanismus, der für V. cholerae und N. gonorrhoeae vorgeschlagen wurde. Um diese komplexe Struktur zu untersuchen und Einblicke in ihre Wirkungsweise zu gewinnen, führten wir eine In-vitro- und In-vivo-Struktur-Funktions-Untersuchung durch, die sich auf das B. subtilis-Protein konzentrierte. Hier präsentieren wir Röntgenkristallstrukturen von ComEA aus B. subtilis (ComEABs) und Geobacillus stearothermophilus (ComEAGs) zusammen mit ergänzenden genetischen und biophysikalischen Analysen. Diese Studien zeigen, dass die DNA-Bindungsdomäne eine atypische Helix-Haarnadel-Helix-Domäne ist und, was am wichtigsten ist, dass eine bisher nicht identifizierte Domäne innerhalb der grampositiven ComEA-Region mit unbekannter Funktion liegt. Wir zeigen, dass diese Domäne die Oligomerisierung von ComEA vorantreibt und dass Oligomerisierung für die genetische Transformation erforderlich ist. Wir postulieren, dass die unerwartete Rolle der ComEA-Oligomerisierung bei der DNA-Aufnahme durch die DNA-Protein-Kondensation erklärt wird, die eine treibende Kraft für die tDNA-Aufnahme durch die dicke Zellwand grampositiver Bakterien darstellt.

Um mechanistische Einblicke in die Funktion von ComEA zu erhalten, haben wir die Röntgenkristallstrukturen von ComEABs und ComEAGs mit einer Auflösung von 3,20 Å bzw. 3,05 Å geklont, überexprimiert, gereinigt und bestimmt (Abb. 2A, 2B und Tabelle S1). Für die DNA-Bindungsdomäne oder Linkerregion von ComEABs war keine Elektronendichte erkennbar, es gab jedoch eine klare Dichte, die einer zuvor unbeschriebenen Domäne (Aminosäuren 60–122) entsprach (Abb. 2A). Es gibt sieben dieser Domänen, die Kopf an Schwanz in der kristallografischen asymmetrischen Einheit des ComEABs angeordnet sind, und wir haben diese Region als Oligomerisierungsdomäne (OD) bezeichnet (Abb. 2A).

A) Röntgenkristallstruktur von ComEABs. Dargestellt ist eine asymmetrische Einheit mit sieben Protomeren. Pfeile zeigen hier nur auf drei der sechs Multimerisierungsschnittstellen in der asymmetrischen Einheit. B) Röntgenkristallstruktur von ComEAGs. Dargestellt ist eine asymmetrische Einheit mit zwei Protomeren.

Im Gegensatz zu ComEABs gab es in der ComEAGs-Struktur eine interpretierbare Elektronendichte, die nicht nur der OD (Aminosäuren 62–124), sondern auch einer DNA-Bindungsdomäne (Aminosäuren 143–207) pro asymmetrischer Einheit entsprach, die zwei OD enthielt Protomere waren wieder Kopf-an-Schwanz angeordnet (Abb. 2B). Da es keine interpretierbare Elektronendichte gibt, die der ComEAGs-Linkerregion (Aminosäuren 125–142) ​​eines der beiden Protomer entspricht, ist nicht bekannt, welches der OD-Monomere im OD-Dimer der asymmetrischen Einheit mit der einzelnen modellierten DNA-Bindungsdomäne verbunden ist. Tatsächlich konnten wir die DNA-Bindungsdomäne in der ComEAGs-Struktur nur modellieren, weil sie zufällige Kristallkontakte herstellte. Aus den ComEA-Strukturen schließen wir, dass die Linkerdomäne flexibel ist, dass es nur minimale Kontakte zwischen der OD und den DNA-Bindungsdomänen gibt und dass die ODs das Potenzial haben, in Lösung Multimere zu bilden.

Wir stellen fest, dass die OD-Multimerisierung über die asymmetrische Einheit hinausgeht (Abb. 2A, B). Genauer gesagt nutzt die siebengliedrige asymmetrische Einheit in der ComEABs-Struktur die OD-Multimerisierungsschnittstelle, um einen 14-gliedrigen Kopf-Schwanz-Ring um die kristallographische zweizählige Achse zu bilden (Abb. 3A, B). In ähnlicher Weise zeigt die Untersuchung der Symmetriepartner in der ComEAGs-Struktur, dass die zweigliedrige asymmetrische Einheit die OD-Multimerisierungsschnittstelle nutzt, um eine geknickte Ringspirale entlang der kristallographischen Schraubenachse zu bilden, die 12 Kopf-Schwanz-Protomere pro Windung enthält (Abb. 3C, D). Eine leichte Neigung zwischen ComEAGs-Protomeren (Abb. S1) hat minimale Auswirkungen auf die ComEA-Inter-Dimer-Bindungen, führt jedoch dazu, dass ComEAGs innerhalb der Kristalle einen geknickten Ring statt eines geschlossenen Rings bilden.

A und B Vorder- bzw. Seitenansicht des kristallographischen Rings von ComEABs. C und D Vorder- bzw. Seitenansicht des kristallographisch geknickten Rings des ComEAG. E Schematische Darstellung der ComEAGs-Multimerisierungsschnittstelle. Die ComEA-Ketten A und B werden als blaue bzw. braune Bindungen dargestellt. Wasserstoffbrückenbindungen werden als grüne gestrichelte Linien dargestellt. Hydrophobe Kontakte werden als von den Halbkreisen und Kugeln ausgehende Linien dargestellt. Der Schaltplan wurde mit LigPlot+50 erstellt.

Die Aminosäuren der ComEA-Oligomerisierungsschnittstelle bleiben konserviert (Abb. S2) und vermitteln auffällige intermolekulare Wechselwirkungen zwischen den OD-Domänen der ComEA-Protomere, z. B. den Seitenketten der ComEAGs Arg85 und Asp113 (entsprechend den ComEABs Arg83 und Asp111), die intermolekulare Salzbrücken bilden ( Abb. 3E). Dies deutete darauf hin, dass ComEA nicht nur in den Kristallen, sondern auch in Lösung oligomerisieren könnte, und wir gingen dieser Möglichkeit nach.

Um zu bestätigen, dass die in beiden ComEA-Röntgenkristallstrukturen beobachtete OD eine reversible Selbstassoziation in Lösung vermittelte, analysierten wir verschiedene Konzentrationen von ComEAGs mithilfe der analytischen Ultrazentrifugation mit Sedimentationsgeschwindigkeit (SV-AUC)13. Bei 10,3 μM weist die Mehrzahl der ComEAGs einen Sedimentationskoeffizienten von 1,6 S auf, was mit dem ComEA-Monomer übereinstimmt. Allerdings weist die Mehrzahl der ComEAGs bei 157 μM einen Sedimentationskoeffizienten von 2,2 S auf, was auf eine reversible Dimerisierung als Funktion der Massenwirkung hindeutet (Abb. 4A). Bei einer Zwischenkonzentration von 31,3 μM beobachteten wir sowohl Monomer als auch Dimer und konnten die Sedimentationsgeschwindigkeitsdaten an ein diskretes Monomer-Dimer-Gleichgewichtsmodell anpassen13, was zu einem Kd von 33,8 μM führte (95 %-Konfidenzintervalle: 19,3 μM, 48,4 μM). ) (Tabelle S4). Die offensichtliche Dimerisierungsaffinität von ComEA ist wahrscheinlich eine Unterschätzung seiner Dimerisierungsaffinität in vivo, da die Diffusion von ComEA in vivo auf zwei Dimensionen in der Zellmembran beschränkt ist.

Überlagert ist eine integrale Sedimentationskoeffizientenverteilung, die das Dimerisierungspotential von ComEAGs bei 10,3 μM (rot) und 157 μM (grün) und ComEAGs-A108Y bei 11,3 μM (blau) und 124 μM (schwarz) vergleicht. Nur ComEAGs dimerisieren bei höherer Konzentration, während ComEAGs-A108Y Monomer bleibt. B Integrale Sedimentationskoeffizientenverteilungsüberlagerungen der ComEAGs OD bei 12,7 μM (Magenta) und 196 μM (Orange), die eine reversible Selbstassoziation zeigen. C Struktur von ComEAGs mit Kette A als Cartoon und Kette B als Oberfläche dargestellt. ComEAGs-Kette A Ala108 wurde zu Tyr mutiert und ist als magentafarbene Stäbchen dargestellt.

In Übereinstimmung mit der SV-AUC-Analyse von ComEAGs wurde auch ein verkürztes ComEAGs-Protein, das nur aus der OD bestand (ComEAGs-OD), in Lösung multimerisiert (Abb. 4B). Allerdings bildete ComEAGs-OD bei niedriger Konzentration (12,7 μM) hauptsächlich Monomere und Dimere und bei hoher Konzentration (196 μM) größere Oligomere mit einer maximalen Molmasse um 100 kDa (Abb. S3). Eine mögliche kinetische Erklärung für die unterschiedlichen multimeren Zustände von ComEAGs und ComEAGs-OD bei ähnlichen Konzentrationen besteht darin, dass das Vorhandensein der DNA-Bindungsdomäne von ComEAGs die OD-Multimerisierungssuche verlangsamt, Kollisionen begrenzt und somit die OD-Multimerisierungsrate (kon) verlangsamt.

Um zu bestätigen, dass die ComEA-Multimerisierung durch die OD gesteuert wird, haben wir die Röntgenkristallstrukturen untersucht, um eine kleine Aminosäure zu identifizieren, die in der OD-Multimerisierungsschnittstelle verborgen ist und die wir durch eine größere Aminosäure ersetzen könnten, was zu sterischer Beanspruchung führt und die Multimerisierung unterbricht. Wir identifizierten ComEAGs Ala108 (entsprechend ComEABs Ala106) und ersetzten es durch Tyrosin (Abb. 3E, 4A, C und S4). Tatsächlich war ComEAGs-A108Y sowohl bei 11,3 μM als auch bei 124 μM monomer (Abb. 4A). Diese SV-AUC-Experimente zeigen, dass die OD die ComEA-Multimerisierung in Lösung vorantreibt, wie aus den Röntgenkristallstrukturen vorhergesagt.

Wir spekulierten außerdem, dass die Multimerisierung von ComEA eine wichtige Rolle bei seiner Interaktion mit DNA spielt. Um dies zu testen, verwendeten wir eine analytische Multiwellenlängen-Ultrazentrifugation (MW-AUC)14,15,16,17, um die Bindung von Wildtyp-ComEAGs und ComEAGs-A108Y an DNA zu messen. MW-AUC ist eine neuartige Technik, die die spektrale Trennung von Protein- und DNA-Spezies basierend auf ihren einzigartigen Absorptionsspektren ermöglicht. Folglich ist es möglich, die molare Stöchiometrie der gebildeten Komplexe zu messen und die Art der Makromoleküle zu identifizieren, die jede hydrodynamische Spezies bilden. Die hydrodynamischen Messungen hängen von der Molmasse und dem hydrodynamischen Radius jeder Spezies ab.

Um die Wechselwirkungen zwischen ComEA und doppelsträngiger DNA aufzuklären, haben wir Wildtyp- und mutiertes ComEA mit einem 14-bp-doppelsträngigen DNA-Duplex bei einem molaren Proteinüberschuss von 5:1 und 10:1 sowie einem Proteinüberschuss von 10:1 gemischt über einen 40-bp-doppelsträngigen DNA-Duplex (Abb. 5A – C und Tabelle S2). In allen Fällen wurde die DNA-Konzentration konstant bei 1,5 μM gehalten und es bildete sich ein wohldefinierter Komplex, wobei weniger als 10 % der DNA in der Lösung frei blieben. Das entfaltete DNA-Sedimentationsmuster lässt darauf schließen, dass in allen Fällen ein gesättigter, homogener Komplex gebildet wird. Wie erwartet, sequestrierte die DNA überschüssiges Protein, bis es vollständig besetzt war, und die 14-bp-Sequenz nahm weniger ComEA-Moleküle auf als die 40-bp-Sequenz.

A und B Mischungen 5:1 und 10:1 Molverhältnisse von Wildtyp-ComEAGs und ComEAGs-A108Y mit dem 14-bp-DNA-Molekül. Hier deuten die DNA-Signale immer noch auf eine vollständige Sättigung mit Protein hin, aber die Proteinsignale zeigen heterogenere Sedimentationskoeffizientenverteilungen, was mit einem schnelleren Austausch mit dem Protein-DNA-Komplex vereinbar ist, was auf eine schnellere Koff-Rate schließen lässt. Mehr als 90 % der DNA sind mit Protein komplexiert, wodurch sich die 14-bp-DNA-Verteilung von 2,0 S für die Kontrolle allein auf 3,3 S für den Mutanten und 3,9 S für den Wildtyp in Panel A verschiebt. In Panel B steigt sie an B. die Proteinkonzentration auf 10:1, verschiebt die DNA-Sedimentation für den Wildtyp geringfügig weiter auf etwa 4,0 S, während sie die DNA-Sedimentation beim Mischen mit der Mutante kaum beeinflusst. C Integrale Sedimentationskoeffizientenverteilungsüberlagerungen für die entfalteten Protein- und DNA-Signale aus der 10:1-Mischung aus ComEAGs und ComEAGs-A108Y mit 1,5 μM des 40-bp-DNA-Moleküls. Ungebundenes ComEA in Gegenwart von DNA sedimentiert gleichzeitig mit ComA in Abwesenheit von DNA. Auch hier verschieben sich mehr als 90 % des DNA-Signals von der Position der freien 40-bp-DNA bei 3,3 s zu einer homogenen Zusammensetzung bei 6,3 S für den Mutanten und 8,1 S für den Wildtyp, was auf eine Sättigung der DNA mit ComEA schließen lässt. Das ComEA-Signal folgt dem DNA-Signal genau, was auf eine enge Komplexbildung mit einer langsamen Koff-Rate schließen lässt. Für alle Diagramme werden Referenzkontrollen jedes einzelnen Moleküls als Kreise angezeigt (ComEA: rote Kreise, ComEA-A108Y: blaue Kreise, 14- oder 40-bp-DNA, wie angegeben: grüne Kreise), Symbole für Wechselwirkungen zwischen DNA und Wildtyp-Protein dargestellt als Quadrate (ComEA-Signal: orangefarbene Quadrate, DNA-Signal: dunkelgrüne Quadrate) und Wechselwirkungen zwischen ComEA-A108Y und DNA werden in Dreiecken dargestellt (ComEA-A108Y-Signal: olivgrüne Dreiecke, DNA-Signal: hellblaue Dreiecke).

Der Sedimentationskoeffizient des Komplexes war für Wildtyp und Mutante unterschiedlich und hing von der Länge der DNA ab. Der 14-bp-doppelsträngige DNA-Duplex sedimentierte isoliert bei 2,0 S, bildete jedoch einen 3,3 S-Komplex mit ComEAGs-A108Y und einen 3,9 S-Komplex mit Wildtyp-ComEAGs in der 5:1-Mischung (Abb. 5A). Für diese Mischung haben wir ein Protein:DNA-Verhältnis von ~3:1 für den mit ComEAGs gebildeten Komplex und ein Verhältnis von ~2:1 für den mit dem ComEAGs-A108Y-Protein gebildeten Komplex gemessen. Für die 10:1-Protein:DNA-Mischung wurde mit ComEAGs-A108Y ein etwas größerer 3,5 S-Komplex gebildet, mit Wildtyp-ComEAGs wurde ein 4,0 S-Komplex gebildet, und die Protein:DNA-Verhältnisse änderten sich nicht signifikant (Abb. 5B). .

Die 40-bp-DNA sedimentiert bei alleiniger Untersuchung bei 3,3 S, ergab jedoch beim Mischen im Verhältnis 10:1 mit ComEAGs-A108Y einen 6,3 S-Komplex, während die gleiche Mischung mit Wildtyp-ComEAGs einen 8,1 S-Komplex ergab (Abb. 5C). Bei der 40-bp-DNA war der Unterschied zwischen den Protein:DNA-Molverhältnissen der gebildeten Komplexe zwischen Wildtyp und Mutante ausgeprägter. Die Wildtyp-ComEAGs zeigten ein Verhältnis von etwa 7:1, aber der Komplex zwischen DNA und ComEAGs-A108Y ließ auf ein Verhältnis von etwa 4,7:1 schließen. Während die Genauigkeit dieser Verhältnisse von den geschätzten molaren Extinktionskoeffizienten in den gebildeten Komplexen abhängt, gibt es einen deutlichen Unterschied in der Menge an an DNA gebundenem ComEA für die Wildtyp- und Mutantenproteine.

Zusammenfassend lassen diese Ergebnisse darauf schließen, dass Wildtyp-ComEA, das zur Oligomerisierung fähig ist, größere Komplexe mit DNA bildet als die A108Y-Mutante. Die Oligomerisierung erleichtert das effiziente und kooperative Packen von ComEA auf DNA, was durch die Gelverschiebungsanalyse (siehe unten) weiter unterstützt wird.

Die Konservierung sowohl der ComEA-OD-Domäne selbst als auch der in der Multimerisierungsschnittstelle verborgenen Reste (Abb. S2 und 3E) in grampositiven Bakterien führte uns zu der Hypothese, dass die OD für die Transformation wichtig ist. Wir haben dies in vivo gemessen, indem wir die B. subtilis-Transformation in Stämmen verglichen, die Wildtyp-ComEABs enthalten; ComEABs-D111N, das eine konservierte intermolekulare Salzbrücke zwischen D111 und R83 unterbricht (entsprechend den ComEAGs Asp113 und Arg85, Abb. 3E); ComEABs-A106Y (entsprechend ComEAGs-A108Y), das, wie oben gezeigt, die OD-Multimerisierung sterisch blockiert (Abb. 4A, C); und ComEA-ΔOD, das eine Deletion der gesamten OD enthält, während sowohl die Transmembranregion als auch die DNA-Bindungsdomäne intakt bleiben. Im Vergleich zu Wildtyp-ComEABs reduzierte ComEABs-D111N die B. subtilis-Transformation um fast das Hundertfache (Abb. 6A). Noch auffälliger waren die Mutationen ComEABs-A106Y und ComEA-ΔOD, die die Transformation von B. subtilis um etwa das Tausendfache reduzierten, ein Phänotyp, der dem einer vollständigen comEA-Deletion entspricht. Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass die Wildtyp- und mutierten ComEA-Proteine ​​in B. subtilis ähnlich exprimiert wurden (Abb. 6B). Um zu bestimmen, ob die Mutante mit A106Y-Oligomerisierungsmangel ihre Wirkung auf die Transformation ausübt, indem sie die DNA-Aufnahme in das Periplasma verhindert, verwendeten wir Rhodamin-markierte tDNA, die in das Periplasma aufgenommen werden kann, aber die Zellmembran nicht passieren kann18. Wie in (Abb. 6C) gezeigt, verhindert die A106Y-Mutation eine stabile DNA-Assoziation mit kompetenzexprimierenden Zellen, die, wie wir zuvor gezeigt haben, eine Aufnahme in das Periplasma erforderte18. Wir kommen zu dem Schluss, dass die ComEA-Oligomerisierung eine unerwartete und notwendige Rolle bei der Transformation von B. subtilis und wahrscheinlich auch anderer grampositiver Bakterien spielt.

Alle Mutationen wurden in das Chromosom von BD9007 eingeführt, das eine kompetenzspezifische Fusion einer Sequenz trägt, die für das Cyan-fluoreszierende Protein (CFP) kodiert, das vom Promotor von comG exprimiert wird und am ektopischen AmyE-Locus platziert wird, um die Identifizierung von kompetenzexprimierenden Zellen zu ermöglichen Epifluoreszenzmikroskopie. Transformationsexperimente wurden als biologische Dreifachversuche durchgeführt und die durchschnittlichen Häufigkeiten, normalisiert auf die Wildtyp-Werte, werden als Balkendiagramme in Panel A mit den enthaltenen Datenpunkten aufgetragen. Die größere Anzahl an Datenpunkten für die Wildtyp-Kontrolle spiegelt die Einbeziehung dieses Stamms in allen drei biologischen Replikaten wider. Die mittleren normalisierten Werte mit Standardabweichungen für die Mutanten betrugen 0,0012 ± 0,00047 (ΔOD), 0,0,0005 ± 0,00024 (A106Y), 0,11 ± 0,03 (D111N). Die p-Werte wurden mithilfe zweiseitiger t-Tests ermittelt. Panel B zeigt Western Blots für die entsprechenden Wildtyp- und Mutantenextrakte unter Verwendung von Anti-GFP-Antiserum. ΔcomEA-Extrakte wurden als Kontrollen für die Identität der ComEA-Signale einbezogen. Panel C zeigt typische Epifluoreszenzbilder des Wildtyps (BD9007) und seines isogenen A106Y-Mutantenäquivalents nach 45-minütiger Transformation mit Rhodamin-markierter Lambda-Bakteriophagen-DNA. Kompetenzexprimierende Zellen wurden durch CFP-Fluoreszenz (pseudofarbenes Cyan) identifiziert und nachweisbare zellassoziierte Rhodamin-tDNA-Signale sind eingekreist. Beim Wildtyp zeigten 13 von 42 Zellen mindestens einen roten Punkt, während bei den 23 mutierten Zellen nur ein kaum erkennbarer zellassoziierter Punkt beobachtet wurde. Die großen roten Flecken im unteren Bereich stehen nicht im Zusammenhang mit Zellen und sind auf kontaminierendes fluoreszierendes Material unbekannter Herkunft zurückzuführen. Der Maßstabsbalken unten links im Bild entspricht 1 Mikrometer. Die Mikroskopie- und Western-Blot-Experimente in Panel B und C wurden jeweils dreimal mit nahezu ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die Röntgenkristallstruktur des ComEAG enthüllte nicht nur die Struktur des OD, sondern auch die dreidimensionale Form der ComEA-DNA-Bindungsdomäne. Wie aus der Sequenzanalyse vorhergesagt und bereits erwähnt6, enthält die ComEA-DNA-Bindungsdomänenstruktur zwei Helix-Haarnadel-Helix-Motive (HhH) (Abb. 1B und 7A). Strukturen kanonischer HhH-haltiger Proteine ​​zeigten, dass Paare von HhH-Motiven typischerweise durch eine α-Helix verbunden sind und diese fünf Helices zusammen als (HhH)2-Domänen bezeichnet werden19. Diese Linkerhelix, die die HhH-Motive verbindet, fehlt in ComEA auffällig und ihre beiden HhH-Motive sind stattdessen durch eine Schleife verbunden (Abb. 7B). Die ComEA-DNA-Bindungsdomäne ist daher eine atypische HhH-Domäne, die ohne Verwendung einer Verbindungshelix einen gut gefalteten und kompakten DNA-Bindungskern bildet.

A Ausrichtungen der HhH-Motive von ComEA-Proteinen, die von vier grampositiven (oben) und gramnegativen (unten) Bakterien exprimiert werden und für Transformationsstudien verwendet wurden. Die vier für die Mutagenese ausgewählten Lysinreste sind rot hervorgehoben. Sekundärstrukturzuordnungen wurden aus der Kristallstruktur von ComEAGs abgeleitet. B Modell der ComEAGs-DNA-Bindungsdomäne (α-Helices als Zylinder dargestellt) im Komplex mit dsDNA (als Stäbchen dargestellt). Die Schleife, die HhH1 und HhH2 verbindet, ist grün gefärbt. Wasserstoffbrückenbindungen sind als schwarze gestrichelte Linien dargestellt. Aus Gründen der Übersichtlichkeit sind ComEAGs im Komplex dargestellt, wobei 8 bp im Zentrum des Komplexes stehen und nicht die 15 bp, die bei der Verfeinerung verwendet wurden. C Transformationshäufigkeiten für die HhH-Motivmutanten. Transformationsexperimente wurden als biologische Dreifachversuche durchgeführt und durchschnittliche Häufigkeiten, normalisiert auf den Wildtyp (BD9007), werden als Balkendiagramme mit den enthaltenen Datenpunkten dargestellt. Die mittleren normalisierten Werte mit Standardabweichungen für die Mutanten betrugen 0,0054 ± 0,004 (K164A), 0,23 ± 0,066 (K193A), 0,54 ± 0,22 (K197A), 0,0031 ± 0,0025 (K199A). Die p-Werte wurden mithilfe zweiseitiger t-Tests ermittelt. D zeigt Western Blots für die Wildtyp- und mutierten ComEA-Proteine, die mit Anti-GFP-Antikörpern erhalten wurden. Dieses Western-Blot-Experiment wurde insgesamt dreimal mit nahezu identischen Ergebnissen wiederholt. E EMSA-Analyse von Wildtyp-ComEAGs, ComEA-K166A und ComEA-K201A. Die EMSA-Analyse wurde mindestens zweimal mit nahezu identischen Ergebnissen wiederholt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um die ComEA-DNA-Interaktion zu untersuchen, verwendeten wir Dali20 und HADDOCK 2.421, um ein ComEAGs-DNA-Modell zu erstellen (Abb. 7B). Zusätzlich zu den zahlreichen Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Stickstoffatomen des Proteinrückgrats und den DNA-Phosphatgruppen, wie HhH-Domänen typischerweise mit der DNA interagieren19,22, beobachteten wir, dass die Seitenketten von Lys166, Lys195 und Thr196 Wasserstoffbrückenbindungen mit DNA-Phosphatgruppen bildeten. Um die Bedeutung der ComEA-Seitenketteninteraktionen für die DNA-Bindung und die ComEA-Funktion zu verstehen, haben wir einige der entsprechenden Grenzflächenreste in ComEABs (z. B. ComEABs K164 und K193) zu Alanin mutiert und ihre Wirkung auf die Transformation in B. subtilis getestet (Abb. 7C). Darüber hinaus haben wir in Ermangelung einer experimentell bestimmten ComEA-DNA-Struktur die Möglichkeit in Betracht gezogen, dass das In-silico-Modell unvollständig war. Beispielsweise zeigt das ComEA-DNA-Modell keine möglichen Wechselwirkungen zwischen ComEA-DNA-bindenden Domänen, die auftreten könnten, wenn Oligomere von ComEA DNA binden. Daher haben wir zusätzliche ComEABs-Reste K197 und K199 (entsprechend den ComEAGs-Resten K199 und K201) zu Alanin mutiert und ihre Auswirkungen auf die Transformation in B. subtilis getestet.

Die ComEABs-Mutanten K164A, K193A, K197A und K199A wurden einzeln vom Chromosom in B. subtilis exprimiert und ihre Auswirkungen auf die Transformation wurden mit denen von Wildtyp-ComEA verglichen (Abb. 7C). Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass Wildtyp-ComEABs und die ComEABs-Proteine, die Mutationen in den HhH-Motiven enthalten, in ähnlichen Mengen exprimiert wurden (Abb. 7D). Diese In-vivo-Studien zeigten auch, dass die Mutationen K164A und K199A eine mehr als 2-log-Abnahme der Transformation verursachten (Abb. 7C), im Gegensatz zu den reproduzierbaren 2- bis 4-fachen Effekten von K193A und K197A.

Im ComEAGs-DNA-Modell kontaktiert der Rest K166 (entspricht ComEABs K164) die DNA. In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung und dem Funktionsverlust von ComEABs-K164 für die Transformation in vivo (Abb. 7C) bindet gereinigtes ComEAGs-K166A (Abb. S4) keine DNA, wie mithilfe eines elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungstests (EMSA) bestimmt wurde (Abb . 7E). Im ComEAGs-DNA-Modell hingegen kommt der Rest K201 (entspricht ComEABs K199) nicht mit der DNA in Kontakt (Abb. 7B). ComEABs-K199A zeigt jedoch in vivo einen Funktionsverlust (Abb. 7C), und das gereinigte Äquivalent ComEAGs-K201A (Abb. S4) zeigte in vitro nur eine etwa zweifache Abnahme der scheinbaren DNA-Bindungsaffinität (Abb . 7E). Wir vermuten, dass der ComEAGs-Rest K201 (ComEABs-Rest K199) Wechselwirkungen zwischen ComEA-Molekülen vermitteln kann, wenn sie DNA binden oder an DNA-Bindungswechselwirkungen teilnehmen, die im ComEAGs-DNA-Modell nicht erkennbar sind.

Während zusätzliche Strukturstudien erforderlich sein werden, um die Details der intermolekularen Wechselwirkungen zwischen ComEA-ComEA und ComEA-DNA innerhalb eines ComEA-DNA-Komplexes zu konkretisieren, scheint ComEABs K164 eine zentrale Rolle zu spielen. Unter allen in unseren Studien bewerteten Rückständen ist ComEABs K164 sowohl bei Gram-Positiven als auch bei Gram-Negativen der am besten konservierte (Abb. 7A und S2). Tatsächlich ist es in ComEA mindestens genauso gut konserviert wie die Signaturreste des HhH-Motivs. Das Blokesch-Labor zeigte, dass der äquivalente V. cholerae-Rest, K63, eine wichtige Rolle in diesem Organismus spielt, und In-silico-Modellierungen legten nahe, dass er möglicherweise mit DNA6 in Kontakt kommt, wie es in unserer Studie der Fall zu sein scheint (Abb. 7B).

Zusätzlich zur Lokalisierung wichtiger Reste für die DNA-Bindung weisen die EMSAs mit Wildtyp-ComEAGs und mit dem K201A-Mutantenprotein (Abb. 7E) Hinweise auf Kooperativität auf, was mit OD-OD-Wechselwirkungen zwischen an DNA gebundenen ComEA-Molekülen übereinstimmt. Bei mittleren Konzentrationen von Proteinmolekülen existiert vollständig verschobene DNA mit nicht verschobener und teilweise verschobener Sonde. Eine ähnliche bimodale Verteilung wurde in EMSA-Experimenten für SSB berichtet, ein weiteres unspezifisches DNA-Bindungsprotein mit dokumentiertem kooperativen Bindungsverhalten23.

Diese Studie präsentiert mehrere bemerkenswerte Ergebnisse. Erstens haben wir die Existenz einer Multimerisierungsdomäne in ComEA von B. subtilis und G. stearothermophilus nachgewiesen, die auch in anderen ComEA-Proteinen mit mehreren Domänen, die von Gram-Positiven kodiert werden, sichtbar ist (Abb. S2 und 8A). Unsere AUC-Ergebnisse bestätigen, dass die aus der Kristallstruktur abgeleitete Oligomerisierungsgrenzfläche für die Dimerisierung von ComEA wichtig ist, und das Vorhandensein von Ringstrukturen in Kristallen sowohl von ComEABs als auch von ComEAGs sowie ein SV-AUC-Experiment mit der isolierten OD zeigen, dass sich ComEA bilden kann erweiterte Multimere in vivo (Abb. 3A – D, Abb. 4B). Wie durch MW-AUC bestimmt, bilden Wildtyp und ComEA-A108Y DNA-Komplexe mit unterschiedlichen Molverhältnissen, da die DNA-Bindung die Oligomerisierung von ComEA begünstigt, indem sie die Proteinmoleküle in eine enge Annäherung bringt und so einen kooperativen Effekt bewirkt. Die in Abb. 6E dargestellten EMSA-Ergebnisse liefern einen weiteren starken Beleg für die kooperative DNA-Bindung. Während es verlockend ist zu spekulieren, dass die ComEA-Multimerisierung in vivo Ringe erzeugt, wie sie in den Kristallstrukturen beobachtet werden, gibt es dafür keine Beweise.

Schließlich haben wir gezeigt, dass sowohl die Oligomerisierung als auch die DNA-bindenden HhH-Motive für die DNA-Aufnahme in das Periplasma erforderlich sind (Abb. 6 und 7). Wir haben zuvor gezeigt, dass ComEA eine wichtige Rolle in B. subtilis spielt4,18. Obwohl die anfängliche Bindung der tDNA an die transformierbare Zelle an einem oberflächenexponierten tpilus erfolgt, ist diese Bindung labil. Wenn eine tDNA-Schleife in das Periplasma gezogen wird, vermutlich durch Zerlegung des Tpilusfilaments9, wird die Assoziation der tDNA mit der Zelle stabil, da ComEA die DNA-Aufnahme in das Periplasma vermittelt18. Bei Neisseria gonorrheae und V. cholerae wurde die entsprechende Rolle von ComEA bei der Aufnahme überzeugend einem Brownschen Ratschenmechanismus zugeschrieben5,6,11,12,24, bei dem die Bindung an DNA eine retrograde Diffusion verhindert. Jetzt haben wir gezeigt, dass die DNA-Bindungsaktivität von ComEA zwar tatsächlich für die Transformation erforderlich ist, was mit einer einfachen Ratsche übereinstimmt, dies gilt jedoch auch für die Oligomerisierung, was auf einen komplexeren Prozess als nur die Gleichrichtung der Diffusion hindeutet. Eine attraktive und überprüfbare Möglichkeit besteht darin, dass die gleichzeitige Interaktion von ComEA-Molekülen untereinander und mit tDNA eine Kondensation der DNA-Protein-Komplexe verursacht und so eine treibende Kraft für die Aufnahme darstellt (Abb. 8B). Dies würde den kürzlich für die Wechselwirkungen von DNA mit dem FoxA1-Transkriptionsfaktor und dem FUS-Protein25,26 berichteten Kondensationen ähneln, die beide DNA binden und auch Selbstinteraktionen zeigen.

Ein ComEABs enthält eine N-terminale Transmembranregion, eine bisher nicht identifizierte OD und eine C-terminale DNA-Bindungsdomäne. B Wir haben gezeigt, dass ComEA sich selbst mithilfe von Kontakten in seinen ODs assoziiert. Nach dem Zurückziehen des Tpilus, um eine DNA-Schleife in das Periplasma zu bringen, stabilisiert die Bindung der tDNA an die ComEA-DNA-Bindungsdomänen und die anschließende Aufnahme die Zellassoziation, während die Vernetzung distaler DNA-Segmente durch Bindung an benachbarte ComEA-Moleküle die eingehende tDNA kondensiert , wodurch eine Zugkraft ausgeübt wird, um tDNA in das Periplasma zu bringen. Elemente der Figur wurden mit BioRender.com erstellt.

Bei der Betrachtung der ComEA-tDNA-Kondensation als krafterzeugende Maschine muss die Geometrie von ComEA innerhalb des Periplasmas berücksichtigt werden. Die DNA-Bindungs- und Oligomerisierungsdomänen sind durch flexible Linker mit 20–25 Resten verbunden und die OD ist durch einen weiteren Linker mit etwa 60 Resten von der periplasmatischen Membranoberfläche getrennt (Abb. 8A). Somit gibt es erhebliche Freiheitsgrade für die beiden Domänen innerhalb des Periplasmas. Diese Mobilität könnte ein wichtiger Bestandteil des vorgeschlagenen Kondensationsmechanismus sein, der es benachbarten ComEA-Molekülen ermöglicht, über ihre ODs miteinander in Kontakt zu treten, während sie über ihre DNA-Bindungsdomänen mit verschiedenen Segmenten der tDNA in Kontakt treten und so die tDNA effektiv vernetzen und kondensieren (Abb. 8B). ). Wir schlagen daher vor, dass ComEA in grampositiven Bakterien möglicherweise nicht einfach eine Brownsche Ratsche ist, sondern als krafterzeugendes Protein für die Aufnahme von tDNA fungiert.

Ein Vergleich der Gram-positiven und Gram-negativen ComEA-Moleküle wirft zwei Fragen auf: Warum haben sich ComEABs als Membranprotein entwickelt, während ihre Einzeldomänen-Orthologen frei im Periplasma diffundieren können, und warum enthalten nur die Gram-positiven ComEA-Proteine ein Nicken? Die erste Frage lässt sich möglicherweise durch das Fehlen einer äußeren Membran bei Gram-Positiven beantworten. Durch die Membranverankerung wird die Diffusion und der Verlust kleiner Proteine ​​durch die Zellwand verhindert. Tatsächlich sind einige ligandenbindende Proteine, z. B. solche, die Aminosäuren zur Aufnahme binden, im Periplasma gramnegativer Bakterien diffundierbar, in grampositiven Bakterien jedoch membranverankert27,28,29. Das Vorhandensein einer OD nur in den Gram-positiven Zellen kann auch auf einen Unterschied in der Oberflächenstruktur im Vergleich zu den Gram-negativen Zellen zurückzuführen sein. Bei gramnegativen Bakterien kann die Diffusion der transformierenden DNA durch die charakteristisch dünne Zellwand schnell genug sein, damit eine Brownsche Ratsche einen effizienten Eintritt in das Periplasma bewirken kann. Aber Kontakte der transformierenden DNA mit dem notwendigen Kanal im dicken Peptidoglycan von Gram-positiven können ein Reibungshindernis für die Diffusion darstellen, was zusätzliche Zugkraft erfordert. Dieses intuitive Konzept wird durch eine Studie gestützt, die zeigt, dass die Diffusionsrate durch einen Kanal verringert wird, wenn der Kanal länger gemacht wird30.

comEA (Codons 58–205) wurde aus genomischer DNA des B. subtilis-Stammes 168 unter Verwendung von Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs) und His6-BsuF- und His6-BsuR-Primern PCR-amplifiziert (Tabelle S2). Das amplifizierte Insert wurde in die NcoI- und XhoI-Restriktionsstellen von pET28b mit einem His6-Tag am C-terminalen Ende kloniert, wodurch Expressionsvektor-pComEABs erzeugt wurden. Mit pComEABs transformierter E. coli BL21(D3E) wurde bei 37 °C in LB-Medium bis zu einer OD von 0,6 in Gegenwart von 30 μg/ml Kanamycin unter konstantem Schütteln bei 200 U/min gezüchtet. Die ComEABs-Expression wurde dann mit 0,5 mM Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert und über Nacht bei 18 °C gezüchtet. Anschließend wurden die Zellen pelletiert und in Lysepuffer A (30 mM Tris-HCl [pH 8,0], 150 mM NaCl, 10 % Glycerin), ergänzt mit 20 μg/ml DNase, resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden mit einer French Press lysiert und das Lysat durch einstündige Zentrifugation bei 61.000 xg und 4 °C geklärt. Das geklärte Lysat wurde auf His-60-Harz (Takara) geladen, das mit Puffer B (30 mM Tris-HCl [pH 8,0], 150 mM NaCl, 20 mM Imidazol) äquilibriert war. Das Harz wurde mit Puffer C (30 mM Tris HCl [pH 8,0], 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol) und dann mit Puffer B gewaschen. Um restliche DNA zu entfernen, wurde das Harz mit Puffer D (30 mM Tris HCl [pH 8,0]) inkubiert 8,0], 150 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 und 20 μg/ml DNase) bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Das Harz wurde mit Puffer B gewaschen und das Protein wurde mit Puffer B, der 500 mM Imidazol enthielt, eluiert. Die Proteinreinheit wurde mittels SDS-PAGE analysiert. Fraktionen, die ComEABs enthielten, wurden über Nacht gegen Puffer E (30 mM Tris-HCl [pH 8,0], 50 mM NaCl) dialysiert und auf eine mit Puffer E äquilibrierte Source 15Q-Säule geladen. Das Protein wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von Puffer E und Puffer F eluiert ( 30 mM Tris HCl [pH 8,0], 1 M NaCl) über 20 Säulenvolumina. Die gereinigten ComEABs enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt und unter Verwendung eines 3-kDa-MWCO-Zentrifugalkonzentrators konzentriert. Das konzentrierte Protein wurde auf eine Superdex200 10/300-Gelfiltrationssäule (GE Healthcare) geladen, die mit Puffer G (15 mM Citrat [pH 4,5], 100 mM NaCl) äquilibriert war. Das eluierte Protein wurde unter Verwendung eines 3-kDa-MWCO-Zentrifugalfiltergeräts konzentriert und bei –80 ° C gelagert.

comEA (Codons 58–205) wurde synthetisiert (Codon optimiert für die Expression in E. coli (Genscript, Inc.)) und in pET28b kloniert, um pComEABs-A101M, T126M mit einem C-terminalen His6-Tag und den Mutationen A101M und T126M zu produzieren. Eine Primärkultur über Nacht wurde in 1X LB über Nacht bei 37 °C in Gegenwart von 30 μg/ml Kanamycin gezüchtet und bei 200 U/min geschüttelt. Die Zellen wurden durch 15-minütige Zentrifugation bei 4500 xg geerntet. Das Zellpellet wurde zweimal mit SeMET-Basismedium (SelenoMethionine Medium Base Plus Nutrient Mix – Molecular Dimensions) gewaschen und schließlich in 10 ml SeMet-Medium mit 50 mg/l Selenomethionin resuspendiert und eine sekundäre SeMet-Mediumkultur wurde beimpft. Diese Kultur wurde bei 37 °C bis zu einer OD von 0,6 gezüchtet, wonach 0,5 mM IPTG zugegeben wurde, um die ComEABs-Expression zu induzieren. Die Zellen wurden weitere 16 Stunden bei 18 °C gezüchtet und dann durch 15-minütige Zentrifugation bei 4500 xg pelletiert. Mit Selenomethionin derivatisierte ComEABs wurden dann unter Verwendung des gleichen Protokolls gereinigt, das für native ComEABs beschrieben wurde.

comEAGs (Codons 60–207) wurden aus der genomischen DNA von Geobacillus stearothermophilus (ATCC 7953) unter Verwendung von Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs) mit His-Sumo-Gsth_F- und His-Sumo-Gsth_R-Primern PCR-amplifiziert (Tabelle S2). . Die Gibson Assembly-Methode (New England Biolabs) wurde verwendet, um das amplifizierte PCR-Produkt in den pTB146-Vektor zwischen den SapI- und XhoI-Stellen zu klonen. Das resultierende Konstrukt pComEAGs hatte einen His-Sumo-Tag an seinem N-Terminus. Positive Klone wurden durch DNA-Sequenzierung verifiziert.

His-Sumo-ComEAGs wurden in E. coli BL21(DE3) überexprimiert. Die Kulturen wurden in LB-Medium bei 37 °C in Gegenwart von 100 μg/ml Ampicillin bis zu einer OD600 von 0,6 gezüchtet. Die His-Sumo-ComEAGs-Expression wurde durch Zugabe von 0,5 mM IPTG und anschließendes Wachstum über Nacht bei 18 °C induziert. Die Zellen wurden dann pelletiert und in Lysepuffer A (30 mM Tris-HCl [pH 8,0], 150 mM NaCl, 10 % Glycerin), ergänzt mit 20 μg/ml DNase (Goldbio), resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden in einer French Press lysiert und das Lysat durch einstündige Zentrifugation bei 61.000 xg und 4 °C geklärt. Das geklärte Lysat wurde auf His-60-Harz (Takara) geladen, das mit Puffer B (30 mM Tris-HCl [pH 8,0], 150 mM NaCl, 20 mM Imidazol) äquilibriert war. Das Harz wurde mit Puffer C (30 mM Tris HCl [pH 8,0], 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol) und dann mit Puffer B gewaschen. Um restliche DNA zu entfernen, wurde das Harz mit Puffer D (30 mM Tris HCl [pH 8,0]) inkubiert 8,0], 150 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 und 20 μg/ml DNase) bei 23 °C für 30 Min. Das Harz wurde mit Puffer B gewaschen und das Protein wurde mit Puffer B, der 500 mM Imidazol enthielt, eluiert. Die Proteinreinheit wurde mittels SDS-PAGE analysiert. Der His-Sumo-Tag wurde dann durch Zugabe von 1,5 mg/ml His-Ulp1 zu ComEAGs entfernt, gefolgt von einer Dialyse gegen Puffer E (30 mM Tris-HCl [pH 8,0], 50 mM NaCl) über Nacht bei 4 °C. Gespaltenes His-Sumo und His-Ulp1 wurden entfernt, indem die Probe über frisches His-60-Ni-Harz (Takara) geleitet wurde. Die gespaltenen ComEAGs ohne His-Sumo-Tag wurden gepoolt und auf eine mit Puffer E (30 mM Tris HCl [pH 8,0], 50 mM NaCl) äquilibrierte Source 15Q-Säule geladen. Das Protein wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von Puffer E und Puffer F (30 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1.000 mM NaCl) über 20 Säulenvolumina eluiert. ComEAGs, die nach Source 15Q erhalten wurden, enthielten immer noch Verunreinigungen, die mit einer 5-ml-Hitrap-Heparin-HP-Säule (Cytiva) entfernt wurden, die mit Puffer E (30 mM Tris-HCl [pH 8,0], 50 mM NaCl) äquilibriert worden war. Das Protein wurde mit einem linearen Gradienten von 20 Säulenvolumina Puffer E und Puffer F (30 mM Tris HCl [pH 8,0], 1 M NaCl) eluiert. Fraktionen, die reines ComEA enthielten, wurden gepoolt und dann in einer 3-kDa-MWCO-Zentrifugalfiltervorrichtung konzentriert. Das konzentrierte Protein wurde durch Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung einer Superdex200 10/300-Säule (GE Healthcare), die mit Puffer G (10 mM Tris [pH 8], 100 mM KCl) äquilibriert worden war, weiter gereinigt. Die ComEAGs wurden dann mit einem 3-kDa-MWCO-Zentrifugalfiltergerät konzentriert und bei –80 °C gelagert.

comEAGs-OD (Codons 60–122) wurde aus der genomischen DNA von Geobacillus stearothermophilus (ATCC 7953) unter Verwendung von Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs) mit His-Sumo-Gsth_F- und His-Sumo-OD_R-Primern PCR-amplifiziert (Tabelle S2). Die Gibson Assembly-Methode (New England Biolabs) wurde verwendet, um das amplifizierte PCR-Produkt in den pTB146-Vektor zwischen den SapI- und XhoI-Stellen zu klonen. Das resultierende Konstrukt pComEAGs-OD hatte einen His-Sumo-Tag an seinem N-Terminus. Positive Klone wurden durch DNA-Sequenzierung verifiziert. ComEAGs-OD wurde unter Verwendung des gleichen Protokolls gereinigt, das für Wildtyp-ComEAGs beschrieben wurde.

ComEAGs-A108Y, ComEAGs-K166A und ComEAGs-K201A wurden unter Verwendung eines ortsspezifischen Q5-Mutagenese-Kits (New England Biolabs) mit den in Tabelle S2 beschriebenen mutagenen Oligonukleotiden erzeugt. Positive Klone wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt. ComEAGs-A108Y, ComEAGs-K166A und ComEAGs-K201A wurden unter Verwendung des gleichen Protokolls gereinigt, das für Wildtyp-ComEAGs beschrieben wurde. Die Wildtyp- und mutierten ComEA-Proteine ​​zeigten identische Löslichkeiten und verhielten sich während der Reinigung ähnlich (Abb. S4). In Übereinstimmung mit der Unfähigkeit zur Dimerisierung führte die A108Y-Mutation dazu, dass ComEAGs 0,40 ml später als Wildtyp-ComEAGs auf der mit Puffer G (10 mM Tris [pH 8], 100 mM KCl) äquilibrierten Superdex200 10/300-Säule (GE Healthcare) eluierten. wie oben beschrieben.

Kristalle von ComEABs-A101M, T126M und ComEABs erschienen innerhalb von zwei bis drei Tagen, wuchsen innerhalb einer Woche zur Reife und wurden durch die Dampfdiffusionsmethode durch Mischen von 1 μl ComEABs (10 mg/ml) mit einem gleichen Volumen Mutter erhalten Laugenlösung mit 22 % PEG 500 und 0,1 M Succinat [pH 5,5] bei 20 °C. Die Kristalle wurden dann mit der gleichen Mutterlaugelösung, ergänzt durch 10 % Glycerin, kryogeschützt.

Röntgendaten wurden mit Blu-Ice 5 an der Strahllinie 14–1 der Stanford Synchrotron Radiation Lightsource (SSRL) bei kryogener Temperatur unter Verwendung eines MAR-Mosaik-325-CCD-Detektors gesammelt. Beugungsdaten für Kristalle von ComEABs-A101M, T126M und ComEABs wurden bei 0,97900 Å bzw. 0,97946 Å gesammelt. Die Daten wurden mit dem HKL-Softwarepaket31 verarbeitet. Autosol32 wurde verwendet, um die Position der ComEABs-A101M,T126M-Se-Atome zu lokalisieren (Gütefaktor = 0,36) und ein erstes Modell wurde erstellt. Dieses Modell wurde verwendet, um Phasen für die native ComEABs-Struktur durch molekularen Ersatz in Phaser33 zu erhalten. Anschließend wurde das Modell manuell in COOT34 erstellt und mit phenix.refine35 anhand der nativen Beugungsdaten verfeinert. Zu den ersten Verfeinerungsrunden gehörten simuliertes Tempern, individuelle Atomkoordinaten und B-Faktor-Verfeinerung. Nachfolgende Verfeinerungsrunden verwendeten individuelle Atomkoordinaten, individuelle B-Faktoren und TLS-Verfeinerungen. Das endgültige Modell enthielt die Elektronendichte der Reste 59 oder 60–122. Wir haben keine Elektronendichte beobachtet, die dem manipulierten Start-Met entspricht; oder ComEA-Reste 58, 59 (von Kette G), 123–205; oder das manipulierte C-terminale His-Tag. Die Ramachandran-Statistiken für ComEABs ergaben 95,84 % Befürworter, 4,16 % Begünstigte und 0,00 % Ausreißer und wurden mit Molprobity36 berechnet. Strukturvisualisierung und molekulare Grafiken wurden in PyMOL37 erstellt.

ComEAG-Kristalle erschienen typischerweise innerhalb von 2–3 Tagen, reiften innerhalb einer Woche zur Reife und wurden durch die Dampfdiffusionsmethode mit sitzendem Tropfen bei 20 °C erhalten. ComEAGs mit 10 mg/ml wurde mit einem gleichen Volumen Mutterlauge, enthaltend 30 % PEG 400 und 0,1 M Ammoniumnitrat, gemischt. Röntgendaten wurden intern mit StructureStudio 2.4.6 und einem rotierenden Kupferanoden-Röntgengenerator Rigaku Micro/Max-007HF mit einem Rigaku RAXIS-IV + +-Detektor bei Raumtemperatur gesammelt. Beugungsdaten für Kristalle von ComEAGs wurden bei 1,5418 Å gesammelt. Die Daten wurden mit dem HKL-Softwarepaket31 verarbeitet. Erste Phasen wurden durch molekularen Austausch in Phaser33 erhalten, wobei die Teilstruktur von ComEABs als Suchmodell verwendet wurde. Das ComEAGs-Modell wurde in COOT34 erstellt und mit phenix.refine35 verfeinert. Zu den ersten Verfeinerungsrunden gehörten simuliertes Tempern, individuelle Atomkoordinaten und B-Faktor-Verfeinerung. Nachfolgende Verfeinerungsrunden verwendeten individuelle Atomkoordinaten, individuelle B-Faktoren und TLS-Verfeinerungen. Das endgültige Modell enthielt die Elektronendichte der Reste 62–124 (in den Ketten A und B) und 143–207 (in der Kette A). Wir haben keine Elektronendichte beobachtet, die dem manipulierten Start-Met entspricht; Reste 60–61, 125–142 oder 143–207 (in Kette B). Die Ramachandran-Statistiken für ComEAGs ergaben 96,76 % Befürworter, 2,70 % Begünstigte und 0,54 % Ausreißer und wurden mit Molbrobity36 berechnet. Strukturvisualisierung und molekulare Grafiken wurden in PyMOL37 erstellt.

Sedimentationsgeschwindigkeitsexperimente (SVEs) messen den Massentransport von Makromolekülen in einem Zentrifugalkraftfeld in Lösung, beobachten die Sedimentations- und Diffusionseigenschaften aller Spezies in einer Mischung und geben deren Teilkonzentrationen, schwimmende Molmassen und Formfaktoren an. Sedimentation und Diffusionstransport in der Ultrazentrifugationszelle werden durch die Lamm-Gleichung beschrieben, die mithilfe adaptiver Finite-Elemente-Methoden gelöst wird38,39. Die in SV-Experimenten erhaltenen gesamten Randdaten werden durch lineare Kombinationen solcher Lösungen mithilfe fortschrittlicher Optimierungsroutinen40,41,42 angepasst, die rechenintensiv sind und auf Hochleistungsrechnerplattformen43 ausgeführt werden. SVEs wurden in einem Beckman Coulter Optima AUC am Canadian Centre for Hydrodynamics der University of Lethbridge durchgeführt. Die Daten wurden mittels UV-Detektion mit einer oder mehreren Wellenlängen gesammelt. 0,45 ml Probe wurden in Doppelsektor-Epon-Kohle-Mittelstücke mit Saphirfenstern gefüllt und im Intensitätsmodus gemessen. Alle Experimente wurden bei 20 °C und in einem Puffer mit 10 mM Tris [pH 8] und 100 mM KCl durchgeführt. ComEAGs-OD wurde bei 37 krpm gemessen. ComEAGs und DNA wurden bei 60 krpm gemessen. MW-AUC-Daten der 14-bp-DNA-Sequenz wurden bei 55 krpm gemessen, während MW-AUC-Daten der 40-bp-DNA-Sequenz bei 43 krpm erfasst wurden. MW-AUC-Daten wurden im Bereich von 235–285 nm in Schritten von 2 nm aufgezeichnet, was 26 einzelne Datensätze für jede Probe lieferte. Alle Daten wurden mit UltraScan 4.044 analysiert. Die Verarbeitung von MW-AUC-Daten wird ausführlich in Henrickson et al., 202214 beschrieben. Kurz gesagt, Daten von jeder Wellenlänge wurden mithilfe der zweidimensionalen Spektrumanalyse (2DSA)40 analysiert, wobei dem in45 beschriebenen Arbeitsablauf gefolgt wurde. Nach der Erzeugung zeitsynchroner SVEs wird das hydrodynamische Profil spektral in die molaren Extinktionskoeffizientenprofile von Protein und DNA zerlegt. Pufferdichte- und Viskositätskorrekturen wurden mit UltraScan unter Verwendung der Teilkonzentration jeder Pufferkomponente berechnet. Molare Extinktionsprofile wurden bestimmt, indem für jedes Protein und jede DNA separate Verdünnungsreihen durchgeführt und mit einem Genesys 10 s-Tischspektrophotometer (Thermo Fisher Scientific) ein Absorptionsspektrum über den interessierenden Spektralbereich (220–300 nm) gesammelt wurde. Die Verdünnungsreihe jedes Absorptionsspektrums wurde wie zuvor beschrieben an ein intrinsisches Extinktionsprofil angepasst44. Die resultierenden intrinsischen Extinktionsprofile wurden auf die molare Konzentration skaliert, wobei ein Extinktionskoeffizient von 7.450 M-1 cm-1 bei 280 nm für ComEAGs-A108Y und 5.960 M-1 cm-1 bei 280 nm für ComEAGs verwendet wurde (geschätzt durch UltraScan anhand der Proteinsequenz). ). Diffusionskorrigierte Sedimentationskoeffizientenprofile wurden mithilfe der in UltraScan46 implementierten erweiterten Van Holde-Weischet-Analyse erstellt. Van Holde-Weischet-Ergebnisse werden als G(s)-Integralverteilungsdiagramme dargestellt, die die integrierte Konzentration einer sedimentierenden Art auf der y-Achse anzeigen. Wie in den Abb. dargestellt. In den Abbildungen 4 und 5 sind alle Konzentrationen zwischen 0 und 100 % des Grenzsignals normalisiert. Diese Ergebnisse legen einen Kd für das Monomer-Dimer-Gleichgewicht zwischen 10 und 160 μM nahe. Um die Dissoziationskonstante für das Monomer-Dimer-Gleichgewicht von ComEAGs zu bestimmen, wurde ein Sedimentationsgeschwindigkeitsexperiment einer mittleren Beladungskonzentration (31,3 μM, gemessen bei 280 nm) unter Verwendung einer genetischen Algorithmus-Monte-Carlo-Analyse wie beschrieben an ein diskretes Monomer-Dimer-Modell angepasst in13 und42. Detaillierte Anpassungsergebnisse sind in Tabelle S4 aufgeführt.

Alle B. subtilis-Stämme wurden letztendlich vom Laborstamm 168 abgeleitet. Der unmittelbare Elternstamm war in allen Fällen IS75 (sein Leu met). Alle Stämme wurden durch Transformation konstruiert und sind in Tabelle S3 aufgeführt. Stämme sind auf Anfrage bei den Autoren erhältlich.

Ein E. coli-Plasmid (pED2232), beschrieben in 18, wurde mit EcoRI geschnitten, um ein 3045 bp großes Fragment freizusetzen, das ein YFP-comEA-Konstrukt trägt. Dieses Fragment wurde isoliert und in pDR1664 (ein Thr-Locus-Insertionsplasmid, das als freundliche Gabe von David Rudner erhalten wurde) kloniert und mit EcoRI geschnitten. Das Fragment enthielt 1.500 bp stromaufwärts der comEA-Kodierungssequenz, die den Promotor, die ribosomale Bindungsstelle und das Startcodon von comEA umfasst. Der Rest des Fragments enthält das YFP-Gen, fusioniert mit dem N-Terminus des offenen Leserahmens von comEA. Das resultierende Plasmid, pED2401, wurde mit PvuI linearisiert und in IS75 transformiert, wo es in den thr-Locus eingefügt wird. Der native offene Leserahmen von comEA wurde dann durch Einfügen eines Kanamycin-Resistenzkassetten-produzierenden Stammes BD9007 gelöscht.

Mutationen in ComEA wurden unter Verwendung des Plasmids pED2401 und eines Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit (New England Biolabs) konstruiert. Die mutagenen Oligonukleotide sind in Tabelle S2 aufgeführt. Nach der Verifizierung durch Sequenzierung des gesamten comEA-Leserahmens wurden die richtigen Plasmide mit PvuI linearisiert und zur Insertion in thr in BD5810 transformiert. Schließlich wurde der native comEA-Leserahmen wie oben beschrieben inaktiviert.

0,5 μg Bakteriophagen-Lambda-DNA (New England Biolabs) wurden mit dem Rhodamin TM-Reagenz Mirus Label-IT (Mirus Bio) gemäß den Empfehlungen des Herstellers markiert, mit der Ausnahme, dass viermal weniger Markierungsreagenz verwendet wurde. Anschließend wurde die DNA durch eine G50 MicroSpin-Säule (GE Healthcare) verarbeitet, um überschüssige Markierung zu entfernen.

Das Western-Blotting wurde unter Verwendung von Standardmethoden mit Semidry-Blotting durchgeführt, und die Nitrozellulose-Blots wurden unter Verwendung des Clarity Max Western ECL-Substrats (Bio-Rad) entwickelt. Die Bilder wurden mit einem Bio-Rad ChemiDoc MP-Imager aufgenommen. Eine 1:1000-Verdünnung von Anti-GFP-Antikörper (Thermofisher) wurde verwendet, um die YFP-ComEA-Signale aufzudecken. Kulturen zur Herstellung von Extrakten wurden bis zur Eignung gezüchtet und das Wachstum wurde in einem Klett-Kolorimeter überwacht. Nach der Sammlung durch Zentrifugation wurden die Zellen in leicht unterschiedlichen Volumina resuspendiert, um geringfügige Unterschiede in der Trübung auszugleichen und sicherzustellen, dass in jede Spur das gleiche Gesamtprotein geladen wurde. Da alle Stämme ein ektopisches Gen trugen, das für nicht fusioniertes YFP kodierte, war in jeder Spur eine interne Beladungskontrolle vorhanden.

Alle Bacillus subtilis-Stämme wurden mit der 2-Stufen-Methode bis zur Kompetenz gezüchtet und wie zuvor beschrieben transformiert47. Die Transformationshäufigkeiten wurden anhand biologischer Triplikate unter Auswahl der Leucin-Prototrophie bestimmt.

0,2 μg/ml Rhodamin-markierte Bakteriophagen-Lambda-DNA wurde zu kompetenten Kulturen gegeben und 45 Minuten lang inkubiert. 100-μl-Proben wurden 2x mit Spizizen-Salzen gewaschen und in 100 μl Spizizen-Salzlösung resuspendiert48. 1 μl der transformierten Zellen wurde zur Mikroskopie auf ein dünnes Agarosepad aufgetragen.

Die Bilder wurden mit der Nikon Elements-Software und einem Nikon Ti-Mikroskop aufgenommen, das mit einem 100-fachen Plan Apo-Ölimmersionsobjektiv, NA 1,40, Anregungsquellen mit Leuchtdioden (LED) und einer Orca Flash 4.0-Kamera (Hamamatsu) ausgestattet war. Zur Datenerfassung und Bildanalyse kam Nikon Elements zum Einsatz.

Der Dali-Server20 identifizierte die DNA-gebundene Struktur von XPF (PDB ID 2BGW)49 als ähnlich zur DNA-Bindungsdomäne des ComEAG (Reste 143–207). Die ComEAGs-DNA-Bindungsdomäne wurde an XPF ausgerichtet, um das Startmodell der ComEAGs-DNA-Bindungsdomäne im Komplex mit 15 bp DNA zu erzeugen. Dieses Modell wurde in HADDOCK 2.4 unter Verwendung der flexiblen Verfeinerung im expliziten Lösungsmittelansatz21 verfeinert.

Elektrophoretische Mobilitätsverschiebungstests wurden wie zuvor beschrieben mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt6. Kurz gesagt, ComEAGs in den angegebenen Konzentrationen und 0,5 μM 30 bp DNA wurden in Puffer, der 10 mM Tris [pH 8], 100 mM KCl, 2,5 % Glycerin, 0,5 mM Ethylendiamintetraessigsäure und 1 mM MgCl2 enthielt, 15 Minuten lang bei Raumtemperatur gemischt. Anschließend wurden den Proben 0,5 Volumina Beladungsfarbstoff mit Bromphenolblau und 2,5 % Glycerin zugesetzt. Die Proben wurden dann sofort auf ein 8 %iges natives Polyacrylamidgel geladen, das zuvor bei 4 °C in 0,5-fachem TBE-Puffer getestet wurde. Die Gele wurden mit Ethidiumbromid gefärbt und mit einem Bio-Rad ChemiDoc MP-Imager gescannt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Atomkoordinaten und Strukturfaktoren für ComEABs und ComEAGs wurden in der Proteindatenbank unter den Zugangscodes 8DFK bzw. 8DSS hinterlegt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt. Alle AUC-Daten (primäre Sedimentationsgeschwindigkeitsdaten, angepasste Modellergebnisse und Berichte) werden in der UltraScan LIMS-Datenbank im Canadian Centre for Hydrodynamics gespeichert. Daten können auf Anfrage im Open-Source-OpenAUC-Format geteilt werden, das von UltraScan unterstützt wird (Cölfen H, Laue TM, Wohlleben W, Schilling K, Karabudak E, Langhorst BW, Brookes E, Dubbs B, Zollars D, Rocco M, Demeler B. The Offenes AUC-Projekt. Eur Biophys J. 2010 Feb;39(3):347-59. https://doi.org/10.1007/s00249-009-0438-9. Epub 2009, 19. März. PMID: 19296095; PMCID: PMC2812709 ., https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19296095/). Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Dubnau, D. & Blokesch, M. Mechanismen der DNA-Aufnahme durch natürlich kompetente Bakterien. Annu Rev. Genet 53, 217–237 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Johnston, C., Martin, B., Fichant, G., Polard, P. & Claverys, JP Bakterielle Transformation: Verteilung, gemeinsame Mechanismen und unterschiedliche Kontrolle. Nat. Rev. Microbiol 12, 181–196 (2014).

Artikel CAS Google Scholar

Provvedi, R. & Dubnau, D. ComEA ist ein DNA-Rezeptor zur Transformation kompetenter Bacillus subtilis. Mol. Microbiol 31, 271–280 (1999).

Artikel CAS Google Scholar

Inamine, GS & Dubnau, D. ComEA, ein integrales Membranprotein von Bacillus subtilis, das für die genetische Transformation benötigt wird, wird sowohl für die DNA-Bindung als auch für den DNA-Transport benötigt. J. Bakteriol. 177, 3045–3051 (1995).

Artikel CAS Google Scholar

Gangel, H. et al. Konzertierte räumlich-zeitliche Dynamik von importierter DNA und ComE-DNA-Aufnahmeprotein während der Gonokokkentransformation. PLoS Pathog. 10, e1004043 (2014).

Artikel Google Scholar

Seitz, P. et al. ComEA ist für den Transfer externer DNA in das Periplasma in natürlich transformierbaren Vibrio cholerae-Zellen unerlässlich. PLoS Genet 10, e1004066 (2014).

Artikel Google Scholar

Seitz, P. & Blokesch, M. Der DNA-Transport durch die äußeren und inneren Membranen natürlich transformierbarer Vibrio cholerae ist räumlich, aber nicht zeitlich gekoppelt. mBio 5, https://doi.org/10.1128/mBio.01409-14 (2014).

Stingl, K., Müller, S., Scheidgen-Kleyboldt, G., Clausen, M. & Maier, B. Das zusammengesetzte System vermittelt die zweistufige DNA-Aufnahme in Helicobacter pylori. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 107, 1184–1189 (2010).

Artikel ADS Google Scholar

Ellison, CK et al. Die Retraktion von DNA-gebundenen Typ-IV-Kompetenz-Pili initiiert die DNA-Aufnahme während der natürlichen Transformation in Vibrio cholerae. Nat. Microbiol 3, 773–780 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Lam, T. et al. Kompetenzpili bei Streptococcus pneumoniae sind hochdynamische Strukturen, die sich zurückziehen, um die DNA-Aufnahme zu fördern. Mol. Microbiol 116, 381–396 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Hepp, C. & Maier, B. Die Kinetik der DNA-Aufnahme während der Transformation liefert Hinweise auf einen Ratschenmechanismus der Translokation. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 113, 12467–12472 (2016).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Peskin, CS, Odell, GM & Oster, GF Zellbewegungen und thermische Fluktuationen: die Brownsche Ratsche. Biophys. J. 65, 316–324 (1993).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Demeler, B., Brookes, E., Wang, R., Schirf, V. & Kim, CA Charakterisierung reversibler Assoziationen durch Sedimentationsgeschwindigkeit mit UltraScan. Makromol. Biowissenschaften. 10, 775–782 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Henrickson, A. et al. Analytische Multiwellenlängen-Ultrazentrifugation von Biopolymermischungen und -wechselwirkungen. Anal. Biochem 652, 114728 (2022).

Artikel CAS Google Scholar

Horne, CR, Henrickson, A., Demeler, B. & Dobson, RCJ Analytische Multiwellenlängen-Ultrazentrifugation als Werkzeug zur Charakterisierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in Lösung. EUR. Biophys. J. 49, 819–827 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Demeler, B. Messung molekularer Wechselwirkungen in Lösung mittels analytischer Multiwellenlängen-Ultrazentrifugation: Kombination von Spektralanalyse und Hydrodynamik. Biochem (Lond.) 41, 14–18 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Gorbet, GE, Pearson, JZ, Demeler, AK, Colfen, H. & Demeler, B. AUC der nächsten Generation: Analyse analytischer Ultrazentrifugationsdaten mit mehreren Wellenlängen. Methoden Enzymol. 562, 27–47 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Hahn, J., DeSantis, M. & Dubnau, D. Mechanismen der transformierenden DNA-Aufnahme in das Periplasma von Bacillus subtilis. mBio 12, e0106121 (2021).

Artikel Google Scholar

Shao, X. & Grishin, NV Gemeinsame Faltung in Helix-Haarnadel-Helix-Proteinen. Nucleic Acids Res 28, 2643–2650 (2000).

Artikel CAS Google Scholar

Holm, L. Verwendung von Dali zum Vergleich der Proteinstruktur. Methoden Mol. Biol. 2112, 29–42 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Honorato, RV et al. Strukturbiologie in den Wolken: Das WeNMR-EOSC-Ökosystem. Vordermol. Biowissenschaften. 8, 729513 (2021).

Artikel Google Scholar

Doherty, AJ, Serpell, LC & Ponting, CP Das Helix-Haarnadel-Helix-DNA-Bindungsmotiv: eine strukturelle Grundlage für die nicht-sequenzspezifische Erkennung von DNA. Nukleinsäuren Res. 24, 2488–2497 (1996).

Artikel CAS Google Scholar

Dubiel, K. et al. Strukturelle Mechanismen der kooperativen DNA-Bindung durch bakterielle einzelsträngige DNA-bindende Proteine. J. Mol. Biol. 431, 178–195 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Hepp, C. & Maier, B. Bakterielle Translokationsratschen: Gemeinsame physikalische Prinzipien mit unterschiedlichen molekularen Implementierungen: Wie bakterielle Sekretionssysteme die Brownsche Bewegung für eine effiziente Translokation von Makromolekülen beeinflussen. Bioessays 39, https://doi.org/10.1002/bies.201700099 (2017).

Renger, R. et al. Co-Kondensation von Proteinen mit einzel- und doppelsträngiger DNA. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 119, e2107871119 (2022).

Artikel CAS Google Scholar

Quail, T. et al. Krafterzeugung durch Protein-DNA-Cokondensation. Nat. Physik. 17, 1007–1012 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Hediger, MA Struktur, Funktion und Entwicklung von Transportern gelöster Stoffe in Prokaryoten und Eukaryoten. J. Exp. Biol. 196, 15–49 (1994).

Artikel CAS Google Scholar

Saurin, W. & Dassa, E. Sequenzbeziehungen zwischen integralen Innenmembranproteinen bindungsproteinabhängiger Transportsysteme: Evolution durch wiederkehrende Genduplikationen. Proteinwissenschaft. 3, 325–344 (1994).

Artikel CAS Google Scholar

Tam, R. & Saier, MH Jr. Strukturelle, funktionelle und evolutionäre Beziehungen zwischen extrazellulären Rezeptoren für die Bindung gelöster Stoffe von Bakterien. Microbiol Rev. 57, 320–346 (1993).

Artikel CAS Google Scholar

Tottori, S., Misiunas, K., Tshitoyan, V. & Keyser, UF Kanallängenabhängigkeit der Partikeldiffusionsfähigkeit im Einschluss. Soft Matter 17, 5131–5136 (2021).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Otwinowski, Z. & Minor, W. [20] Verarbeitung von im Oszillationsmodus gesammelten Röntgenbeugungsdaten. Methoden Enzymol. 276, 307–326 (1997).

Artikel CAS Google Scholar

Terwilliger, TC et al. Entscheidungsfindung bei Strukturlösungen mithilfe von Bayes'schen Schätzungen der Kartenqualität: der PHENIX AutoSol-Assistent. Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr 65, 582–601 (2009).

Artikel CAS Google Scholar

McCoy, AJ et al. Phaser-Kristallographiesoftware. J. Appl Crystallogr 40, 658–674 (2007).

Artikel CAS Google Scholar

Emsley, P. & Cowtan, K. Coot: Modellbauwerkzeuge für molekulare Grafiken. Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr 60, 2126–2132 (2004).

Artikel Google Scholar

Adams, PD et al. PHENIX: ein umfassendes Python-basiertes System zur Lösung makromolekularer Strukturen. Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr 66, 213–221 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Lovell, SC et al. Strukturvalidierung durch Calpha-Geometrie: Phi-, Psi- und Cbeta-Abweichung. Proteins 50, 437–450 (2003).

Artikel CAS Google Scholar

Schrodinger, LLC Das PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.4.

Cao, W. & Demeler, B. Modellierung analytischer Ultrazentrifugationsexperimente mit einer adaptiven Raum-Zeit-Finite-Elemente-Lösung der Lamm-Gleichung. Biophys. J. 89, 1589–1602 (2005).

Artikel CAS Google Scholar

Cao, W. & Demeler, B. Modellierung analytischer Ultrazentrifugationsexperimente mit einer adaptiven Raum-Zeit-Finite-Elemente-Lösung für Mehrkomponenten-Reaktionssysteme. Biophys. J. 95, 54–65 (2008).

Artikel CAS Google Scholar

Brookes, E., Cao, W. & Demeler, B. Eine zweidimensionale Spektralanalyse für Sedimentationsgeschwindigkeitsexperimente von Mischungen mit Heterogenität in Molekulargewicht und Form. EUR. Biophys. J. 39, 405–414 (2010).

Artikel Google Scholar

Brookes, EH & Demeler, B. in GECCO07: Genetic and Evolutionary Computation Conference. 361-368 (Association for Computing Machinery, New York, NY, USA, 2007).

Demeler, B. & Brookes, E. Monte-Carlo-Analyse von Sedimentationsexperimenten. Kolloidpolym. Wissenschaft. 286, 129–137 (2007).

Artikel Google Scholar

Brookes, E. & Demeler, B. Parallele Rechentechniken zur Analyse von Sedimentationsgeschwindigkeitsexperimenten in UltraScan. Kolloidpolym. Wissenschaft. 286, 139–148 (2008).

Artikel CAS Google Scholar

Demeler, B. & Gorbet, GE In Analytical Ultracentrifugation: Instrumentation, Software, and Applications (Hrsg. Uchiyama S., Arisaka F., Stafford WF & Laue T.) 119-143 (Springer Japan, 2016).

Demeler, B. Methoden zur Gestaltung und Analyse von Sedimentationsgeschwindigkeits- und Sedimentationsgleichgewichtsexperimenten mit Proteinen. Curr. Protokoll. Proteinwissenschaft. Kapitel 7, Einheit 7 13 (2010).

Google Scholar

Demeler, B. & van Holde, KE Sedimentationsgeschwindigkeitsanalyse hochheterogener Systeme. Anal. Biochem 335, 279–288 (2004).

Artikel CAS Google Scholar

Dubnau, D. & Davidoff-Abelson, R. Schicksal der transformierenden DNA nach Aufnahme durch kompetenten Bacillus subtilis. I. Entstehung und Eigenschaften des Spender-Empfänger-Komplexes. J. Mol. Biol. 56, 209–221 (1971).

Artikel CAS Google Scholar

Spizizen, J. Transformation biochemisch defizienter Bacillus Subtilis-Stämme durch Desoxyribonukleat. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 44, 1072–1078 (1958).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Newman, M. et al. Die Struktur einer XPF-Endonuklease mit und ohne DNA legt ein Modell für die Substraterkennung nahe. EMBO J. 24, 895–905 (2005).

Artikel CAS Google Scholar

Laskowski, RA & Swindells, MB LigPlot+: Diagramme mehrerer Ligand-Protein-Interaktionen für die Arzneimittelentwicklung. J. Chem. Inf. Modell 51, 2778–2786 (2011).

Artikel CAS Google Scholar

Referenzen herunterladen

Röntgenbeugungsdaten wurden an der Stanford Synchrotron Radiation Light Source gesammelt. Die Nutzung der Stanford Synchrotron Radiation Lightsource, SLAC National Accelerator Laboratory, wird vom US Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences unter der Vertragsnummer DE-AC02-76SF00515 unterstützt. Das SSRL Structural Molecular Biology Program wird vom DOE Office of Biological and Environmental Research und von den National Institutes of Health und dem National Institute of General Medical Sciences (P41GM103393) unterstützt. Für den Inhalt dieser Veröffentlichung sind ausschließlich die Autoren verantwortlich und geben nicht unbedingt die offiziellen Ansichten von NIGMS, NIAID oder NIH wieder. Diese Arbeit wurde durch den National Institutes of Health Grant R01 GM057720 (MBN und DD) unterstützt. Analytische Ultrazentrifugationsexperimente wurden vom Canada 150 Research Chairs-Programm (C150-2017-00015, BD), der Canada Foundation for Innovation (CFI-37589, BD), den National Institutes of Health (1R01GM120600, BD) und der Canadian Natural Science unterstützt und Engineering Research Council (DG-RGPIN-2019-05637, BD). Die Berechnungen des UltraScan-Supercomputers wurden durch den NSF/XSEDE-Zuschuss TG-MCB070039N (BD) und den Zuschuss TG457201 (BD) der University of Texas unterstützt. Der Canadian Natural Science and Engineering Research Council unterstützt AH durch ein Stipendium.

Abteilung für Mikrobiologie, Biochemie und Molekulargenetik, New Jersey Medical School, Rutgers Biomedical Health Sciences, Newark, NJ, 07103, USA

Ishtiyaq Ahmed, David Dubnau und Matthew B. Neiditch

Public Health Research Institute, Rutgers Biomedical Health Sciences, Newark, NJ, 07103, USA

Jeanette Hahn & David Dubnau

Abteilung für Chemie und Biochemie, University of Lethbridge, Lethbridge, AB, T1K 3M4, Kanada

Amy Henrickson & Borries Demeler

Greehey Children's Cancer Research Institute, University of Texas Health in San Antonio, San Antonio, TX, 78229, USA

Faisal Tariq Khaja

Abteilung für Chemie und Biochemie, University of Montana, Missoula, MT, 59801, USA

Borries Demeler

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

MBN und DD konzipierten die Studie, entwarfen Experimente, analysierten Daten, akquirierten Fördermittel und verfassten das Manuskript mit Beiträgen aller Autoren, insbesondere BD und IAIA gereinigter ComEABs und ComEAGs; entwarf und führte die biochemischen und röntgenkristallographischen Untersuchungen von ComEA-Proteinen durch; führte eine bioinformatische Analyse von ComEA durch; analysierte Daten; und generierte Abbildungen und Tabellen. JH führte die B. subtilis-Transformationsstudien einschließlich der Western Blots durch. AH und BD haben die AUC- und MW-AUC-Experimente entworfen und durchgeführt und Abbildungen und Tabellen erstellt. FTK reinigte ComEABs, identifizierte die Kristallisationsbedingungen von ComEABs und sammelte native ComEABs-Beugungsdaten.

Korrespondenz mit David Dubnau oder Matthew B. Neiditch.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Ahmed, I., Hahn, J., Henrickson, A. et al. Struktur-Funktions-Studien zeigen, dass ComEA eine Oligomerisierungsdomäne enthält, die für die Transformation in grampositiven Bakterien essentiell ist. Nat Commun 13, 7724 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-35129-0

Zitat herunterladen

Eingegangen: 25. Juli 2022

Angenommen: 18. November 2022

Veröffentlicht: 13. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-35129-0

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Europäisches Biophysik-Journal (2023)

Europäisches Biophysik-Journal (2023)

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.