Bisher nicht charakterisierte rechteckige Bakterienstrukturen im Delfinmaul

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 2098 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Es bleibt noch viel zu erforschen hinsichtlich der Vielfalt nicht kultivierter, wirtsassoziierter Mikroben. Hier beschreiben wir rechteckige Bakterienstrukturen (RBS) im Maul von Großen Tümmlern. Die DNA-Färbung zeigte mehrere gepaarte Banden innerhalb der RBS, was auf das Vorhandensein von Zellen schließen lässt, die sich entlang der Längsachse teilen. Kryogene Transmissionselektronenmikroskopie und Tomographie zeigten parallele membrangebundene Segmente, bei denen es sich wahrscheinlich um Zellen handelt, die von einer S-schichtartigen periodischen Oberflächenbedeckung eingekapselt sind. RBSs zeigten ungewöhnliche pilusartige Anhängsel mit an den Spitzen gespreizten Fadenbündeln. Wir präsentieren mehrere Beweislinien, darunter die genomische DNA-Sequenzierung mikromanipulierter RBS, die 16S-rRNA-Gensequenzierung und die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, die darauf hindeuten, dass RBS bakteriell sind und sich von den Gattungen Simonsiella und Conchiformibius (Familie Neisseriaceae) unterscheiden, mit denen sie eine ähnliche Morphologie aufweisen und Teilungsmuster. Unsere Ergebnisse verdeutlichen die Vielfalt neuartiger mikrobieller Formen und Lebensstile, die auf eine Charakterisierung mit zur Genomik ergänzenden Werkzeugen wie der Mikroskopie warten.

Die frühesten Beschreibungen der mikrobiellen Welt konzentrierten sich auf die Morphologie und Motilitätsmuster von „Tieren“1. In den Jahrhunderten seit van Leeuwenhoeks revolutionärer Entdeckung wurde eine große Vielfalt mikrobieller Formen beschrieben, die von sternförmigen Bakterien der Gattung Stella2,3 bis zu den vielzelligen Fruchtkörpern der Ordnung Myxobacterales4,5 reicht. Morphologie ist ein biologisch wichtiges Merkmal, das oft stark konserviert ist und im Laufe der Zeit durch Selektionsdruck geformt wird, der sich aus der Lebensweise und dem Umweltkontext eines Organismus ergibt6. Tatsächlich spielt die Zellmorphologie eine wichtige Rolle bei der Motilität, der Nährstoffaufnahme, der Zellteilung und den Interaktionen mit anderen Zellen, einschließlich Symbiosen mit Wirten, die allesamt starke Überlebensfaktoren sind7. Daher bieten morphologische und strukturelle Studien einen attraktiven Weg, um Einblicke in mikrobielle Lebensformen und die Mechanismen zu gewinnen, mit denen Arten funktionieren und ihre Umgebung beeinflussen. Darüber hinaus bietet die Charakterisierung der Strukturen und Funktionen der vielfältigen Mikroben in unerforschten Zweigen des Lebensbaums die Möglichkeit, unser Verständnis der Evolution zu erweitern, und kann zu unzähligen Anwendungen in der Biotechnologie und Medizin führen, wie beispielsweise die Entwicklung der Optogenetik8 und CRISPR- basierende Genbearbeitung9.

Die Genomik dient als leistungsstarke Linse zur Beschreibung der mikrobiellen Welt. In den letzten Jahren haben metagenomische und einzelzellgenomische Analysen die Anzahl bekannter Abstammungslinien auf mikrobieller Stammebene in der Bakteriendomäne um fast das Vierfache erhöht10,11,12,13. Die Sequenzierung der Genome neu entdeckter Organismen hat zur Entdeckung neuer Funktionssysteme, Arten von Proteinvarianten und Lebensstilen geführt11,14,15,16,17 und verdeutlicht den Zusammenhang zwischen phylogenetischer Vielfalt und funktionellem Potenzial18. Allerdings ist die Anwendbarkeit solcher Ansätze meist auf Proteine ​​und Regulationssysteme beschränkt, die denen gut charakterisierter Organismen homolog sind; Die Vorhersage von Phänotypen und Funktionen, die wirklich neu sind und/oder deren genetische Grundlage unbekannt ist, erfordert im Allgemeinen ergänzendes Wissen. Angesichts der Zurückhaltung der meisten mikrobiellen Arten auf der Erde gegenüber Laborkultivierungen (im Jahr 2016 fehlten 72 % der Abstammungslinien auf etwa Stammebene ohne kultivierte Vertreter)19 bieten Methoden, die keine kultivierten Isolate erfordern, wie z. B. die Mikroskopie, einen attraktiven, ergänzenden Weg um neuartige morphologische und funktionelle Eigenschaften unkultivierter Abstammungslinien zu untersuchen. Jüngste Fortschritte in der kryogenen Elektronenmikroskopie (KryoEM) und Tomographie (KryoET) haben beispielsweise die dreidimensionale (3D) Abbildung intakter Bakterienzellen mit einer Auflösung von wenigen Nanometern ermöglicht20, was zu wichtigen Fortschritten bei der Entdeckung und Charakterisierung neuer Mikroben führte Strukturen21,22. Derzeit beschränken sich unsere Kenntnisse der Zellbiologie weitgehend auf die Beobachtung und das Experimentieren mit Bakterien, die kultiviert werden können, und daher gibt es in unserem Verständnis eine starke Verzerrung gegenüber Organismen, die das Wachstum unter Laborbedingungen fördern. Der Einsatz von Mikroskopie und nicht auf Sequenzierung basierenden Techniken zur Untersuchung der „nicht kultivierten Mehrheit“ wird für die Charakterisierung der gesamten Vielfalt der bakteriellen Lebensweisen, die sich entwickelt haben, von wesentlicher Bedeutung sein, insbesondere für Bemühungen zur Charakterisierung von Bakterien in relativ unerforschten Umgebungen, wie der Mundhöhle von Tümmlern Delfine (Tursiops truncatus), die eine reiche Sammlung neuartiger Mikroben und funktionellen Potenzials beherbergen16,23.

Trotz der Vielfalt mikrobieller Zellformen sind rechteckige Strukturen eine Seltenheit, deren genetische Grundlage kaum verstanden ist. Es gibt zwei Arten solcher Strukturen: einzelne Zellen, die rechteckig sind, und Zellaggregate, die Rechtecke bilden. Nach unserem besten Wissen war die Entdeckung nicht-eukaryotischer rechteckiger Zellen bisher auf die Familie der Halobacteriaceae beschränkt, die aus halophilen Archaeen besteht. Zu den bekannten rechteckigen Zellen dieser Familie gehören Haloquadratum walsbyi24, Haloarcula quadrata25 und Mitglieder der pleomorphen Gattung Natronrubrum26. Kürzlich wurde eine auf FtsZ basierende Spaltung beim würfelförmigen Fadenwurm-Symbionten Candidatus Thiosymbion cuboideus beobachtet27 und weitere rechteckige Zellen, von denen angenommen wird, dass sie bakteriell oder archaeisch sind, wurden in Umgebungen mit hohem Salzgehalt entdeckt, aber taxonomisch nicht identifiziert28. Unter eukaryotischen Mikroorganismen können Kieselalgen bei zweidimensionaler Betrachtung ein rechteckiges Aussehen haben, obwohl diese Zellen eher zylindrisch als rechteckige Prismen sind29. Eine Vielzahl von Bakterien bildet rechteckige Zellcluster, wie z. B. Schichten kokkoider Bakterien (z. B. Thiopedia rosea und die Gattung Merismopedia30), quaderförmige Strukturen kokkoider Bakterien (z. B. die Gattungen Sarcina und Eucapsis30) und rechteckige Trichome, die von scheibenförmigen Bakterien gebildet werden (z. B. Oscillatoria limosa und andere Cyanobakterien30).

Ebenfalls selten in der mikrobiellen Welt sind Zellen, die vom typischen Muster der Zellteilung entlang einer Querachse abweichen. Zwei spektakuläre Beispiele sind Candidatus Thiosymbion oneisti und Candidatus Thiosymbion hypermnestrae31,32,33, die ausschließlich auf der Oberfläche mariner Nematoden gefunden wurden. Es wird angenommen, dass dieses Teilungsmuster die Bindung an den Wirt aufrechterhält31,32. In ähnlicher Weise teilen sich Mitglieder der Familie Neisseriaceae der Gattungen Alysiella, Simonsiella und Conchiformibius in Längsrichtung, was vermutlich die Adhäsion an menschliche Epithelzellen in der Mundhöhle erleichtert34. Das Besondere an diesen Taxa ist außerdem, dass sie als mehrzellige Bakterien angesehen werden können. Weitere Beispiele für Bakterien, die eine Längsteilung durchlaufen, sind Spiroplasma poulsonii35 und die Gattung Candidatus Kentron, eine Gruppe von Symbionten, die vom Meereswimpertier Kentrophoros36,37 beherbergt werden. Ein solcher Einblick in die Fortpflanzungsmethoden verschiedener Bakterien ist für den Aufbau eines umfassenden Verständnisses der Zellbiologie unerlässlich.

Hier entdecken wir ungewöhnliche rechteckige Bakterienstrukturen (RBSs) in Mundproben von Delfinen und charakterisieren ihre zellulären Abmessungen und DNA-Muster mithilfe von Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopie. Regelmäßige DNA-Banden deuten darauf hin, dass es sich bei den Einheiten um Schichten einzelner Zellen handelt, die jeweils von einer inneren und äußeren Membran eingekapselt sind, während Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsexperimente (FISH) und metagenomische Sequenzierung stark darauf hindeuten, dass es sich um Bakterien und potenzielle Mitglieder dieser Klasse handelt Betaproteobakterien. Mithilfe der kryogenen Transmissionselektronenmikroskopie (cryoTEM) und der KryoET charakterisieren wir die Hüllstruktur von RBSs und entdecken bisher unbeobachtete Oberflächenmerkmale wie heterogene Bündel von Anhängseln, die aus den Enden von RBSs herausragen und sich an den Spitzen ausbreiten. Diese Ergebnisse unterstreichen die Leistungsfähigkeit der hochauflösenden Mikroskopie zur Erforschung der Natur unkultivierter Mikroben.

Im Rahmen des US Navy Marine Mammal Program (MMP) wurden in drei verschiedenen Zeiträumen in den Jahren 2012, 2018 und 2022 Mundabstrichproben aus dem Maul von acht Großen Tümmlern (Tursiops truncatus) entnommen ( Methoden). RBS waren in Phasenkontrastmikroskopbildern leicht zu erkennen (Abb. 1a – e). Die RBS ähnelten rechteckigen Prismen; sie waren nicht zylindrisch (Zusatzfilm 1). Sie zeigten nach Gramfärbung gramnegative Eigenschaften (Abb. 1f). Versuche zur Membranfärbung mit FM4-64 waren erfolglos, da der FM4-64-Farbstoff keinen Teil der RBS anfärbte. RBS enthielten mehrere parallele Fluoreszenzbanden mit DAPI-Färbung (Abb. 1b – e). In einigen RBSs erschienen die benachbarten DNA-Bandenpaare „H“-ähnlich (Abb. 1g, weißer Pfeil), was darauf hindeutet, dass sich zwei stäbchenförmige Zellen im Prozess der Teilung entlang einer Längsachse befinden und die DNA-Banden eine Segregation durchlaufen27. RBS gruppierten sich basierend auf den Abmessungen der rechteckigen Einheiten in zwei Morphotypen (Abb. 1h). Anhand von Materialien aus einer einzelnen Mundabstrichprobe eines Delfins haben wir die Länge und Breite von 23 RBS quantifiziert. Morphotyp A wies eine mittlere Länge von 3,95 ± 2,89 µm mittlere absolute Abweichung (MAD) und eine mittlere Breite von 5,08 ± 0,10 µm MAD auf (n = 15 RBS). Morphotyp B hatte eine mittlere Länge von 3,08 ± 0,93 µm MAD und eine mittlere Breite von 2,21 ± 0,56 µm MAD (n = 8 RBS). Die Abmessungen für Länge und Breite unterschieden sich signifikant zwischen den beiden Morphotypen (für die Länge p = 0,02; für die Breite p = 10−10; zweiseitiger Welch-t-Test). Die unterschiedlichen Morphotypen können unterschiedliche Zelltypen oder taxonomische Gruppen (z. B. Stämme oder Arten), Zellen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien oder Zellen mit veränderter Form als Reaktion auf Umweltbedingungen darstellen.

a Phasenkontrastbilder von RBS (Pfeil zeigt ein Beispiel) auf der Oberfläche oraler Epithelzellen von Delfinen. Siehe auch Zusatzfilm 1. b, c Einige RBS zeigten lange DAPI-Fluoreszenzbanden. Das Phasenkontrastbild ist in (b) dargestellt, mit einer Fluoreszenzüberlagerung in Cyan in (c). d, e Andere RBSs zeigten kürzere DAPI-Bänder. Das Phasenkontrastbild ist in (d) dargestellt, mit einer Fluoreszenzüberlagerung in Cyan in (e). Dunkle Flecken (Pfeile) waren in Linien senkrecht zu DAPI-gefärbten Bändern angeordnet. Mit DAPI gefärbte Bänder schienen paarweise organisiert zu sein. f Gramgefärbte RBS weisen gramnegative Eigenschaften auf. Einschub: Gram-gefärbter Bacillus subtilis (Bs, Gram-positiv) und Escherichia coli (Ec, Gram-negativ). g Benachbarte DNA-Bandenpaare in einem RBS bilden „H“-ähnliche Formen (Pfeil), wahrscheinlich weil es sich bei den DNA-Banden um getrennte Nukleoide in einer Zelle handelt, die sich in Längsrichtung teilt. h Die beiden RBS-Morphotypen weisen unterschiedliche Längen- und Breitenverteilungen auf. Die mittlere Breite und Länge von 15 RBS-As betrug 3,95 ± 2,89 µm MAD bzw. 5,08 ± 0,10 µm MAD und für 8 RBS-Bs 3,08 ± 0,93 µm MAD bzw. 2,21 ± 0,56 µm MAD. Die Mittelpunkte der orangefarbenen und blauen Kreuze stellen die Mittelwerte von RBS-As bzw. RBS-Bs dar, während die Längen der Arme ±1 Standardabweichung darstellen.

Wir haben die Prävalenz von RBS jedes Morphotyps in einem Satz von 73 oralen Abstrichproben von acht Delfinen (Ergänzungsdaten 1) mithilfe eines automatisierten Phasenkontrastmikroskopie-Workflows mit hohem Durchsatz bewertet, der Bilddaten für 226 Sichtfelder pro Probe sammelte . RBS des Morphotyps A, im Folgenden als RBS-A bezeichnet, wurden in 39/73 Proben von 7/8 Delfinen nachgewiesen (beachten Sie, dass die Anzahl der Proben pro Delfin nicht konstant ist und dass in verschiedenen Jahren verschiedene orale Stellen abgestrichen wurden). RBS des Morphotyps B, im Folgenden als RBS-B bezeichnet, wurden in 42/73 Proben von 6/8 Delfinen nachgewiesen. Von 25 dieser 73 Proben, die an verschiedenen oralen Stellen entnommen wurden, wurden RBS in palatinalen (RBS-A = 5/5; RBS-B = 4/5) und gingivalen Proben (RBS-A = 12/15; RBS-A) nachgewiesen. B = 14/15), jedoch seltener in bukkalen Proben (RBS-A = 0/5; RBS-B = 2/5). Daraus schließen wir, dass die RBS stabile Kolonisatoren in der Mundhöhle von Delfinen sind und bevorzugte Kolonisierungsorte haben.

In dieser Studie haben wir uns auf RBS-A konzentriert, da dieser Morphotyp in den oralen Delfinproben häufiger vorkam und sich morphologisch stärker von anderen bekannten Mikroben unterscheidet.

Angesichts der faszinierenden Morphologie der RBS versuchten wir als nächstes, ihre taxonomische Zugehörigkeit zu bestimmen. RBS ähneln morphologisch Mitgliedern der Gattungen Simonsiella und Conchiformibius (Familie Neisseriaceae), bei denen es sich um stäbchenförmige orale Kommensale bei Säugetieren handelt39. In einer erneuten Analyse der Sanger-Klonbibliothek und 454 Pyrosequenzierungsdaten aus einer früheren 16S-rRNA-Gen-Amplikon-Untersuchung von Zahnfleischabstrichproben von 38 Delfinen derselben Population23 wurde kein S. muelleri (die einzige Art der Gattung Simonsiella) oder der Gattung Conchiformibius gefunden In jeder dieser Proben wurden Amplikons nachgewiesen, obwohl in diesen oralen Proben von Delfinen auch andere Mitglieder der Familie Neisseriaceae nachgewiesen wurden. Ein mutmaßlicher S. muelleri-Sequenztyp wurde in der Sanger-Bibliothek aus dem Maul und der Magenflüssigkeit eines Seelöwen entdeckt, der in derselben Amplikon-Studie23 untersucht wurde (NCBI-Zugangsnummer JQ205404.1); Diese partielle 16S-rRNA-Gensequenz weist eine Identität von 94,6 % und eine Abfrageabdeckung von 99 % mit der partiellen 16S-rRNA-Gensequenz von S. muelleri ATCC 29453 (NCBI-Zugangsnummer NR_025144.1) auf. Die frühere Studie entdeckte fünf weitere Sequenztypen der Familie Neisseriaceae in der Sanger-Bibliothek von Seelöwen (Mund und Magen), Wasser- und Fischarten, die an Meeressäugetiere verfüttert wurden23. Mittlerweile wurden in der 454 Pyrosequenzierungs-Untersuchung vier Sequenztypen der Familie Neisseriaceae gefunden, und zwar von Delfinen (Magen, Atmungssystem), Seelöwen (Maul, Magen), Fischen und Meerwasser. Diese positiven Identifizierungen deuten darauf hin, dass die DNA von S. muelleri und der Familie Neisseriaceae in der vorherigen Studie erfolgreich extrahiert werden konnte, obwohl sie in keiner Mundprobe von Delfinen nachgewiesen wurden23.

Anschließend führten wir eine 16S-rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung an 54 oralen Delfinproben durch (Methoden), was zum Nachweis von 1.116.394 amplifizierten Sequenzvarianten (ASVs) aus 5.339.751 Sequenzablesungen führte. Von diesen 54 Proben wurden 48 im Hochdurchsatzverfahren mittels Phasenkontrastmikroskopie (Methoden) auf RBS untersucht. RBS-As und RBS-Bs wurden jeweils in 22/48 Proben (45,8 %) nachgewiesen, jedoch nicht in denselben 22 Proben. Der eine oder andere Morphotyp wurde in 30/48 Proben (62,5 %) nachgewiesen. Die Verdünnungskurven deuteten darauf hin, dass die Sequenzierungstiefe ausreichte, um Ergebnisse nahe der Sättigung des ASV-Gehalts zu erzielen (Abb. 2a). In diesen Proben wurden keine Amplikons der Familie Neisseriaceae nachgewiesen (Abb. 2b), obwohl wir in der Lage waren, S. muelleri-Sequenzen aus zuvor negativen oralen Abstrichproben wiederherzustellen, nachdem wir Aliquots dieser Proben absichtlich mit S. muelleri versetzt hatten. Die den RBS-A- und RSB-B-positiven Proben gemeinsamen ASVs sind in den Ergänzungstabellen 1 bzw. 2 aufgeführt.

Orale Delfinproben (n = 54) wurden einer tiefen 16S-rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung unterzogen. a Verdünnungskurven für die 54 sequenzierten oralen Delfinproben. b Für jede Familie der Klasse Betaproteobakterien, die in den 54 oralen Delfinproben nachgewiesen wurde, wird die relative Häufigkeit der Mitglieds-ASVs aufgetragen. Beachten Sie, dass die Gattung Simonsiella zur Klasse der Betaproteobakterien der Familie Neisseriaceae gehört; Es wurden keine mit dieser Familie verbundenen ASVs entdeckt. Die visuelle Untersuchung mittels Phasenkontrastmikroskopie (siehe Methoden) ergab RBS des Morphotyps A oder B in 39 von 73 untersuchten Proben (beachten Sie, dass insgesamt 73 Proben visuell auf RBS untersucht wurden; 54 wurden für die Amplikonsequenzierung verwendet, während der Rest verwendet wurde für andere Experimente) (Ergänzende Daten 1). c Die Sequenzierung einer S. muelleri-Reinkultur und einer oralen Delfinprobe (die nachweislich RBS-As enthielt) mit versetztem S. muelleri führte zum Nachweis eines ASV der Familie Neisseriaceae. Das gleiche ASV wurde in einer relativen Häufigkeit von <0,1 % in derselben oralen Delfinprobe in unverändertem Zustand (kein S. muelleri hinzugefügt) nachgewiesen, wenn es parallel zu den S. muelleri-positiven Proben vorbereitet und sequenziert wurde; Das ASV wurde vor der Einführung von S. muelleri in die Laborumgebung in keiner oralen Probe von Delfinen nachgewiesen.

Der marine Ursprung und die rechteckige Natur der RBS gaben auch Anlass zu Spekulationen darüber, dass es sich um Meeresdiatomeen handeln könnte (z. B. Skeletonema costatum), da zylindrische Meeresdiatomeen in zwei Dimensionen rechteckig erscheinen können. Daher untersuchten wir als nächstes einen möglichen eukaryotischen Ursprung von RBS. Wir führten FISH mit markierten eukaryotischen (Euk-1209) und bakteriellen (Eub-338) Sonden durch, wobei letztere bekanntermaßen sowohl mit Bakterien als auch mit Archaeen hybridisieren. Als Kontrollen haben wir S. costatum und das Bakterium Escherichia coli kultiviert und einbezogen. Die Eub-338-Sonde hybridisierte sowohl mit E. coli als auch mit den RBS, während die eukaryotische Sonde Euk-1209 nur mit S. costatum-Zellen hybridisierte (ergänzende Abbildung 1), was darauf hinweist, dass RBS nicht eukaryotisch und daher keine Kieselalgen sind.

Da wir keine weiteren apriorischen Hypothesen über die spezifische Natur der RBSs hatten, verfolgten wir eine Reihe allgemeiner Ansätze, um Licht auf ihre Identität zu werfen. Zunächst kultivierten wir orale Proben unter aeroben und anaeroben Bedingungen in drei Medien, die zur Züchtung verschiedener Bakterien verwendet wurden (Methoden), in der Hoffnung, RBS anzureichern. Leider waren RBS bei der Untersuchung von Kulturen unter dem Mikroskop nicht sichtbar, was darauf hindeutet, dass sich die Wachstumsanforderungen für RBS von denen typischer Bakterien unterscheiden, die aus Säugetier-Mikrobiota isoliert wurden.

Wir haben das Potenzial für die direkte Kultivierung von RBS auf festen Oberflächen weiter untersucht. Von den Abstrichproben aus dem Jahr 2022 haben wir fünf unmittelbar nach der Entnahme in 20 % Glycerin gelagert, um die Chancen auf die Aufrechterhaltung der RBS-Lebensfähigkeit zu maximieren. Die Einzelzellmikroskopie identifizierte zwei Glycerinvorräte, die Proben mit zahlreichen RBS enthielten. Diese Bestände wurden auf Agarplatten geimpft, die entweder BSTSY-FBS- oder BHI-Blutmedium enthielten (Methoden). BSTSY-FBS-Platten ermöglichen das Wachstum von S. muelleri und wurden aerob bei 37 °C inkubiert. BHI-Blutplatten werden typischerweise zur Züchtung verschiedener bakterieller Kommensalen von Säugetieren verwendet; Diese Platten wurden anaerob bei 37 °C inkubiert. Nach 3 Wochen längerer Inkubation waren auf den BSTSY-FBS-Platten keine Kolonien sichtbar, während eine Kontrollprobe von S. muelleri nach 1–2 Tagen große Kolonien bildete. Die BHI-Blutplatten enthielten zusammen etwa 300 Kolonien, von denen wir 288 mithilfe der Hochdurchsatz-Einzelzellmikroskopie untersuchten38. Keine der Kolonien enthielt Zellen mit einer ähnlichen Morphologie wie RBS. Insgesamt ist unsere Unfähigkeit, RBS zu kultivieren, zwar enttäuschend, was die Ermöglichung genomischer Ansätze anbelangt, doch liefert sie einen weiteren Beleg dafür, dass es sich nicht um S. muelleri handelt, das mit solchen Ansätzen leicht kultivierbar ist.

Unsere nächste Strategie nutzte die Mini-Metagenomik, einen Ansatz, bei dem eine kleine Anzahl von Zellen aus einer komplexen Gemeinschaft entnommen und ihre DNA mithilfe der Multiple Displacement Amplification (MDA) verstärkt wird. Bemerkenswert ist, dass dieser Ansatz vorgefasste Vorurteile hinsichtlich einer möglichen Identität weitgehend vermeidet, da metagenomische Analysen DNA aus jeder Zelle aus jedem Lebensbereich aufdecken sollten, eine erfolgreiche Zelllyse vorausgesetzt. Wir verwendeten drei Techniken, um RBS-As für die Genomsequenzierung zu erfassen: Laser-Capture-Mikrodissektion, Mikrofluidik und Zellmikromanipulation. Aufgrund ihrer im Vergleich zu anderen Bakterien großen Größe, der geringen Dichte und der Neigung von RBS-A, an anderen Zellen und an abiotischen Oberflächen zu haften, führte nur die Mikromanipulation zu einer erfolgreichen RBS-A-Einfangung (ergänzende Abbildung 1). Zusätzlich zu vier Sammelröhrchen, die jeweils ~1–3 RBS-As enthielten, wurden mit der Mikropipette vier Negativkontrollröhrchen mit Probenflüssigkeit gesammelt, ohne dass bei der Auflösung unseres Mikroskops Zellen sichtbar waren. Aufgrund der häufigen Nähe von RBS-As zu anderen Zellen wurden wahrscheinlich auch zellfreie DNA und kleine Nichtzielzellen zusammen mit den RBS-As gesammelt. DNA aus RBS-A-positiven und RBS-negativen Proben wurde mit MDA amplifiziert, zusammengefügt und in 18 Genombehälter sortiert (Ergänzungsabbildung 3 und Ergänzungstabellen 3 und 4; Methoden). Bemerkenswert ist, dass keine S. muelleri-, Familie Neisseriaceae- oder Diatomeengenome gewonnen wurden, obwohl positive Kontrollen für diese Taxa nicht im Versuchsdesign enthalten waren. Die eukaryontischen Behälter stimmten mit dem menschlichen Genom oder der Pilzklasse Malasseziomycetes überein, deren Mitglieder bekanntermaßen Kommensalen der menschlichen Haut sind40, und könnten daher Kontaminanten darstellen. Es wurden keine archäischen Behälter geborgen.

Da die Hälfte der aus dem Mini-Metagenomics-Experiment gewonnenen Bakterienbehälter-Kandidaten Mitglieder des Stammes Proteobakterien waren, führten wir als nächstes FISH-Experimente mit einer Reihe klassenspezifischer Sonden durch, die auf Alpha-, Beta- und Gammaproteobakterien abzielten. Die RBS zeigten eine positive Bindung nur an Sonden der Klasse Betaproteobacteria (Abb. 3).

Sonden für die Phylum-Proteobakterien-Klassen Alphaproteobacteria (ALF968), Betaproteobacteria (BET42a) und Gammaproteobacteria (GAM42a) wurden auf ihre Fähigkeit zur Hybridisierung mit RBS untersucht. Obere Reihe: Phasenkontrastbilder; mittlere drei Reihen von oben nach unten: Fluoreszenzbilder für Sonden der Klassen Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria und Gammaproteobacteria; untere Reihe: DAPI-Färbung der vermuteten DNA. Pfeile markieren relevante Zellen in Proben. RBS des Morphotyps „A“ (Abb. 1h) hybridisierten mit der Sonde der Klasse Betaproteobacteria und zeigten eine minimale Hybridisierung mit den Sonden der Klasse Alphaproteobacteria und Gammaproteobacteria.

Aus jeder experimentellen Beweislinie haben wir Erkenntnisse zur taxonomischen Identität von RBS-A synthetisiert (Abb. 4). Während keine schlüssigen Erkenntnisse über die RBS-A-Identität gewonnen werden können, deuten die FISH-Ergebnisse auf eine Zugehörigkeit zur Klasse Betaproteobacteria hin, und ein einzelnes Teilgenom aus der Klasse Betaproteobacteria wurde aus den Mini-Metagenomics-Experimenten gewonnen; Die Zugehörigkeit dieses Behälters (Nummer 16) zur Familie Alcaligenaceae wurde durch phylogenetische Analyse der 16S-rRNA- und ribosomalen Protein-S3-Gene bestätigt (Ergänzende Abbildungen 4 und 5 und Methoden). Ein ASV, das mit dem 16S-rRNA-Gen dieses Bins übereinstimmt, ist in 11/13 der Proben vorhanden, in denen das Vorhandensein von RBS-As visuell bestätigt wurde und für die Amplikon-Sequenzierungsdaten verfügbar sind.

Die Tabelle zeigt die 18 Behälter, die aus der MDA und der Sequenzierung der per Mikromanipulator gesammelten RBS-A-Proben gewonnen wurden, zusammen mit dem Stamm, von dem sie vermutlich stammen. Für die niedrigste erreichte taxonomische Identität (oder Klasse, im Fall des polyphyletischen Stammes Proteobacteria) bedeutet ein Sternchen (*) ein geringeres Vertrauen in die Zuordnung (Methoden). Das RBS-A-Panel zeigt die relative Häufigkeit von Behältern in jeder der vier Proben, die RBS-As enthielten, basierend auf der Visualisierung, farbcodiert wie folgt: Grün: ≥5 %, Gelb: ≥1 % und <5 %, Orange: > 0 % und <1 %, rot: 0 %. Das Negativkontrollpanel (Neg) liefert die gleichen Informationen für jede der Proben, die offenbar kein RBS-As enthielten. Kriterien zur Beurteilung der Wahrscheinlichkeit, dass ein Bin aus den RBS-As stammt, werden angezeigt: (Genomik) War der Bin jemals in Negativkontrollen vorhanden (grün = nein, gelb = ja, aber nie ≥1 % relative Häufigkeit, orange = ja, aber nie ≥ 5 %, rot = ja und mindestens einmal ≥5 %? (Gram-Färbung) Sind Mitglieder dieser taxonomischen Gruppe bekanntermaßen gramnegativ, wie die RBS? (16S 75 %+) War bei den ASVs, die in >75 % der Proben nachgewiesen wurden, die einer 16S-rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung unterzogen wurden und bei denen visuell bestätigt wurde, dass sie >10 RBS-As enthielten (n = 13), ein ASV dieser taxonomischen Identität? Die Zahlen in den Kästchen geben die Anzahl der Proben an, in denen dieses ASV vorhanden war. Für geborgene Behälter, die nur bis zur Klasse Gammaproteobakterien, einer großen und vielfältigen Gruppe, erkannt wurden, ist dieses Kriterium gelb markiert und die ASV-Zahlen werden nicht angezeigt. (FISH) Welche Klassen werden basierend auf den FISH-Ergebnissen als potenzielle Kandidaten für die RBS-As unterstützt? Ein Kreuz (†) bedeutet, dass aus genomischen Studien geschlossen wird, dass Mitglieder des Stammes Gracilibacteria nicht gramnegativ sind (obwohl sie nicht unbedingt grampositiv sind)92. Die Kandidaten mit der höchsten Wahrscheinlichkeit sind für alle drei Kriterien grün.

Der evolutionäre Weg zur Mehrzelligkeit und Längsteilung ist kaum bekannt. Jüngste Versuche, die genetische Grundlage dieser bakteriellen Merkmale in der Familie der Neisseriaceae zu identifizieren, ergaben, dass der Erwerb des Amidase-kodierenden Gens amiC2 zusammen mit Modifikationen wichtiger regulatorischer Gene (z. B. mreB, ftsA) wahrscheinlich eine wichtige Rolle spielt. Wir durchsuchten die aus dem Mini-Metagenomics-Experiment geborgenen Behälter nach mutmaßlichen AmiC2-Proteinen (diejenigen, die Amidase_3, PF01520 kodieren); Kandidaten wurden in den Klassen 4, 7, 9, 10, 11, 12 und 16 identifiziert (letzterer gehört zu den Alcaligenaceae). Nach Bestätigung der Identität der RBS sollte in künftigen Arbeiten die Bedeutung von amiC2 für die Verleihung ihrer ungewöhnlichen Morphologie untersucht werden.

Um hochauflösende strukturelle Einblicke in RBS-As zu erhalten, haben wir mithilfe von CryoTEM orale Proben von Delfinen abgebildet, die eine hohe Dichte an RBS-As enthalten. KryoTEM-Bilder mit geringer Vergrößerung zeigten, dass jedes RBS-A aus scheinbar paarigen, parallel organisierten Segmenten besteht (Abb. 5a, b). Diese Segmente waren ähnlich den DAPI-gefärbten Banden ausgerichtet, die in Fluoreszenzmikroskopiebildern zu sehen waren (Abb. 1c, e). Einige Gruppen von Segmenten schienen dabei zu sein, sich von anderen Gruppen zu trennen, obwohl unsere statischen Daten nicht definitiv sagen können, ob diese Beobachtungen die Zellteilung widerspiegelten. Die Segmente waren von einer dichten, membranartigen Schicht unter einer Schicht geringer Dichte umgeben (Abb. 6a, b (rechts) und Abb. 7a; Zusatzfilme 2 und 3).

Bandpassgefilterte und entrauschte a-, b-Bilder oder c-Montage-KryoTEM-Bilder von RBSs auf einem R2/2-Löcherkohlenstoff-TEM-Gitter mit geringer Vergrößerung. Bilder mit höherer Vergrößerung zeigen d-pilusartige Anhängsel und e-proximale Zellen und interagierende Vesikel an der RBS-Peripherie. In (a) werden Segmentpaare durch abwechselnde Blautöne hervorgehoben und scharfe Einkerbungen zwischen Segmentgruppen werden durch schwarze Pfeile gekennzeichnet. In den RBS waren dichte kugelförmige Objekte vorhanden (weißer Pfeil). In (d) sind Segmente durch eine innere Membran (IM) und eine äußere Membran (OM) eingekapselt, gekennzeichnet durch schwarze Pfeile. d, e Repräsentative mikroskopische Aufnahmen, die zeigen, dass sich RBS häufig in unmittelbarer Nähe zu anderen Zellen in den Proben befanden. In (e) überlappt eine scheinbar kleine Vertiefung (schwarzer Pfeil) in der periodischen RBS-Oberflächenbedeckung mit einer Nicht-RBS-Zelle oder einem Vesikel. Kleine dunkle Flecken (15 nm) in (c–e) sind Gold-Referenzpartikel, die für die Neigungsreihenausrichtung in KryoET-Experimenten verwendet werden (schwarzer Pfeil).

a, b, d, e Beispiele für etwa 3 nm dicke Schnitte in zwei verschiedenen Tiefen (a gegenüber b, d gegenüber e) aus jeweils zwei repräsentativen RBS-A-Tomogrammen. c, f Entsprechende manuelle Anmerkungen zu Mobilfunkfunktionen. Die Tomogramme sind dick (~500–600 nm) und daher waren pilusartige Anhängsel (gelb: c, f) nur in einer bestimmten Tiefe innerhalb der tomographischen Volumendichte des RBS-A sichtbar. Siehe auch Zusatzfilme 2 und 3. c, f Blau, innere Membranen; violett, periodische Oberflächenbedeckung; grün, äußere Membran; rot, Matrix. Maßstabsbalken, 100 nm.

ein einzelnes KryoTEM-Bild. b, c CryoET-Scheiben (~3 nm dick) eines RBS-A. Rote und orangefarbene Kästchen in (c) sind vergrößerte Ansichten von Gliedmaßenbündeln, und Pfeile kennzeichnen dünne, einzelne Gliedmaßen. d Repräsentatives 2D-KryoTEM-Bild am Rand eines RBS-A, das eine periodische Oberflächenbedeckung zeigt. e Liniendichteprofile entlang ausgewählter Bereiche aus dem Bild in (d) zeigen, dass der Abstand der sich wiederholenden Merkmale entlang einer Richtung parallel zur RBS-A-Membran ~7–9 nm beträgt.

Wir stellten die Hypothese auf, dass RBS höchstwahrscheinlich Zellaggregate sind, wobei jedes DNA-haltige Segment einer einzelnen Zelle entspricht. Die folgenden Beobachtungen stützen diese Hypothese: (1) Jedes einzelne Segment schien von einer inneren und äußeren Membran umgeben zu sein, die an das Plasma und die äußere Membran anderer gramnegativer Bakterien erinnert (Abb. 5a, 6a, b (rechts) und). 7a); (2) Segmente sind in derselben Geometrie angeordnet (Abb. 5a, b) wie die DAPI-gefärbten Banden und die FISH-Sonden-hybridisierten Banden (Abb. 1c, e, g und 3); (3) Anhängsel ragten aus der Oberfläche einzelner Segmente hervor (Abb. 5c, d); (4) RBS-As bestand oft aus einer unterschiedlichen Anzahl von Segmenten, die sich scheinbar voneinander trennten (Abb. 1d, e und 6d, e), was darauf hindeutet, dass die rechteckigen Strukturen keine einzelnen Zellen widerspiegeln; (5) Benachbarte Segmente erschienen H-förmig (Abb. 1g), was an Nukleoide erinnerte, die sich in einer Bakterienzelle auflösten, die sich in Längsrichtung teilt; und (6) Während in einem aktuellen Bericht die erste Entdeckung eines Bakteriums beschrieben wird, in dem DNA in einem membrangebundenen Kompartiment gespeichert ist,41 ist die Zahl der bekannten Bakterienarten, in denen DNA physisch vom Zytoplasma getrennt oder gar an Organellen gebunden ist, sehr hoch extrem niedrig. Im Gegensatz dazu wurde Mehrzelligkeit bei verschiedenen Bakterienarten dokumentiert (Übersicht in Lit. 42).

In KryoTEM-Bildern waren dunkle, kugelförmige Strukturen im Körper von RBS sichtbar (Abb. 5c). In einem Tomogramm waren zwei dichte kugelförmige Objekte deutlich sichtbar und maßen 192 nm × 200 nm × 192 nm (Volumen 3,1 × 107 nm3) und 215 nm × 220 nm × 220 nm (Volumen 4,4 × 107 nm3). Es waren auch vesikelartige Strukturen erkennbar. Bemerkenswerterweise kapselte eine Oberflächenbedeckung mit einer Periodizität von ~7–9 nm das RBS-As ein (durchschnittlich 7,83 ± 0,86 nm SD) (Abb. 6 und 7 sowie Zusatzfilme 2 und 3). Dieses Merkmal wurde anhand der hochauflösenden 2D-Mikrofotografien von zwei RBS-As aus einer einzelnen Delfin-Oralprobe gemessen, indem Liniendichtediagramme von Segmenten (2 von jedem Bild) erstellt und der Abstand zwischen Intensitätspeaks für 6–7 Peaks manuell gemessen wurden ( Abb. 7d, e).

Um detailliertere 3D-Rekonstruktionen der RBS-A-Merkmale zu erhalten, führten wir KryoET-Experimente durch. Die Aufnahmen mit Neigungsserien waren auf die RBS-A-Peripherie beschränkt, da die Dicke der RBS-A-Körper den Elektronenstrahl bei hohen Neigungswinkeln fast vollständig verdeckte. Die Dicke an der RBS-A-Peripherie (<1 μm vom Rand entfernt) lag im Bereich von ~323–751 nm, mit einem Durchschnittswert von ~509 ± 132,4 nm SD (n = 15) (über dem allgemein angesehenen Schwellenwert von ~500 nm). als Obergrenze für die produktive KryoET-Bildgebung43). Versuche, den RBS-A-Körper mit KryoET abzubilden, schlugen fehl, da Goldmarken und Zellmerkmale beim Kippen schnell nicht mehr erkennbar waren, was darauf hindeutet, dass die Dicke der Probe zu viele Mehrfachstreuereignisse hervorrief44.

Anhängsel, die pili45,46 ähnelten, ragten aus RBS-As hervor; Diese Anhängsel bestanden oft aus haarähnlichen Strukturen, die Bündel bildeten und sich an den Spitzen ausbreiteten, wobei sie sich manchmal ineinander verschlungen und/oder kreuzten (Abb. 6b und 7b, c). Die Gliedmaßenbündel waren strukturell heterogen und hatten unterschiedliche Längen, Bündelbreiten und Anzahl der Spitzen. Bemerkenswert ist, dass wir bei der Untersuchung der verschiedenen Merkmale in den Tomogrammen keine membrangebundenen Organellen beobachteten, die an einen Kern erinnern, was mit einer nicht-eukaryotischen Identität im Einklang steht.

Sowohl für die Anhängsel als auch für die periodische Oberflächenbedeckung lieferte die Mittelung des Subtomogramms47 keine konsistenten Karten, was wahrscheinlich auf die Dicke der RBS-A-Peripherie (oft > 500–600 nm dick), das niedrige Signal-Rausch-Verhältnis der Tomogramme usw. zurückzuführen ist begrenzende Eigenschaften der betreffenden Merkmale, wie etwa die variable Krümmung der Regionen mit Abschnitten kontinuierlicher periodischer Oberflächenbedeckung. Eine erfolgreiche Subtomogramm-Mittelung beruht typischerweise auf der Mittelung identischer Strukturen, beispielsweise wiederholter Kopien eines makromolekularen Komplexes, beispielsweise Ribosomen im gleichen Funktionszustand. Mit großen Datensätzen aus Tausenden von Subtomogrammen in Kombination mit fortschrittlichen Klassifizierungsmethoden kann man strukturelle Variabilität in Form von Konformations- und Zusammensetzungsheterogenität kompensieren. In unseren Datensätzen waren jedoch sowohl die pilusartigen Anhängsel (Abb. 7a – c) als auch die S-schichtartigen Oberflächenmerkmale (Abb. 7a, d, e) strukturell heterogen und in den RBS-As nur spärlich verteilt (z. B (Das S-schichtartige Oberflächenmerkmal ist nicht durchgehend entlang der gesamten Membran des RBS-As und weist in den Abschnitten, in denen es sich befindet, eine unterschiedliche Krümmung auf) und wurde daher nur in einem Bruchteil unserer Tomogramme beobachtet.

Um die Probendicke zu ermitteln, verwendeten wir kryogene fokussierte Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie (REM)48, um dünnere Lamellen aus RBS-Proben zu fräsen49. Allerdings konnten wir aus zwei möglichen Gründen keine RBS-As unter dem Eis lokalisieren: (1) Bei einer vermuteten Dicke zwischen ~0,6 und 1,7 µm bilden RBS-As möglicherweise keine „Hügel“ unter dem Eis, die ausreichend hervorstehen schlagen Sie vor, wo gemahlen werden soll; und (2) andere größere Zellen in den Proben (wie Delphinepithelzellen) bildeten markantere Hügel, die die RBS-As verdeckten. Tatsächlich enthielt keine der Lamellen, die wir an Kandidatenstandorten produzierten, RBS-A. Die Daten aus diesem Experiment legen nahe, dass in zukünftigen Studien kryokorrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (cryoCLEM) erforderlich sein wird, um Kandidatenregionen in KryoEM-Gittern mit vitrifizierten RBS-As zu lokalisieren, aus denen mithilfe von KryoFIB-SEM dünne Lamellen hergestellt werden sollen. Dennoch wies die Zelloberfläche ähnliche Merkmale auf wie die, die wir an der RBS-A-Peripherie beobachteten, nämlich Pili- und S-Schichten. Wir schlagen vor, dass die pilusartigen Anhängsel und die S-schichtartige periodische Oberflächenbedeckung von RBS-As eine zukünftige Untersuchung wert sind.

Hier verwendeten wir optische Mikroskopie, KryoTEM und KryoET, um nach neuartiger morphologischer Diversität innerhalb der Mikrobiota oraler Delfinproben zu suchen. Die morphologische Diversität wurde auf der Grundlage früherer Erkenntnisse über neuartige phylogenetische Diversität und funktionelles Potenzial im Delfinmaul durch sequenzierungsbasierte Studien vorhergesagt16,23. Interessanterweise haben wir ungewöhnliche RBS entdeckt. Wir schließen daraus, dass beide RBS-Morphotypen im Delfinmaul heimisch sind, da sie in dieser Umgebung durchgängig vorhanden waren: RBS-As und RBS-Bs wurden in 39/73 bzw. 42/73 Proben identifiziert, die mit Hochdurchsatz untersucht wurden Mikroskopische Bildgebung, einschließlich bei 7/8 und 6/8 Delfinen, die in diese Studie einbezogen wurden, und waren in Proben vorhanden, die im Abstand von zehn Jahren gesammelt wurden. Frühere Studien haben ergeben, dass sich die Mikrobiota von Meeressäugern von der des Meerwassers unterscheidet (sogar von der der Haut, die ständig in direktem Kontakt mit Meerwasser steht)23,50, und daher ist es unwahrscheinlich, dass es sich bei RBS lediglich um Kontaminanten aus Meerwasser handelt.

Die taxonomische Identifizierung spezifischer Zellmorphotypen aus komplexen Gemeinschaften kann äußerst schwierig sein und oft ungelöst bleiben28,51,52. Die hier gesammelten Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass die RBS-As nicht mit den mehrzelligen, sich in Längsrichtung teilenden Mitgliedern der Familie Neisseriaceae, S. muelleri, der Gattung Conchiformibius oder der Gattung Alysiella, verbunden sind, die auch rechteckig geformte Ansammlungen stäbchenförmiger Zellen bilden können53. Erstens konnte der hier verwendete Arbeitsablauf zur Markergen-Amplikon-Sequenzierung keine Amplikons der Familie Neisseriaceae in 54 oralen Proben von Delfinen nachweisen, die einer tiefen 16S-rRNA-Gen-Amplikon-Sequenzierung unterzogen wurden, obwohl dieser Arbeitsablauf S. muelleri erkannte, nachdem Zellen aus diesem Taxon absichtlich in Aliquots davon versetzt wurden Oralproben von Delfinen. Zweitens scheiterten Versuche, RBS-As mit Techniken zu kultivieren, die in unserem Labor erfolgreich zur Kultivierung von S. muelleri eingesetzt wurden, was darauf hindeutet, dass die RBS-As andere physiologische Wachstumsanforderungen haben als die von S. muelleri. Drittens wurden aus dem Mini-Metagenomics-Experiment keine Genome der Familie Neisseriaceae gewonnen. Viertens visuelle Vergleiche der hier vorgestellten RBS-A-Bilder mit den TEM- und Fluoreszenzmikroskopiebildern der vielzelligen, sich in Längsrichtung teilenden Familie der Neisseriaceae (Gattungen Alysiella, Simonsiella und Conchiformibius) in Lit. 53 deuten darauf hin, dass es sich um verschiedene Taxa handelt. Beispielsweise scheinen RBS Segmente (Zellen) zu enthalten, die in ein matrixartiges Material eingebettet und vollständig von einer S-schichtartigen Struktur eingekapselt sind, wohingegen mehrzellige, sich in Längsrichtung teilende Familien der Familie Neisseriaceae, die zum gleichen Filament gehören, offenbar nur ihre äußere Membran teilen53 .

FISH-Experimente zeigten, dass es sich bei den RBS-As um Bakterien und wahrscheinlich um Mitglieder der Klasse Betaproteobakterien handelt. Aus dem Mini-Metagenomics-Experiment wurde ein Genom der Klasse Betaproteobacteria aus der Familie der Alcaligenaceae gewonnen. Ein ASV, das mit dem 16S-rRNA-Gen dieses Behälters übereinstimmt, wurde in 11/13 Proben nachgewiesen, die einer Amplikonsequenzierung unterzogen wurden, und mittels Phasenkontrastmikroskopie wurde visuell bestätigt, dass sie RBS-As enthielten. Zusammengenommen könnten die RBS-As Mitglieder der Familie der Alcaligenaceae sein, obwohl der Befund, dass dieses ASV in 2/13 Proben fehlte, bei denen mikroskopisch bestätigt wurde, dass sie RBS-As enthielten, diese Hypothese in Frage stellt. Eine Möglichkeit besteht darin, dass die RBS-As in diesen beiden Proben in ausreichend geringer relativer Häufigkeit vorhanden waren, sodass sie trotz tiefer Amplikonsequenzierung nicht nachgewiesen werden konnten. Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass es sich bei RBS-As nicht um dieses Alcaligenaceae-Taxon handelt, sondern dass das Alcaligenaceae-Taxon ein allgegenwärtiges Mitglied der oralen Mikrobiota von Delfinen ist und daher in unseren sequenzierungsbasierten Analysen häufig auftauchte. In einem solchen Fall würde es darauf hindeuten, dass es sich bei den RBS-As entweder um Betaproteobakterien der Klasse handelt, die in den sequenzierungsbasierten Experimenten nicht lysiert wurden, oder dass die FISH-Ergebnisse trotz der strengen und kontrollierten Bedingungen, unter denen das Experiment durchgeführt wurde, falsch positiv waren.

Die Identifizierung von RBS auf Speziesebene mittels sequenzierungsbasierter Methoden wird aus zahlreichen Gründen äußerst schwierig sein, beispielsweise aufgrund der häufigen unmittelbaren Nähe von RBS zu anderen kleinen Zellen, die wahrscheinlich während der Mikromanipulation mit RBS vermischt wurden, oder wegen der Widerspenstigkeit gegenüber der Laborlyse. Wichtig ist, dass wir zögern, Kandidatenidentitäten auszuschließen, die darauf basieren, dass sie nicht in allen positiven RBS-Proben im Mini-Metagenomics-Experiment vorhanden sind, da technische Einschränkungen zu falsch negativen Ergebnissen hätten führen können. Beispielsweise könnte eine dicke Zellwand oder ein Hindernis, das verhindert, dass Reagenzien durch die Mikropipettennadel in die RBS gelangen, die Lyse der Zellmembran beeinträchtigen und die DNA-Extraktion behindern. Umgekehrt kann ein positives Ergebnis in einer Negativkontrolle aufgrund einer unspezifischen Lesekartierung, einer Kontamination von Genombehältern mit Material echter Kontaminanten oder zellfreier DNA entstanden sein. Kultivierungsbasierte Ansätze könnten letztendlich der vielversprechendste Weg zur Identifizierung von RBS sein, obwohl wahrscheinlich viele Kombinationen von Parametern getestet werden müssen, um zufriedenstellende Bedingungen für das RBS-Wachstum zu finden. Unabhängig von der taxonomischen Identität der RBS sind die neuartigen Strukturmerkmale, die sich in diesen Mikroorganismen entwickelt haben, faszinierend und verdeutlichen das Entdeckungspotenzial für weitere Untersuchungen.

Die gepaarte Natur der Segmente in RBS kann wahrscheinlich auf ihren longitudinalen Modus der binären Spaltung zurückgeführt werden, wie er in den Familien der Neisseriaceae-Gattungen Alysiella, Simonsiella und Conchiformibius sowie in S. poulsonii, Ca., zu sehen ist. T. oneisti und Ca. T. hypermnestrae31,32,35,54. Beim Neisseriaceae-Mitglied S. muelleri wird angenommen, dass Blätter dazu beitragen, dass Zellen physisch in der Mundhöhle verankert bleiben, wenn sich schnell ablösende Epithelzellen ablösen 34. Wir nehmen an, dass das Gleiche auch für RBS gilt, die in einer ähnlichen Umgebung leben und deren Morphologie haben könnte aufgrund ähnlicher evolutionärer Zwänge eine konvergente Entwicklung durchlaufen haben. Die binäre Längsspaltung kann ein noch allgemeineres Merkmal sein, das als Reaktion auf die Notwendigkeit ausgewählt wird, eine sichere Bindung an ein Substrat herzustellen. Die Segmente an den Enden von RBS sind oft kürzer als diejenigen, die näher an der Mitte liegen, was darauf hindeutet, dass es einen Mechanismus geben könnte, durch den das Wachstum von Segmenten durch ihre räumliche Positionierung innerhalb eines RBS bestimmt wird. Die RBS stellen ein weiteres Fallbeispiel für zukünftige Evolutionsstudien dar, die sich auf das Verständnis der Treiber und genetischen Grundlagen der bakteriellen Vielzelligkeit und Längsteilung konzentrieren.

CryoTEM-Bilder deuten darauf hin, dass RBS-As durch eine periodische Oberflächenbedeckung eingekapselt sind, bei der es sich um eine S-Schicht oder eine neue kristalline Struktur handeln kann. S-Schichten sind selbstorganisierende, kristalline Anordnungen einzelner Proteine ​​oder Glykoproteine, die die Außenseite einiger Bakterien und Archaeen bedecken55,56. Während ihre genaue Funktion bei den einzelnen Mikroorganismen stark schwankt und oft unbekannt ist, wird angenommen, dass S-Schichten aufgrund ihrer hohen Stoffwechselkosten (die S-Schicht macht bis zu ~20 % des gesamten von Zellen synthetisierten Proteins aus) und ihrer Allgegenwärtigkeit vorteilhafte Funktionen verleihen Mikroben und ihre vielfältigen evolutionären Ursprünge55,56. Wenn Segmente in RBS-A einzelnen Zellen entsprechen, kann die Herstellung der periodischen Oberflächenbedeckung eine Zusammenarbeit zwischen Zellen innerhalb von RBS-A darstellen. Es könnte sich zu einer kooperativen Synthese einer einzelnen, gemeinsamen periodischen Oberflächenbedeckung durch mehrere Zellen entwickelt haben, da nahe Verwandte (andere Zellen in einem RBS-A) nur über eine begrenzte Ausbreitungsfähigkeit verfügen und sich daher in unmittelbarer physischer Nähe befinden. RBS-As würden von der kooperativen Produktion einer einzigen periodischen Oberfläche profitieren, die eine Zellpopulation abdeckt, statt jedes einzelne Segment, indem sie die zur Abdeckung aller Zellen erforderliche Oberfläche verringert, und ein solcher Vorteil hätte sogar zur Selektion für die Aggregation beitragen können. Eine zusätzliche und sich nicht gegenseitig ausschließende Möglichkeit besteht darin, dass die periodische Oberflächenbedeckung dazu beitragen kann, die Ultrastruktur von Segmenten innerhalb eines RBS-A aufrechtzuerhalten, ähnlich wie bei Archaeen wie Thermoproteus tenax57.

Eines der auffälligsten Merkmale von RBS-As sind ihre pilusartigen Anhängsel. Derzeit gibt es fünf charakterisierte Pili-Klassen bei gramnegativen Bakterien (Chaperone-Usher, Curli-Fasern, F-Typ, Typ IV und Typ V) und zwei allgemeine Pili-Typen bei grampositiven Bakterien (kurze, dünne Stäbchen). und längere, flexible, haarartige Filamente)45,46; andere pilusartige Anhängsel wurden dokumentiert, wie z. B. Hami in Archaea21. Nach unserem besten Wissen bestehen alle charakterisierten Bakterien-Pili aus einzelnen Anhängseln, die als unabhängige Einheiten existieren. Im Gegensatz dazu weisen die pilusartigen Anhängsel, die aus den RBS-A-Segmenten hervorstehen, eine ungewöhnliche Architektur mit heterogenen Filamentbündeln auf, die sich oft an den Spitzen ausbreiten. Diese Beobachtungen werfen die Frage auf, ob die RBS-A-Anhängsel eine neuartige Art der Anordnung von Pilin-Untereinheiten darstellen oder eine völlig unterschiedliche Klasse von Anhängseln darstellen.

Eine umfassende Untersuchung von Hunderten von KryoEM-Bildern und Dutzenden von KryoET-Tomogrammen ermöglichte die Visualisierung der Struktur vieler RBS-A-Merkmale mit einer Auflösung nahe Nanometern. Zukünftige Studien zu RBS könnten von der Bildgebung mit Phasenplattenoptiken profitieren, die den Bildkontrast58 nach Probenvorbereitungsmethoden, bei denen Zellen durch FIB-Fräsen in Verbindung mit REM bei kryogenen Temperaturen zu Lamellen verdünnt werden, drastisch erhöhen48,49. Unsere Daten deuten darauf hin, dass cryoCLEM benötigt wird, um die Produktion dünner Lamellen für RBS-As zu ermöglichen, da der RBS-A-Zellkörper dicker zu sein scheint als die für KryoET-Experimente zulässige Grenze, aber dennoch zu dünn, als dass RBS-As leicht gefunden werden könnten durch CryoSEM vor dem CryoFIB-Fräsen ohne Fluoreszenzmarkierungen. Erfolgreiche CryoCLEM+CryoFIB-SEM-Experimente gefolgt von CryoET könnten umfassendere Analysen der Gemeinschaft von RBS und ihres Zellkörpers über die dünne Peripherie hinaus sowie die Visualisierung interessierender subzellulärer Komponenten mit höherer Auflösung durch Subtomogramm-Mittelung ermöglichen.

Der überwiegenden Mehrheit der Mikroorganismen auf der Erde fehlen isolierte Vertreter19. Sequenzierungsbasierte Analysen haben sich bei der Erforschung und Beschreibung dieser Vielfalt als unschätzbar wertvoll erwiesen, können jedoch nicht zur Erforschung aller Aspekte der Biologie von Mikroorganismen eingesetzt werden. Zu den bemerkenswerten blinden Flecken in unserem Verständnis nicht kultivierter Organismen zählen die einzigartigen Gene und die entsprechenden strukturellen und funktionellen Merkmale, die sich innerhalb dieser Abstammungslinien entwickelt haben. Während der Einsatz fortschrittlicher Bildgebungstechniken zur Visualisierung von Mikroben Einblicke in die Biologie nicht kultivierter Abstammungslinien liefern kann, ist eine Verlagerung hin zu einem vielschichtigeren Ansatz unter Einbeziehung vieler Disziplinen und Techniken erforderlich, um einen umfassenden Überblick über diese biologische dunkle Materie zu erhalten59,60.

Um die Reproduzierbarkeit zu maximieren, finden Sie in der Ergänzungstabelle 5 eine Liste der in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Ressourcen sowie deren Quelle und Kennung.

Mundabstrichproben wurden von Großen Tümmlern (Tursiops truncatus) entnommen, die von der US Navy MMP Biosciences Division, Space and Naval Warfare Systems Center Pacific, San Diego, USA, verwaltet werden. Die früheste Probe mit RBS wurde am 1. April 2012 und die späteste am 24. März 2022 entnommen. Die Abstrichproben wurden mit sterilen Catch-All-Probensammeltupfern aus Schaumstoff (Epicenter, WI, Kat.-Nr. QEC091H) entnommen. Die im Jahr 2012 gesammelten Proben wurden durch einen Abstrich des linken Zahnfleischsulkus gewonnen. Die im Jahr 2018 gesammelten Proben wurden durch Abstriche des Gaumens, der Zunge und des linken Zahnfleischsulkus (alle drei Oberflächen für jeden Abstrich) gewonnen. Die im Jahr 2022 gesammelten Proben wurden vom Gaumen, der bukkalen Oberfläche oder dem linken Zahnfleischsulcus entnommen. Von den 2022 Proben des Zahnfleischsulcus wurden 5 in 20 % Glycerin gelagert. Alle anderen Abstrichproben wurden trocken eingefroren. Das Abstrichprotokoll entsprach den im CRC Handbook of Marine Mammal Medicine beschriebenen Richtlinien.

Das MMP ist von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International akkreditiert und hält sich an die nationalen Standards der United States Public Health Service Policy on the Humane Care and Use of Laboratory Animals und des Animal Welfare Act. Gemäß den Anforderungen des US-Verteidigungsministeriums wird das Tierpflege- und -nutzungsprogramm des MMP regelmäßig von einem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) und dem US Navy Bureau of Medicine and Surgery überprüft. Das Tiernutzungs- und Pflegeprotokoll für MMP-Delfine zur Unterstützung dieser Studie wurde vom IACUC des MMP und dem Bureau of Medicine and Surgery der Marine genehmigt (IACUC #92-2010, BUMED NRD-681).

Um die Zellen von den Abstrichtupfern zu trennen, wurden die Abstrichtupfer in 1X PBS (~50–100 µL, abhängig von der Zelldichte) in Mikrozentrifugenröhrchen getaucht. Die Röhrchen wurden ca. 10 s lang kräftig geschüttelt und leicht zentrifugiert, um Flüssigkeit von den Röhrchenkappen zu entfernen. Die resultierende Lösung wurde für die Mikroskopie verwendet.

Ungefähr 1 µL Zelllösung in PBS wurde auf ein Agarosepad (1 % Agarose in PBS) getupft und mit einem Eclipse Ti-E-Umkehrmikroskop mit einem 100X-Objektiv (NA: 1,4) (Nikon, Tokio, Japan) abgebildet. Um die DNA-Lokalisierung zu bestimmen, wurden die Zellen vor der Bildgebung unter Verwendung von Emissions-/Anregungsspektren von 340/488 nm 5 Minuten lang mit DAPI in einer Endkonzentration von 0,5 μg mL-1 gefärbt. Mit dem Strain Library Imaging Protocol38 wurde eine automatisierte Hochdurchsatz-Bildgebung von Mundproben von Delfinen mittels Phasenkontrastmikroskopie erreicht, um 226 Sichtfelder für jede der im Jahr 2018 gesammelten Proben und 100 Sichtfelder für die im Jahr 2022 gesammelten Proben zu erfassen.

Die Gram-Färbung wurde mit einem Gram-Färbekit (Sigma Aldrich, Kat.-Nr. 77730-1KT-F) gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Die Zellen wurden unter Verwendung eines Hellfeldmikroskops mit einem 100-fachen Objektiv (Nikon) abgebildet. Der Farbstoff FM4-64 (ThermoFisher Scientific, Kat.-Nr. T13320) wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers direkt auf Mundabstrichproben von Delfinen aufgetragen. Der Farbstoff FM4-64 färbte keinen Teil der RBS.

Eine Lösung von Zellen in PBS (2,5 µL) wurde auf glimmentladene 200-Mesh-Quantifoil-Gitter aus Kupfer mit löchrigem Kohlenstoff (Quantifoil, Großlöbichau, Deutschland, Kat.-Nr. Q2100CR1) oder GridFinder Quantifoil-Gitter aus Gold (Quantifoil, Großlöbichau, Deutschland, Kat. #LFH2100AR2), gefolgt von der Anwendung von 2 µL einer 15-nm-Gold-Referenzlösung auf beiden Seiten jedes Gitters. Die Gitter wurden 5 s lang geblottet und in flüssigem Ethan, das mit flüssigem Stickstoff auf etwa –195 °C gekühlt wurde, unter Verwendung eines EM GP Plunge Freezer (Leica, Wetzlar, Deutschland) tauchgefroren.

Die Proben wurden in eines von zwei Mikroskopen geladen: ein Titan Krios G3, betrieben bei 300 kV mit einem Energiefilter (20 eV Spaltbreite), oder ein Titan Krios G4, betrieben bei 300 kV ohne Energiefilter. Beide Mikroskope waren mit einem K2 Summit-Gerät zur direkten Elektronendetektion (Gatan, Pleasanton, USA) ausgestattet, das zur Aufnahme von Mikroaufnahmen verwendet wurde. Die Daten wurden halbautomatisch im Zählmodus mit SerialEM (Version 3.8)61 erfasst. KryoEM/ET-Bildgebungsparameter sind in der Ergänzungstabelle 6 aufgeführt.

Die Montagen wurden mit dem „blendmont“-Algorithmus62 von IMOD v. 4.12.9 mindestens vierfach gemischt und gruppiert und mit EMAN2 v. 2.3963 für Anzeigezwecke normalisiert, bandpassgefiltert, gedreht und zugeschnitten. Fünfzehn von sechzehn Neigungsserien waren für die tomographische Rekonstruktion in IMOD v. 4.12.9 geeignet. Tilt-Serien mit einer Abtastung bei 7,5 Å Pixel-1 wurden um das Zweifache heruntergesampelt, und solche mit einer Abtastung bei 3,48 oder 3,75 Å Pixel-1 wurden um das Vierfache heruntergesampelt. Bilder mit Artefakten wie übermäßiger Aufladung, Drift, großer Eiskontamination, die sich bei starker Neigung einschleicht, oder übermäßiger Dicke bei starker Neigung wurden vor der manuellen Gold-Fiducial-basierten Ausrichtung aus 12 der Neigungsserien ausgeschlossen; Bis zu 13 Bilder wurden aus den 41 Bildern der ursprünglichen Rohneigungsserie entfernt.

Tomogramme wurden unter Verwendung einer standardmäßigen gewichteten Rückprojektion und eines SIRT-ähnlichen Filters (der 16 Iterationen nachahmt) rekonstruiert und in den meisten Fällen für Merkmalsanmerkungen, Segmentierung, Filmproduktion und andere Anzeigezwecke einer Bandpassfilterung und einem weiteren 2-fachen Binning unterzogen . Die Dicke des Tomogramms wurde geschätzt, indem die kleinsten und größten Z-Scheiben mit sichtbarer RBS-A- oder Eiskontaminationsdichte visuell identifiziert und die Anzahl der Scheiben in Nanometer umgerechnet wurden. Mit EMAN2 v. 2.3964,65 wurde eine Subtomogramm-Mittelung für Kugeldichten versucht, bei denen es sich vermutlich um Ribosomen handelt, Matrixdichten unter der äußeren Membran, Flecken der periodischen Oberflächenbedeckung und Regionen pilusartiger Anhängsel, aber keine interpretierbaren Strukturen mit einer Auflösung besser als ~ Es wurden 50 Å erhalten. Die Dicken- und Längenbereiche der pilusartigen Anhängsel wurden durch visuelles Scannen der Schnitte in den Tomogrammen nach den dünnsten einzelnen Filamenten und dicksten Bündeln, die mit bloßem Auge wahrnehmbar sind, und das Messen ihrer Abmessungen in tomographischen Schnitten, die in 4-fach unterteilt sind, mithilfe der Messung ermittelt Tape-Tool von EMAN2 e2display.py. Der Wiederholungsabstand der periodischen Oberflächenbedeckung wurde manuell auf ähnliche Weise wie die pilusartigen Anhängsel aus tomographischen Schnitten gemessen, wobei etwa 10–20 Messungen von jedem der drei Tomogramme zumindest kleine Bereiche zeigten, in denen die Wiederholung erkennbar war. Diese Quantifizierung ergab einen Bereich zwischen ~6 und 10 nm, was darauf hindeutet, dass entweder die Schichtkomponenten flexibel sind oder dass die darunter liegende Struktur je nach Schnittwinkel unterschiedliche scheinbare Abstände zwischen ihren Untereinheiten ergeben kann. Darüber hinaus wurden Bereiche, die das Muster in zweidimensionalen Montageprojektionen mit höherer Vergrößerung deutlich deutlicher zeigten, ausgeschnitten, so gedreht, dass sie in einer horizontalen Ebene liegen, gefiltert und maskiert, um Liniendichteprofile parallel zur Außenmembran zu berechnen.

Wir haben zunächst eine tomografische Annotation von drei Merkmalen (periodische Oberflächenbedeckung, Lipidmembranen und pilusartige Anhängsel) für drei Tomogramme mithilfe der halbautomatischen zweidimensionalen neuronalen Netzwerk-basierten Pipeline66 von EMAN2 durchgeführt und eine manuelle Bereinigung falsch positiver Ergebnisse in UCSF durchgeführt Chimera v. 1.1667. Die ausgegebenen Anmerkungswahrscheinlichkeitskarten von EMAN2 v. 2.39 wurden in Segmentierungen umgewandelt, indem ein visuell bestimmter Schwellenwert angewendet und die kontrastumgekehrten Tomogramme mit der Schwellenwert-Annotationskarte multipliziert wurden. Die Segmentierungen wurden mit EMAN2 v. 2.39 tiefpassgefiltert, um Rauschen zu glätten. Da die Komplexität subzellulärer Strukturen jedoch durch die halbautomatischen Annotationen nicht erfasst wurde, haben wir einen ähnlichen Prozess angewendet, um manuell Segmentierungen von fünf Merkmalen (pilusartige Anhängsel, periodische Oberflächenbedeckung, äußere Membran, Matrix und innere Membranen) zu erstellen Anmerkungen, die mit IMOD v. 4.12.9 durchgeführt wurden, gemäß einem aktuellen Protokoll, das die Effizienz manueller Anmerkungen erhöht68. Schnappschüsse für Abb. 6, die RBS-A-Merkmale in Farbe anzeigen, sowie die Zusatzfilme 2 und 3, die Segmentierungsergebnisse zeigen, wurden mit UCSF Chimera v. 1.16 erstellt.

Wir haben zunächst mithilfe der Lichtmikroskopie ein Gitter identifiziert, das RBS-As enthielt. Mit einem Aquilous CryoFIB (ThermoFisher Scientific, MA, USA) haben wir fünf Lamellen mit 30 kV, 30 pA Strom und 5 µs Dauer erzeugt. Die Proben wurden dann zur Probenbeobachtung und Datenerfassung in ein KryoTEM geladen. Wir konnten keine RBS in den Lamellen identifizieren.

Als Kontrollen wurden Zellkulturen von axenischem Escherichia coli MG1655, nicht-axenischem Skeletonema costatum LB 2308 (UTEX Culture Collection of Algae an der University of Texas at Austin, Austin, TX, USA), Caulobacter crescentus CB15N und Simonsiella muelleri ATCC 29453 hergestellt. E. coli wurde in LB-Brühe kultiviert und bei 37 °C gezüchtet, S. costatum wurde in Erdschreiber-Medium bei 20 °C mit einem ~12-stündigen Licht- und ~12-stündigen Dunkelzyklus kultiviert, C. crescentus wurde in PYE-Medium bei 30 °C kultiviert °C, und S. muelleri wurde in BSTSY-Medium (2,75 % (w/v) Tryptic Soy Broth, 0,4 % (w/v) Hefeextrakt, 10 % Rinderserum) bei 37 °C kultiviert.

Alle FISH-Sonden wurden bei Integrated DNA Technologies (Coralville, USA) mit HPLC-Reinigung bestellt. Sondensequenzen und Fluoreszenzmarkierungen sind wie folgt: Euk-1209: 5'-GGGCATCACAGACCTG-/3Alx660/−3', Bact338: 5'-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-/Alx488/−3', BET42a: 5'-/Alx594/-GCCTTCCCACTTCGTTT- 3', GAM42a: 5'-/Alx488/-GCCTTCCCACATCGTTT-3', nonEUB: 5'-/Cy5/-ACTCCTACGGGAGGCAGC-3'.

Zellen von Kontrollen und RBS-As wurden in Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt. Um eine ausreichende Biomasse aus Delfin-Mundabstrichen sicherzustellen, wurden Zellen aus vier Abstrichen in einem einzigen Röhrchen kondensiert. Das FISH-Protokoll wurde aus Lit. angepasst. 69. Die Zellen wurden in 1 ml 3,7 % Formaldehydlösung (800 μl DEPC-behandeltes Wasser, 100 μl 10X PBS, 100 μl 37 % Formaldehyd) 30 Minuten lang unter leichtem Schütteln bei 700 U/min fixiert. Die Zellen wurden dann zweimal in 1 ml 1X PBS gewaschen und in einer Mischung aus 300 μl DEPC-behandeltem Wasser und 700 μl 200-prozentigem Ethanol unter leichtem Schütteln bei 700 U/min 2 Stunden lang permeabilisiert. Die Sonden wurden zu 50 μl Hybridisierungslösung bis zu einer Endkonzentration von 1 μM pro Sondensatz hinzugefügt. Für BET42a und GAM42a enthielt die Hybridisierungslösung 55 % Formamidlösung (4 ml DEPC-Wasser, 1 g Dextransulfat, 4,85 ml Formamid, 1 ml 2X SSC, mit DEPC behandelt auf ein Gesamtvolumen von 10 ml gebracht). Wasser); Für andere Sonden enthielt die Hybridisierungslösung 40 % Formamid (5 ml DEPC-Wasser, 1 g Dextransulfat, 3,53 ml Formamid, 1 ml 2X SSC, mit DEPC-behandeltem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 10 ml gebracht). . Für BET42a und GAM42a wurden die Zellen 1 Stunde lang in 50 µL Hybridisierungspuffer mit Sonden bei 46 °C inkubiert; Für andere Sonden wurden die Zellen über Nacht in 50 µL Hybridisierungspuffer mit FISH-Sonden bei 30 °C inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit einer Waschlösung (2 ml 20X SSC-Puffer, 7,06 ml Formamid, 10,94 ml DEPC-behandeltes Wasser) gewaschen und in 2X SSC-Puffer resuspendiert. Ein Mikroliter Zellen wurde zur Bildgebung auf 1 % Agarose-Pads montiert, die PBS und 5 µg mL−1 DAPI enthielten. Bilddaten wurden mit FIJI v. 2.0.070 verarbeitet.

Für die Sequenzierung des 16S-rRNA-Gen-Amplikons wurden 54 orale Delfinproben ausgewählt. Genomische DNA wurde aus oralen Proben von Delfinen und 32 Negativkontrollen (PBS) mit dem DNeasy UltraClean 96 Microbial Kit (Qiagen Kat.-Nr. 10196-4) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die 16S-rRNA-V4-Region wurde mit 515F- und 806rB-Primern unter Verwendung des Platinum™ II HotStart PCR Master Mix (ThermoFisher Kat.-Nr. 14000013) amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden im gleichen Volumen gepoolt und gelgereinigt. Die endgültige Reinigung wurde mit Macherey-Nagel NucleoSpin Gel und PCR Clean-up, Mini Kit (Fisher, Kat.-Nr. 740609) durchgeführt. Die Amplikons wurden auf der Illumina MiSeq-Plattform mit 250-bp-Paar-Reads in der Stanford Chan Zuckerberg Biohub Facility sequenziert, was zu einer mittleren Lesetiefe von 92.077 Reads führte (min.: 50.772, max.: 265.108).

Das Demultiplexen wurde mit Bcl2Fastq v. 2 (Illumina, CA, USA) durchgeführt. ASVs wurden mit DADA271 v. 1.16.0 abgeleitet, gemäß den Richtlinien im „Big Data Workflow“ (https://benjjneb.github.io/dada2/bigdata_paired.html). Taxonomische Zugehörigkeiten wurden anhand der SILVA 138 SSU-Datenbank72 als Referenz zugewiesen. Vorwärts- und Rückwärtsablesungen wurden auf 240 bzw. 180 nt gekürzt. Diese Pipeline ergab insgesamt 1116 Taxa und 5.339.751 Lesevorgänge in den 54 Proben. ASVs wurden mit Phyloseq v. 1.28.072 analysiert.

Um zu bestätigen, dass unsere DNA-Extraktions-, Amplifikations-, Sequenzierungs- und bioinformatische Analyse-Pipeline in der Lage war, Mitglieder der Familie Neisseriaceae zu identifizieren, führten wir ein Spike-in-Experiment durch. Wir haben zunächst eine orale Probe eines Delfins ausgewählt, die RBS-As enthielt, wie durch Phasenkontrastmikroskopie bestimmt. Anschließend haben wir zwei Aliquots dieser Probe erstellt. Dem ersten Aliquot haben wir Zellen aus einer S. muelleri-Reinkultur im Verhältnis 1:1 zugesetzt. Das andere Aliquot blieb unberührt. Diese beiden Proben wurden zusammen mit einem Aliquot der S. muelleri-Reinkultur (Positivkontrolle) einer DNA-Extraktion, PCR-Amplifikation und einem Sequenzierungsprotokoll wie oben beschrieben unterzogen. Die drei Proben wurden in einem einzigen Illumina MiSeq-Lauf sequenziert, der sich nicht in derselben Spur wie die anderen Amplikonproben aus dieser Studie befand. Beachten Sie, dass bei der PCR-Amplifikation von S. muelleri in derselben Laborumgebung wie die negative Kontrollprobe und der anschließenden Sequenzierung auf derselben Spur mit einer gewissen Kreuzkontamination zu rechnen ist. Bei der ersten Sequenzierung der Negativkontrollprobe (in Abwesenheit von S. muelleri-Reinkulturen im Labor) wurden keine Amplikons der Familie Neisseriaceae nachgewiesen.

Um Kandidatenidentitäten für RBS-As zu erhalten, verwendeten wir einen Mini-Metagenomics-Ansatz. Um die Kontamination durch fremde DNA zu begrenzen, wurden Reagenzien, Röhrchen und PBS mit 11,4 J cm−2 ultraviolettem Licht gemäß den Richtlinien in Lit. behandelt. 72. RBS-As wurden mit einem Umkehrmikroskop Olympus IX70 (Olympus, Waltham, USA) mit einem 40X-Objektiv und Hoffman-Modulationsoptik sichtbar gemacht. Ein Eppendorf TransferMan-Mikromanipulator (Eppendorf, Hamburg, Deutschland, Kat.-Nr. 5193000020) mit einem SAS-10-Mikroinjektor wurde verwendet, um RBS-As mit Polkörperbiopsie-Mikropipetten (30° abgewinkelt, abgeschrägt und poliert mit einem Innendurchmesser von 13–13 mm) einzufangen. 15 μm) (Cooper Surgical, Målov, Dänemark, Kat. #MPB-BP-30). Nachdem ein RBS-A oder eine Kette von RBS-As erfasst wurde, wurde die Mikropipettenspitze in ein Sammelröhrchen mit 1X PBS überführt und in das Röhrchen gedrückt, um sicherzustellen, dass das RBS-A(s) im Röhrchen abgelagert wurde. Diese Vorsichtsmaßnahme wurde getroffen, da RBS-As häufig an der Glasmikropipette haften blieb und nicht entfernt werden konnte. Es wurden keine Delfinzellen eingefangen, obwohl zellfreie DNA und kleine Nichtzielzellen aus der Probe wahrscheinlich zusammen mit RBS-As als Kontaminanten erfasst wurden, basierend auf der Neigung der letzteren, sich an andere Arten zu binden (Abb. 5e). Es wurden vier RBS-As-Röhrchen (Probennamen RBS1–4) sowie vier Negativkontrollröhrchen (NEG1–4) gesammelt. Negativkontrollen bestanden aus PBS-Entnahmen aus derselben Probe, die keine sichtbaren Zellen enthielten und ansonsten genauso behandelt wurden wie RBS-A-haltige Proben.

Die DNA aus jedem Röhrchen wurde über MDA unter Verwendung des Repli-g-Einzelzellkits (Qiagen, Hilden, Deutschland, Kat.-Nr. 150343) gemäß dem Protokoll des Herstellers amplifiziert. Die DNA wurde unter Verwendung einer Zymo Clean and Concentrate Spin Column (Zymo Research Corporation, Irvine, USA, Kat.-Nr. D4013) gereinigt und Bibliotheken wurden unter Verwendung des Kapa Hyper Prep Kit (Kapa Biosystems, Wilmington, USA, Kat.-Nr. KK8504) hergestellt WM Keck Center for Comparative Functional Genomics an der University of Illinois, Urbana-Champaign. Die acht Bibliotheken wurden mit der Illumina MiSeq 2 × 250 nt P2 V2-Plattform sequenziert. Die RBS-A-Proben RBS1, RBS2, NEG1 und NEG2 wurden gepoolt und über eine einzelne Spur sequenziert, was 11.371.243 Lesepaare ergab, und die Proben RBS3, RBS4, NEG3 und NEG4 wurden gepoolt und über 1,5 Spuren sequenziert, was zusammen 19.615.690 Lesepaare ergab. Sequenzierungsadapter wurden im Keck Center rechnerisch entfernt.

Lesevorgänge aus allen acht Proben wurden mit SPAdes v. 3.11.173 mit den angegebenen Modi „Einzelzelle“ (–sc) und „Sorgfältig“ (–careful) zusammengefügt. Für den Zusammenbau wurden insgesamt 61.973.866 Lesepaare verwendet, was zu 1406 Gerüsten mit einer Länge von ≥ 5 kbp und einer Gesamtlänge von 17.438.233 bp und einem N50 von 14.592 für Gerüste mit einer Länge von ≥ 5 kbp führte. Proteinkodierende Gene wurden mit Prodigal v. 2.6.274 identifiziert. Die durchschnittliche Abdeckung pro Gerüst wurde berechnet, indem Lesevorgänge pro Probe der Co-Assembly mit Bowtie2 v. 2.2.475 zugeordnet wurden, wobei die Tiefenfunktion von samtools v. 1.676 zur Berechnung der Leseabdeckung pro Basis und ein benutzerdefiniertes Skript zur Berechnung des Durchschnitts pro Basis verwendet wurden Leseabdeckung pro Gerüst.

Eine Suche nach dem amiC2-Gen in Behältern, die aus dem Mini-Metagenomics-Experiment gewonnen wurden, wurde durchgeführt, indem das Pfam-Alignment PF01520 mit den Proteinsequenzen jedes Genoms abgefragt wurde, wobei HMMER Suite v. 3.1b277 verwendet wurde.

Um die taxonomische Identität sequenzierter Zellen zu bestimmen, verwendeten wir einen genomaufgelösten Ansatz. Die Zuordnung von Gerüsten zu Genom-Bins erfolgte anhand der Tetranukleotidfrequenzen aller Gerüste mit einer Länge von ≥ 5 kbp über Fenster von 5 kbp, wie in Lit. beschrieben. 78. Die Ergebnisse wurden mit der Databionics ESOM Tools-Software Version 1.179 berechnet und visualisiert, was zur Rekonstruktion von 18 Genom-Bins führte (ergänzende Abbildung 3). Um die Behälter zu verfeinern, haben wir Gerüste entfernt, bei denen <50 % der Schlüssel dem Behälter zugewiesen waren. Gerüste mit einer Länge von <5 kbp wurden nicht eingeteilt. Die Vollständigkeit und Kontamination pro Behälter wurden mit CheckM v. 1.0.780 bewertet. Um zu bewerten, wie repräsentativ das Binning der sequenzierten Genome war, schätzten wir die Anzahl der prokaryotischen Genome, die voraussichtlich wiederhergestellt werden, indem wir die Metagenomanordnung nach einem Satz von 16 bakteriellen Einzelkopiegenen (bSCGs) durchsuchten, von denen angenommen wurde, dass sie in jedem Genom vorhanden sind eine einzelne Kopie81, nämlich die ribosomalen Proteine ​​L2, L3, L4, L5, L6, L14, L15, L16, L18, L22, L24, S3, S8, S10, S17 und S19. Ausrichtungen für diese Proteine ​​(PF00181, PF00297, PF00573, PF00281, PF00347, PF00238, PF00828, PF00252, PF00861, PF00237, PF17136, PF00189, PF00410, PF00338, PF0 0366 und PF00203) wurden aus der Pfam-Datenbank82 (abgerufen im März 2019) und bezogen mit HMMER Suite v. 3.1b277 anhand unseres Datensatzes abgefragt. Die mittlere Anzahl jedes bSCG betrug 10, was darauf hindeutet, dass in unserem Sequenzierungsdatensatz etwa 10 prokaryotische Genome vertreten waren. Im Fall des interessierenden Genoms der Familie Alcaligenaceae wurde das 16S-rRNA-Gen manuell vom Ende eines Gerüsts aus verlängert; Mit Bowtie2 v. 2.2.4 haben wir sichergestellt, dass die Lesevorgänge die endgültige Sequenz unterstützen.

Die taxonomische Identifizierung von Bins stellte eine Herausforderung dar, da 16S/18S-rRNA-Gene nicht zuverlässig amplifiziert/sequenziert/assembliert wurden und die Genome unvollständig waren und nur wenige phylogenetisch informative bSCGs im Datensatz vorhanden waren. Daher haben wir BLAST v. 2.2.3083 verwendet, um alle proteinkodierenden Gene aus jedem Genom mit einem E-Wert von 10–10 anhand der nicht-redundanten NCBI-Proteindatenbank abzufragen, und taxonomische Zuordnungen wurden basierend auf der engsten Proteinübereinstimmung vorgenommen. Taxonomische Zuordnungen im Genom-Bin wurden als sehr wahrscheinlich angesehen, wenn ≥50 % der Top-BLAST-Treffer von einem einzelnen Taxon stammten, und wurden als plausibel angesehen, wenn <50 %, aber ≥33 % der Top-BLAST-Treffer von einem einzelnen Taxon stammten.

Es gibt zahlreiche Ansätze, mit denen man beurteilen kann, ob ein Behälter in einer Stichprobe „vorhanden“ ist, jeder mit weitgehend willkürlichen Schwellenwerten. Wir haben uns auf die relative Häufigkeit jedes Bins pro Probe konzentriert (Ergänzungstabelle 4), da sie die Länge jedes Bins berücksichtigt und Vergleiche zwischen Proben mit unterschiedlicher Anzahl von Lesepaaren ermöglicht16.

Phylogenien mit maximaler Wahrscheinlichkeit der Familie Alcaligenaceae wurden unter Verwendung des 16S-rRNA-Gens (ergänzende Abbildung 4a) und des ribosomalen Proteins S3 (ergänzende Abbildung 4b) abgeleitet, um die taxonomische Zugehörigkeit von Bin 16 zu bestätigen, die aus dem Mini-Metagenomics-Experiment gewonnen wurde. Für jede charakterisierte Gattung in der Familie der Alcaligenaceae wurden Gen-/Proteinsequenzen erfasst, wie im NCBI Taxonomy Browser (abgerufen im August 2022) gezeigt, als solche Sequenzen im NCBI-System verfügbar waren (einige Gattungen weisen eine geringe oder keine genomische Darstellung auf). Wir haben zusätzlich BLAST83 v. 2.2.30-Abfragen des bin 16 16S rRNA-Gens und des rpS3-Proteins anhand der nr/nt- bzw. nr-Datenbanken durchgeführt (Zugriff im August 2022) und die zehn ähnlichsten Sequenzen einbezogen. 16S-rRNA-Gensequenzen wurden mit SINA84 v. 1.2.11 abgeglichen, wobei die SILVA SSU-Datenbankversion 138.1 als Referenz verwendet wurde, und Spalten mit >3 % Lücken oder Zeilen mit <50 % Sequenz wurden entfernt. rpS3-Proteinsequenzen wurden mit Clustal Omega85,86 v. 1.2.4 abgeglichen und Spalten mit >5 % Lücken oder Zeilen mit <50 % Sequenz wurden entfernt. Beide Phylogenien wurden mithilfe von PhyML87 v. 3.1 mit 1000 Bootstrap-Replikaten abgeleitet, wobei die Modellauswahl mithilfe einer intelligenten Modellauswahl88 durchgeführt wurde (GTR+R für das 16S-rRNA-Gen und Q.yeast+G+I für das rpS3-Protein). Bäume wurden mit iTOL89 v. 6 visualisiert.

Vier orale Delfinproben, bei denen bestätigt wurde, dass sie RBS enthalten, wurden für die Kultivierungsbemühungen ausgewählt. Für jede Probe wurde ein Milliliter steriles PBS in ein 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen gegeben, das die orale Abstrichprobe enthielt. Für die Flüssigkultivierung wurden 600 µL jeder Probe verwendet, um 3 ml BSTSY90 (2,75 % (w/v) Tryptic Soy Broth, 0,4 % (w/v) Hefeextrakt, 10 % Rinderserum), SHI91 oder mSHI-Medium zu beimpfen (SHI ergänzt mit 0,9 g/L NaCl, 2,5 g/L K2PO4, 0,84 g/L NaHCO3, 0,17 g/L CaCl2, 0,04 g/L MgCl2·6H2O und 5 g/L Dextrose). BSTSY wurde aufgrund seiner Verwendung bei der erfolgreichen Kultivierung von Bakterien (insbesondere S. muelleri) aus den Mundhöhlen verschiedener Säugetiere ausgewählt90. SHI wurde ausgewählt, weil dieses Medium darauf ausgelegt war, Gemeinschaften mit hoher Diversität zu erhalten, die aus der menschlichen oralen Mikroflora stammen. mSHI (modifiziertes SHI) wurde als Version von SHI mit höherem Salzgehalt aufgenommen, um die Bedingungen, die in der Mundhöhle von Delfinen herrschen könnten, weiter nachzuahmen. Die Inokulation wurde unter anaeroben Bedingungen in einer anaeroben Kammer (COY Lab Products, Grass Lake, USA) wiederholt; Beachten Sie, dass alle Proben vor der Kultivierung zwangsläufig Luftsauerstoff ausgesetzt waren. Die Kulturen wurden bei 37 °C inkubiert, um die Körpertemperatur von Delfinen nachzuahmen. Durch visuelles Screening unter einem Mikroskop wurden nach ca. 24, ca. 48, ca. 72 und ca. 96 Stunden keine RBS in flüssigen Medien nachgewiesen. Für die Festoberflächenkultivierung wurden ~103–104 Zellen (durch Mikroskopie wurde bestätigt, dass sie RBS-As enthalten) direkt auf BSTSY- oder BHI-Blut-Agarplatten (BHI-Medium, ergänzt mit 5 % Schafsblut) ausplattiert und bei 37 °C mit inkubiert bzw. ohne Sauerstoff. Nach dreiwöchiger Inkubation wuchsen keine Kolonien auf den BSTSY-Platten; Die auf den BHI-Blutplatten gewachsenen Kolonien wurden mikroskopisch untersucht und es waren keine RBS sichtbar. Im Gegensatz dazu entwickelte eine Kontrolle von S. muelleri, die auf BSTSY-Platten ausgestrichen wurde, nach ein bis zwei Tagen Inkubation mit Sauerstoff bei 37 °C sichtbare Kolonien, und es wurde unter dem Mikroskop bestätigt, dass die Kolonien aus Zellen mit der für S. muelleri erwarteten Morphologie bestanden.

Aufgrund des explorativen Charakters dieser deskriptiven Studie wurden die meisten Experimente zur Charakterisierung der RBS ein einziges Mal durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Sequenzierungsdaten für dieses Projekt sind über NCBI BioProject PRJNA174530 verfügbar. Rohdaten für die Amplikon-Umfrage wurden bei SRA hinterlegt und sind mit den BioSamples SAMN32739817-69 und SAMN19012476 verknüpft. Die Daten für das Spike-in-Experiment sind mit BioSamples SAMN32869723-5 verknüpft. Rohdaten für das Einzelzell-Genomik-Experiment wurden ebenfalls bei SRA hinterlegt; Die erfassten RBS und Negativkontrollen wurden physisch von einem einzelnen oralen Abstrich abgeleitet, der durch BioSample SAMN19012476 dargestellt wird, während die Messwerte aus den acht experimentellen Replikaten (vier RBS, vier Negativkontrollen) jeweils einzeln mit BioSamples SAMN19022663-SAMN19022670 verknüpft sind. Der Zusammenbau von Gerüsten mit einer Länge von ≥5 kb aus dem Einzelzell-Genomik-Experiment wurde nach der Entfernung von vom Menschen stammenden Sequenzen als Whole Genome Shotgun-Projekt bei DDBJ/ENA/GenBank unter der Zugangsnummer JAHCSF000000000 hinterlegt. Die in diesem Dokument beschriebene Version ist JAHCSF010000000. Die Genom-Bins 2–5 und 7–18 aus dem Einzelzell-Genomik-Experiment wurden als Whole Genome Shotgun-Projekt bei DDBJ/ENA/GenBank unter den Akzessionen JAGYHI000000000-JAGYHX000000000 hinterlegt. Die in diesem Dokument beschriebenen Versionen sind JAGYHI010000000-JAGYHX010000000. Genom-Bin 1 (Mensch) wurde nicht hinterlegt. Gerüste für Genom bin6 (<100.000 Nukleotide) wurden als Nicht-Genom-GenBank-Einreichung unter den Zugangsnummern MZ126582-MZ126593 hinterlegt. Die in dieser Studie verwendeten öffentlichen Datensätze und Datenbanken sind wie folgt: Die SILVA SSU-Datenbankversion 138.1 wurde als Referenz für die Zuweisung taxonomischer Identitäten zu ASVs verwendet. Die NCBI-Datenbanken nr/nt, nr und Taxonomie (abgerufen im August 2022) wurden verwendet, um 16S-rRNA-Gensequenzen (n = 77) und ribosomale Protein-S3-Sequenzen (n = 63) für Vertreter von Gattungen der Familie Alcaligenaceae zu erhalten. Die NCBI-Zugangsnummern für diese Sequenzen sind in den ergänzenden Abbildungen verfügbar. 4 bzw. 5. Schließlich führten wir Analysen mit Alignments durch, die aus der Pfam82-Datenbank stammten. Das Pfam-Alignment PF01520 wurde verwendet, um Genom-Bins nach AmiC2-Proteinen zu durchsuchen (abgerufen im August 2022). Die folgenden Pfam-Alignments wurden verwendet, um nach 16 bakteriellen Einzelkopie-Genen zu suchen (abgerufen im März 2019): PF00181, PF00297, PF00573, PF00281, PF00347, PF00238, PF00828, PF00252, PF00861, PF00237, PF17136, PF0 0189, PF00410, PF00338, PF00366 und PF00203.

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Wir danken den Mitgliedern des Relman-Labors für aufschlussreiche Diskussionen, Katharine Ng und Brian Yu für ihre Unterstützung bei Versuchen, RBS-As mittels Laser-Capture-Mikrodissektion bzw. Mikrofluidik einzufangen, Melissa Clark für ihre Unterstützung bei der Gram-Färbung und Michael Schmid für die Analyse der periodischen Oberfläche Berichterstattung über RBS-A und insbesondere Celeste Parry und Kollegen vom US Navy Marine Mammal Program in San Diego, Kalifornien, für die Sammlung oraler Proben von Delfinen. Diese Arbeit wurde durch das NIH-Stipendium P41GM103832 (WC), ein James S. McDonnell Postdoctoral Fellowship (HS), den Österreichischen Wissenschaftsfonds (TV, SB) und das Thomas C. and Joan M. Merigan Endowment an der Stanford University (DAR) unterstützt. . KCH und DAR sind Chan Zuckerberg Biohub Investigators.

Natasha K. Dudek

Aktuelle Adresse: Quantori, Cambridge, MA, 02142, USA

Megan Mayer

Aktuelle Adresse: Department of Biological Chemistry and Molecular Pharmacology, Harvard Medical School, Boston, MA, 02115, USA

Medizinische Fakultät, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, 94305, USA

Natasha K. Dudek und David A. Relman

Abteilung für Ökologie und Evolutionsbiologie, University of California, Santa Cruz, Santa Cruz, CA, 95064, USA

Natasha K. Dudek

Abteilung für Bioingenieurwesen, Stanford University, Stanford, CA, 94305, USA

Jesus G. Galaz-Montoya, Handuo Shi, Cristina Danita, Gong-Her Wu, Kerwyn Casey Huang und Wah Chiu

Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, 94305, USA

Handuo Shi, Arianna I. Celis, Kerwyn Casey Huang, Wah Chiu und David A. Relman

Abteilung für KryoEM und Bioimaging, SSRL, SLAC National Accelerator Laboratory, Menlo Park, CA, 94025, USA

Megan Mayer & Wah Chiu

Abteilung für funktionelle und evolutionäre Ökologie, Gruppe Umweltzellbiologie, Universität Wien, Wien, Österreich

Tobias Viehböck & Silvia Bulgheresi

Abteilung für Mikrobielle Ökologie, Zentrum für Mikrobiologie und Umweltsystemwissenschaften und Vienna Doctoral School of Ecology and Evolution, Universität Wien, Wien, Österreich

Tobias Viehböck

Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, 94305, USA

Barry Behr

Chan Zuckerberg Biohub, San Francisco, CA, 94158, USA

Kerwyn Casey Huang und David A. Relman

Abteilung für Infektionskrankheiten, Veterans Affairs Palo Alto Health Care System, Palo Alto, CA, 94304, USA

David A. Relman

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Konzeptualisierung: NKD, KCH, DAR Methodik und Untersuchung: NKD, JGG-M., HS, MM, CD, AIC, G.-HW, TV, SB, BB, KCH, WC, DAR Formale Analyse: NKD, JGG-M ., HS, CD Visualisierung: NKD, JGG-M., HS, CD Schreiben – Originalentwurf: Das Manuskript wurde hauptsächlich von NKD und JGG-M verfasst. Basierend auf dem Originalentwurf von NKD, mit Überarbeitungen aller anderen Autoren. Schreiben – Rezension und Bearbeitung: alle Autoren. Aufsicht: KCH, WC, DAR

Korrespondenz mit David A. Relman.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Brian Hedlund und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Dudek, NK, Galaz-Montoya, JG, Shi, H. et al. Bisher nicht charakterisierte rechteckige Bakterienstrukturen im Delfinmaul. Nat Commun 14, 2098 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37638-y

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Eingegangen: 01. November 2021

Angenommen: 23. März 2023

Veröffentlicht: 13. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37638-y

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