Molekulares Schicksal

Nature Band 615, Seiten 482–489 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Die Schutzwirkung von Serumantikörpern resultiert aus dem Zusammenspiel antigenspezifischer B-Zellklone unterschiedlicher Affinität und Spezifität. Diese zelluläre Dynamik liegt Serumspiegelphänomenen wie der ursprünglichen antigenen Sünde (OAS) zugrunde – einer vermuteten Neigung des Immunsystems, sich wiederholt auf die erste Kohorte von B-Zellen zu verlassen, die von einem antigenen Stimulus angegriffen werden, wenn es auf verwandte Antigene trifft, was sich nachteilig auf die Induktion von Antigenen auswirkt De-novo-Antworten1,2,3,4,5. Die Unterdrückung neuer, variantenspezifischer Antikörper vom OAS-Typ kann ein Hindernis für die Impfung gegen sich schnell entwickelnde Viren wie Influenza und SARS-CoV-26,7 darstellen. Die genaue Messung der Unterdrückung des OAS-Typs ist eine Herausforderung, da zelluläre und zeitliche Ursprünge nicht ohne weiteres den im Umlauf befindlichen Antikörpern zugeschrieben werden können. seine Auswirkung auf nachfolgende Antikörperreaktionen bleibt daher unklar5,8. Hier stellen wir einen Ansatz zur molekularen Schicksalskartierung vor, mit dem Serumantikörper, die aus bestimmten Kohorten von B-Zellen stammen, differenziell nachgewiesen werden können. Wir zeigen, dass Serumreaktionen auf sequentielles homologes Boosting überwiegend von primären Kohorten-B-Zellen herrühren, während die spätere Induktion neuer Antikörperreaktionen von naiven B-Zellen stark unterdrückt wird. Eine solche „primäre Abhängigkeit“ nimmt als Funktion der Antigendistanz stark ab, was eine Reimmunisierung mit divergenten viralen Glykoproteinen ermöglicht, um De-novo-Antikörperreaktionen zu erzeugen, die auf Epitope abzielen, die in der Priming-Variante fehlen. Unsere Ergebnisse haben Auswirkungen auf das Verständnis von OAS sowie auf die Entwicklung und Prüfung von Impfstoffen gegen sich entwickelnde Krankheitserreger.

Die Fähigkeit von Serumantikörpern, vor Infektionen zu schützen, ist eine neue Eigenschaft der komplexen Mischung von Immunglobulinen, die im Laufe der Zeit von B-Zell-Klonen unterschiedlicher Spezifität und verschiedener Affinitäten sezerniert werden. Die Plasmazellen, die diese Antikörper produzieren, entstehen auf mehreren parallelen Wegen, die von der direkten Differenzierung aus naiven B-Zell-Vorläufern nach einer Primärinfektion oder Immunisierung bis hin zu ausgefeilten Wegen reichen, die eine oder mehrere Runden der Affinitätsreifung in Keimzentren (GCs) und interkalierende Gedächtnis-B-Zellphasen umfassen . Die Komplexität dieser Zellwege nimmt bei wiederholter Antigenexposition deutlich zu9,10,11,12 und ihr letztendlicher Beitrag zum Serumantikörperpool war schwer zu entschlüsseln. Einerseits beurteilen molekulare Analysen von Immunglobulin-Genen aus Gedächtnis- oder GC-B-Zellen die Zusammensetzung der Antikörper im Serum nicht direkt13,14,15,16; Andererseits können direkte Studien der klonalen Zusammensetzung von Serumantikörpern Antikörpern unterschiedlicher Spezifität nicht ohne weiteres einen zellulären oder zeitlichen Ursprung zuordnen17,18. Die klonale Dynamik von Immunphänomenen, die auf Serumebene stattfinden, ist daher nach wie vor wenig verstanden.

Ein Phänomen im Serumspiegel, das besonders schwer zu entschlüsseln ist, ist das OAS, das in den 1950er Jahren als die Tendenz von Personen beschrieben wurde, die einem bestimmten Influenzastamm ausgesetzt waren, mit Antikörpern zu reagieren, die stärker auf den ersten Influenzastamm reagierten, dem sie zuvor begegnet waren Kindheit als auf die Expositionsbelastung selbst1,19. OAS wurde ursprünglich auf die Neigung des Immunsystems zurückgeführt, die erste Kohorte von B-Zellen, die auf ein Antigen reagieren, wiederholt wiederzuverwenden, deren Reaktivität zwangsläufig auf den Stamm ausgerichtet ist, der es ursprünglich hervorgerufen hat. Im Gegensatz zu verwandten Konzepten wie Antigen-Seniorität4,20 erfordert OAS (wie hier definiert) jedoch eine aktive Unterdrückung der De-novo-Rekrutierung neuer B-Zell-Klone aus dem naiven Repertoire nach der Verstärkung2,3,4 und schränkt daher die Fähigkeit des ein Immunsystem, um spezifische Antikörperreaktionen gegen Escape-Epitope auszulösen. Das Ausmaß, in dem diese aktive Unterdrückung existiert und nachfolgende Reaktionen beeinflusst, wird seit Jahrzehnten diskutiert5,8. In jüngerer Zeit haben Experimente zur Kartierung des Schicksals von B-Zellen bei Mäusen gezeigt, dass GCs, die sich als Reaktion auf das Boosting bilden, im offensichtlichen Gegensatz zu den Vorhersagen von OAS, fast ausschließlich aus naiven und nicht aus dem Gedächtnis stammenden B-Zellen bestehen21,22,23. Dieser spätere Zusatz impliziert, dass entweder die Auswirkungen von OAS bei Mäusen vernachlässigbar sind oder dass es sich bei OAS um ein Phänomen handelt, das ausschließlich auf Serumebene beobachtet wird.

Um dieses Problem zu lösen und die Wirkung von OAS auf die Reaktion auf wiederholte Antigenexposition allgemein zu verstehen, müsste man in der Lage sein, solche zellulären Schicksalskartierungsexperimente auf den Serumantikörper selbst zu übertragen. Um dies zu erreichen, haben wir die klassische Fate-Mapping-Strategie angepasst, um den Nachweis des zellulären und zeitlichen Ursprungs von Antikörpern im Serum zu ermöglichen – ein Ansatz, den wir molekulares Fate-Mapping nennen. Wir haben Mäuse entwickelt, bei denen der C-Terminus des Immunglobulin-Kappa (Igκ)-Gens für die leichte Kette (Igk) verlängert wurde, um ein LoxP-flankiertes Flag-Tag zu kodieren, gefolgt von einem stromabwärts gelegenen Strep-Tag (Abb. 1a und erweiterte Daten, Abb. 1). B-Zellen, die dieses „Κ-Tag“-Allel tragen, produzieren Immunglobuline, die mit einem Flag-Tag versehen sind, es sei denn, sie werden der Cre-Rekombinase ausgesetzt. Danach tauschen sie den Flag-Tag dauerhaft gegen einen Strep-Tag aus. Die Cre-vermittelte Rekombination bestimmt daher das Schicksal der Antikörper, die diese B-Zellen und ihre Plasmazellnachkommen auf ihren Oberflächen exprimieren und/oder ins Serum absondern. Dies ermöglicht den differenziellen Nachweis von Igκ+-Antikörpern vor und nach der Schicksalskartierung mithilfe sekundärer Reagenzien, die für jeden Tag spezifisch sind.

a, Schematische Darstellung des IgkTag-Allels (K-Tag) vor und nach der Cre-vermittelten Rekombination. UTR, nicht übersetzte Region. b: Durchflusszytometrieanalyse von Blut-B-Zellen, die die Expression von Flag- und Strep-markierten B-Zellrezeptoren bei Mäusen des angegebenen Genotyps zeigt. c: Western-Blot-Analyse von Serum von Mäusen des angegebenen Genotyps, gefärbt auf Igκ-Leichtkette oder Flag/Strep-Tags. Repräsentativ für zwei Experimente. d, Schematische Darstellung der Immunisierungsstrategie zur Bestimmung des Schicksals von GC-B-Zellen und ihrer Antikörperproduktion. e, Durchflusszytometrie-Analyse des poplitealen Lymphknotens 12 Tage nach Fußballenimmunisierung mit TNP-KLH in Alaun-Adjuvans. B-Zellen (B220+CD4−CD8−CD138−) wurden auf GC- (Fas+CD38−) und follikuläre (Fo) B-Zellmarker (Fas−CD38+) gefärbt. f, Quantifizierung der Daten in e. Jeder Punkt stellt einen einzelnen Lymphknoten dar und die Balken stellen die Medianwerte dar. g, Anti-TNP-Gesamt-IgG- und Tag-spezifische Endpunkttiter, bestimmt durch TNP4-BSA-ELISA in Mäusen, die ip mit TNP-KLH in Alhydrogel-Adjuvans immunisiert wurden. Die dünnen Linien stellen einzelne Mäuse dar und die dicken Linien verbinden die Mediane der logarithmisch transformierten Titerwerte zu jedem Zeitpunkt. Die Ergebnisse stammen von neun Mäusen aus zwei unabhängigen Experimenten. Tmx., Tamoxifen. h, Die relative Affinität von Anti-TNP-Flag+- und Strep+-Antikörpern derselben Proben, dargestellt in g, geschätzt durch ELISA unter Verwendung von TNP1-BSA oder TNP13-BSA als Einfangreagenzien. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung der logarithmisch transformierten Titerwerte. Das Verhältnis zwischen Anti-TNP1-BSA- und Anti-TNP13-BSA-Titern wurde pro Probe berechnet (siehe rechts).

Um die Funktionalität des Κ-Tag-Allels zu überprüfen, stellten wir zunächst fest, dass B-Zellen in IgkTag-Mäusen markierte B-Zell-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche exprimierten. Nach den Regeln des Allelausschlusses24 waren etwa 50 % und 95 % der B-Zellen von Mäusen, die heterozygotes Igk (Wildtyp (WT)/Tag) oder homozygotes IgkTag/Tag-Mäuse exprimierten, Flag+ (erwartungsgemäß etwa 5 % der B-Zellen in homozygoten). Mäuse trugen eine Igλ-Leichtkette24; Erweiterte Daten Abb. 2a). Κ-Tag-Mäuse, in denen alle B-Zellen konstitutiv Cre-Rekombinase (IgkTag/TagCd79aCre/+) exprimierten, ersetzten Flag in fast allen Igκ+-B-Zellen durch ein Strep-Tag (Abb. 1b). Wichtig ist, dass Κ-Tag-Mäuse in Abwesenheit bzw. Anwesenheit von Cre-Rekombinase entsprechende Flag- oder Strep-markierte Antikörper in das Serum sezernierten (Abb. 1c), ohne die Serumantikörperspiegel im Steady-State zu beeinflussen (Extended Data Abb. 2b). Die Erzeugung und Reifung von Κ-Tag-B-Zellen verlief unbeeinträchtigt, was durch den gleichen Anteil markierter und nicht markierter zirkulierender B-Zellen in IgkWT/Tag-Mäusen angezeigt wird (Abb. 1b). Das Gleiche galt für zirkulierende B-Zellen und Knochenmarksplasmazellen, die Flag- und Strep-Tags in IgkFlag/Strepmäusen exprimieren, bei denen eines der beiden Κ-Tag-Allele durch Cre-Expression in der Keimbahn vorrekombiniert wurde (Abb. 1b und Extended Data Abb. 2c).

Um sicherzustellen, dass Flag+- und Strep+-B-Zellen im Verlauf der B-Zell-Aktivierung, Affinitätsreifung und Plasmazelldifferenzierung gleichermaßen konkurrenzfähig waren, haben wir IgkFlag/Strep-Mäuse mit dem Modellantigen 2,4,6-Trinitrophenyl-Keyhole-Limpet-Hämocyanin ( TNP-KLH) in Alaun-Adjuvans und verfolgte die Serumtiter der Antikörper, die jedes Tag trugen, über die Zeit. Um einen direkten Vergleich der Titer von Anti-TNP-Antikörpern mit jedem Tag zu ermöglichen, haben wir Sekundärantikörper (Anti-Flag- oder Anti-Strep-Antikörper) verdünnt, um eine ähnliche Erkennung von Standardkurven zu erreichen, die mit rekombinanten Flag- oder Strep-markierten monoklonalen Antikörpern erstellt wurden (Erweiterte Daten). Abb. 2d). Mithilfe dieser Kurven normalisierte Endpunkt-Titer des Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) zeigten einen ähnlichen Bereich der Anti-TNP-Reaktivität zwischen den Flag+- und Strep+-Fraktionen (Erweiterte Daten, Abb. 2e), was auf eine gleiche Wettbewerbsfähigkeit der unterschiedlich markierten B-Zellen hinweist.

Die Verfolgung des Serumantikörpers, der von B-Zellen produziert wird, die in verschiedenen Stadien der Immunantwort beteiligt sind, erfordert eine zeitlich begrenzte Schicksalskartierung aktivierter B-Zellklone. Um dies zu ermöglichen, kreuzten wir IgkTag-Mäuse mit dem GC-spezifischen, Tamoxifen-induzierbaren S1pr2-creERT2 BAC-transgenen Allel25 (um S1pr2-IgkTag-Mäuse zu erzeugen). Die Behandlung von Mäusen mit Tamoxifen an den Tagen 4 und 8 nach der TNP-KLH-Immunisierung führte zu einer effizienten Rekombination (96,1 ± 0,50 % (Mittelwert ± Standardabweichung) ((Strep+/Tag+) × 100)) des Κ-Tag-Allels in GC-B-Zellen, jedoch nicht in Nicht-GC-B-Zellen im selben Lymphknoten 12 Tage nach der Immunisierung (dpi) (Abb. 1d – f). Auch hier wurden markierte B-Zellen in ähnlichen Anteilen wie nicht markierte B-Zellen in heterozygoten S1pr2-IgkWT/Tag-Mäusen gefunden (im Durchschnitt 41 ± 9,0 % (Mittelwert ± Standardabweichung) Tag+), was darauf hindeutet, dass die Expression des Tags die Wettbewerbsfähigkeit der B-Zellen nicht beeinträchtigt der GC (Extended Data Abb. 2f, g). GC-B-Zellen in Cre–-Tieren (Abb. 1f) oder S1pr2-IgkWT/Tag-Mäusen, die nicht mit Tamoxifen behandelt wurden, blieben Flag+, mit nur minimaler spontaner Rekombination (1,3 ± 1,0 % (Mittelwert ± Standardabweichung) Strep+ am Tag 12 dpi) bei letzteren (Erweiterte Daten Abb. 2g).

Die gesamten Anti-TNP-IgG-Antikörper in S1pr2-IgkTag-Mäusen, die intraperitoneal (ip) mit TNP-KLH in Alhydrogel immunisiert und an den Tagen 4, 8 und 12 mit Tamoxifen behandelt wurden, wurden erstmals im Serum bei 8 dpi nachgewiesen und stiegen progressiv bis 60 dpi an (Abb . 1g). Die Dekonvolution von GC-abgeleiteten (Strep+) und nicht-GC-abgeleiteten (Flag+) Antikörpern zeigte, dass eine anfängliche Welle extrafollikulärer Flag+-Antikörper, die ihren Höhepunkt bei 8 dpi erreichte, nach und nach durch GC-abgeleitete Strep+-Antikörper ersetzt wurde, die erstmals im Serum bei 14 dpi nachgewiesen wurden (Abb. 1g). Flag+-Anti-TNP-Antikörper sanken auf Werte nahe dem Ausgangswert zwischen 47 und 60 dpi zurück, wie aufgrund ihres extrafollikulären Ursprungs zu erwarten war. Ein affinitätsabhängiger Anti-TNP-ELISA zeigte eine nachweisbare Affinitätsreifung nur in der GC-abgeleiteten Strep+-Antikörperfraktion (Abb. 1h), was die effiziente Schicksalskartierung des GC-abgeleiteten Antikörpers bestätigte. Das Hintergrundsignal bei Kontrolltieren, denen kein Tamoxifen verabreicht wurde, blieb während der gesamten Primärreaktion unter der Nachweisgrenze (LOD) (Extended Data, Abb. 2h). Das S1pr2-IgkTag-Mausmodell ermöglicht es uns daher, Antikörper zu erkennen, die aus der ersten Welle von B-Zellen stammen, die als Reaktion auf die Immunisierung eine GC-Reaktion eingingen. Unsere Daten zeigen auch, dass extrafollikuläre Reaktionen in diesen Situationen von relativ kurzer Dauer sind und dass fast alle nach den ersten Wochen der Immunisierung nachweisbaren Antikörper, insbesondere Antikörper mit hoher Affinität, aus Plasmazellen GC-Ursprungs stammten.

Mit diesem System versuchten wir zu messen, inwieweit die Unterdrückung des OAS-Typs die Entwicklung von De-novo-Antikörperreaktionen auf homologes Boosting beeinflusst (wir bezeichnen diese Unterdrückung allgemein als primäre Sucht, um das homologe Regime einzuschließen). Zu diesem Zweck machten wir uns die Fähigkeit zunutze, die Cre-vermittelte Rekombination des Κ-Tag-Allels zeitaufgelöst auszulösen, indem wir Tamoxifen verabreichten, um Serumantikörper zu markieren, die von B-Zellen produziert wurden, die als Reaktion auf die Primärimmunisierung GCs bildeten (die). Primärkohorte). Zusätzlich zur Markierung von B-Zellen der Primärkohorte werden bei diesem Ansatz auch alle Antikörper mit einem Flag-Tag „umgekehrt“, die aus Klonen entstanden sind, die de novo durch nachfolgende Auffrischungsdosen aktiviert wurden. Diese Eigenschaft ermöglicht es uns, zwischen zwei Modellen der Recall-Antikörperantwort zu unterscheiden: (1) einem einfachen sequentiellen Beitragsmodell, bei dem De-novo-Reaktionen zwar kleiner sind als aus dem Gedächtnis abgeleitete, sich aber dennoch mit ähnlicher Kinetik zu einer neuen Primärreaktion entwickeln können , summiert sich, wenn mehr Antigendosen bereitgestellt werden (abhängig vom Antigen-Senior); und (2) ein primäres Suchtmodell (im Zusammenhang mit OAS), bei dem die primäre Reaktion das Auftreten nachfolgender De-novo-Antikörperreaktionen auch nach mehreren Boosts aktiv unterdrückt (Abb. 2a).

a, Schematische Darstellung des sequentiellen Beitrags und der primären Suchtmodelle der Antigenprägung. b, Die allgemeine Immunisierungsstrategie zur Messung der primären Sucht. S1pr2-IgkTag/Tag-Mäuse wurden an den durch schwarze Pfeile angegebenen Tagen mit TNP-KLH in Alaun (c, d) oder WH1-mRNA-LNP (e–g) immunisiert und mit Tamoxifen bei 4, 8 und 12 dpi behandelt, wie durch angegeben die roten Pfeile. c, Anti-TNP-Serum-IgG (links), Igκ (Mitte) und Tag-spezifische Titer (rechts), gemessen mit TNP4-BSA mittels ELISA. Die Ergebnisse stammen von vier Mäusen aus zwei unabhängigen Experimenten. Die dünnen Linien stellen einzelne Mäuse dar und die dicken Linien verbinden die Mediane der logarithmisch transformierten Titerwerte zu jedem Zeitpunkt. d, Der Prozentsatz des TNP-Titers, der aus der primären Kohorte von B-Zellen stammt (der primäre Suchtindex), wurde berechnet, indem der Strep+-Titer jeder einzelnen Probe durch ihren Gesamttiter (Strep+ + Flag+) dividiert und mit 100 multipliziert wurde (S/( S + F) × 100). e, Anti-WH1 RBD IgG (links), Igκ (Mitte) und Tag-spezifische Titer (rechts), gemessen durch ELISA. Die Ergebnisse stammen von 12 Mäusen aus 3 unabhängigen Experimenten. f, Der primäre Suchtindex wurde wie in d beschrieben berechnet. g, Vergleich der De-novo-Flag+-Antikörperreaktionen in Gegenwart oder Abwesenheit einer Primärimmunisierung. WWW, drei Dosen WH1 S-mRNA; ØWW, erste Dosis und Schicksalskartierung weggelassen. WWW-Daten beziehen sich auf dieselben Proben wie in e, erneut gemessen im gleichen Assay wie ØWW. h, Die quartäre Anti-WH1-RBD-Reaktion (links) und der primäre Suchtindex (rechts) bei Mäusen, die 133 Tage nach der vorherigen Dosis eine vierte Dosis mRNA-LNP erhielten, für eine der in e gezeigten Kohorten. Bei zwei der fünf Mäuse wurden am Tag 0 keine Proben entnommen.

Wir haben S1pr2-IgkTag-Mäuse ip mit Alaun-Adjuvans TNP-KLH vorbereitet und Tamoxifen bei 4, 8 und 12 dpi verabreicht, um das Schicksal der primären Kohorten-GC-B-Zellen und ihrer Gedächtnis- und Plasmazellnachkommen zu kartieren (Abb. 2b). In dieser Situation sind alle aus der Primärkohorte stammenden Antikörper Strep+, während alle Antikörper, die von B-Zell-Klonen produziert werden, die de novo durch sekundäres oder höheres Boosting erweitert wurden (einschließlich ihrer Gedächtnis- oder Plasmazellnachkommen), umgekehrt als Flag+ kartiert werden . Da wir uns nicht auf Unterschiede zwischen Antigenvarianten verlassen, um primäre von sekundären oder späteren Antikörpern zu unterscheiden, ist es wichtig, dass dieser Ansatz es uns ermöglicht, die primäre Abhängigkeit im Null-Antigen-Abstand zu messen, d. h. beim Priming und Boosting mit genau demselben Antigen. Da die Unterdrückung von De-novo-Antikörperreaktionen mit zunehmender Antigendistanz wahrscheinlich abnimmt26,27, ermöglicht uns dieser Ansatz, die Stärke der primären Sucht abzuschätzen, wenn sie am stärksten ist.

Eine homologe Auffrischimpfung 1 und 2 Monate nach der Primärimmunisierung führte zu den erwarteten Erhöhungen der Recall-TNP-Titer (Abb. 2c) und zur Bildung von Recall-GCs, die von naiven B-Zellen dominiert wurden21 (Extended Data Abb. 3a). Die Entfaltung dieser Antworten mittels tag-spezifischem ELISA ergab, dass sowohl die Sekundär- als auch die Tertiärtiter stark von Schicksals-kartierten (Strep+)-Antikörpern dominiert wurden, die aus B-Zellen der primären Kohorte stammten. Während Flag+-TNP-spezifische Antikörper auch nach jedem Boost auftraten, erreichten ihre Titer ihren Höhepunkt bei viel niedrigeren Werten und sanken mit der Zeit deutlich ab (Abb. 2c). Wichtig ist, dass entgegen den Erwartungen des sequentiellen Beitragsmodells (Abb. 2a) die Flag+-Titer zwischen der zweiten und dritten Antigendosis, wenn alle Flag+-Gedächtnis-B-Zellen reaktiviert worden wären, nicht progressiv anstiegen. Um beide Maße zu synthetisieren, haben wir einen „primären Suchtindex“ erstellt, der durch Division von Strep+ durch die Gesamttiter von Strep+ + Flag+ (S/(S + F) × 100) berechnet wird. Dies zeigte, dass fast alle nachweisbaren Recall-Antikörper (durchschnittlich 95 % bzw. 97 % der Serumreaktivität 14 Tage nach der ersten bzw. zweiten Auffrischimpfung) aus der B-Zell-Kohorte stammten, die an der primären GC-Reaktion beteiligt war (Abb. 2d). Die Abreicherung von IgM aus Serumproben nach der Auffrischimpfung führte zu einer starken Verringerung der Flag+-, aber nicht der Strep+-Recall-TNP-Titer, was die Annahme stützt, dass naive B-Zellen, die durch Recall aktiviert werden, in erster Linie eine extrafollikuläre (IgM-dominierte) B-Zell-Antwort erzeugen (Extended). Daten Abb. 3b,c).

Um diese Erkenntnisse auf einen klinisch relevanten Kontext auszudehnen, haben wir Mäuse wie in Abb. 2b immunisiert und geboostert, jedoch unter Verwendung eines mit Lipid-Nanopartikeln (LNP) formulierten, nukleosidmodifizierten mRNA-Impfstoffs, der für die präfusionsstabilisierte (2P) Form des SARS-CoV-Virus kodiert. 2 Wuhan-Hu-1 (WH1) Spike (S)-Protein, ähnlich den verfügbaren SARS-CoV-2-mRNA-Impfstoffen28. Sekundäre und tertiäre Anti-S-Protein-Rezeptor-Bindungsdomänen (RBD)-Antikörper stammten wiederum fast ausschließlich aus B-Zellen der primären Kohorte (Strep+) (Abb. 2e, f). Wie bei GC-B-Zellen (Extended Data Abb. 2g) wurde bei Kontrollmäusen, denen kein Tamoxifen verabreicht wurde, eine geringe spontane Rekombination mit Strep+-Antikörpern in Recall-Reaktionen festgestellt. Dies führte zu einer leichten Unterschätzung der Flag+-Antikörpertiter (Median 2,1 % bzw. 2,8 % 2 Wochen nach der zweiten bzw. dritten Immunisierung; erweiterte Daten, Abb. 3d). Obwohl die primäre Abhängigkeit bei SARS-CoV-2 RBD nach der ersten Auffrischimpfung ausgeprägter war als bei TNP-KLH (zu diesem Zeitpunkt wurde kein neuer (Flag+)-Antikörper nachgewiesen), entwickelten 5 von 12 Mäusen niedrige, aber stabile Flag+-Titer Anti-RBD-Antikörper nach der dritten Dosis. Diese Bimodalität war unabhängig von der experimentellen Kohorte und davon, ob die Auffrischung ipsilateral oder kontralateral zur Stelle der Primärdosis erfolgte (Extended Data Abb. 3e) und ist daher wahrscheinlich auf die stochastische Variabilität zurückzuführen, die stark oligoklonalen Erinnerungsreaktionen innewohnt21. Um das Ausmaß zu quantifizieren, in dem De-novo-Antikörperreaktionen auf den Boost durch vorheriges Priming unterdrückt wurden (d. h. das Ausmaß der primären suchtunterdrückenden Wirkung), verglichen wir Flag+-Antikörper bei Mäusen, denen drei Dosen WH1-mRNA-LNPs verabreicht wurden (WWW ) zu einer zusätzlichen Gruppe, in der die Priming- und Fate-Mapping-Schritte weggelassen wurden (ØWW). Die Flag+-Reaktionen waren 4 Wochen nach der letzten Dosis bei WWW-Mäusen im Vergleich zu ØWW-Mäusen um das 55-fache niedriger (Abb. 2g), was auf eine starke Unterdrückung neuer B-Zell-Reaktionen bei geprimten Tieren im Vergleich zu dem hinweist, was sie ohne diese gewesen wären Grundierung. Schließlich hielt die primäre Sucht lange an, da selbst eine vierte Immunisierung einer Untergruppe von Mäusen (>133 Tage nach der vorherigen Auffrischungsimpfung) von Strep-markierten Antikörpern dominiert wurde (Abb. 2h und erweiterte Daten Abb. 3f), was wiederum keinen Nachweis erbrachte der progressive Anstieg der Flag+-Antikörpertiter, der durch ein einfaches sequentielles Beitragsmodell vorhergesagt wird (Abb. 2a). Wir kommen zu dem Schluss, dass die primäre Sucht sehr stark sein kann, wenn sie bei einem Antigenabstand von Null gemessen wird – ein Beweis für die OAS-artige Unterdrückung von De-novo-B-Zell-Reaktionen durch bereits bestehende Immunität.

Um zu messen, wie die primäre Sucht auf eine Vergrößerung des Antigenabstands zwischen Priming- und Boosting-Antigenen reagiert, haben wir historische Serien von gedrifteten Influenzavirus-Hämagglutinin (HA)-Varianten als Modelle verwendet. Wir verwendeten zunächst ein Influenza-Infektions-/Immunisierungsmodell (Abb. 3a), das auf zwei der Stämme basierte, für die OAS ursprünglich beschrieben wurde – A/Puerto Rico/8/1934 (PR8) und A/Fort Monmouth/1/1947 (FM1). 1,19 – davon haben die HAs (HAPR8 und HAFM1) 90 % Identität auf Aminosäureebene (Abb. 3b). Wie bei der Hapten- und mRNA-Immunisierung war die primäre Reaktion auf HAPR8 durch hohe extrafollikuläre (Flag+) Titer gekennzeichnet, die zwischen 8 und 16 Tagen nach der Infektion ihren Höhepunkt erreichten und anschließend durch GC-abgeleitete (Strep+) Titer ersetzt wurden (Abb. 3c). Eine homologe Auffrischung mit rekombinantem HAPR8-Protein subkutan 3 und 4 Monate nach der Infektion führte zu einem Anstieg der Strep+ HAPR8-Bindungstiter um 1 log nach der ersten Auffrischung und zu einem weniger ausgeprägten Anstieg nach der zweiten Auffrischung. Wie bei der Proteinimmunisierung war der Beitrag nicht-primärer (Flag+)-Antikörper zu den Gesamttitern gering – obwohl er zwischen der ersten und der zweiten Auffrischungsimpfung progressiv anstieg, lag sein Spitzenmedianwert bei etwa 10 % der HA-Reaktivität (Abb. 3c). Die heterologe Verstärkung mit HAFM1 führte nur zu einer geringfügigen Rückverstärkung der primären Strep+-HAPR8-Titer und hatte fast keinen Einfluss auf die Flag+-HAPR8-Reaktivität (Abb. 3d), was auf einen erheblichen Antigenabstand zwischen diesen Varianten hinweist. Dementsprechend fehlten kreuzreaktive Primärtiter gegenüber HAFM1 in der primären extrafollikulären Reaktion auf eine PR8-Infektion vollständig und traten erst nach etwa 4 Wochen in der Strep+-Antikörperfraktion auf (Abb. 3d), wahrscheinlich als Nebeneffekt der Affinitätsreifung gegenüber HAPR8 . Heterologes Boosting erhöhte nicht nur diese kreuzreaktiven (Strep+)-Titer um nahezu 1 Log, sondern löste, was noch wichtiger ist, auch erhebliche Reaktionen von De-novo-Klonen aus, die durch das Boosting hervorgerufen wurden, da etwa die Hälfte der gesamten Serumreaktivität gegenüber HAFM1 von Flag+ herrührte Bruchteil nach dem zweiten Boost (Abb. 3d). Der Vergleich dieser Werte mit denen, die durch zwei Dosen HAFM1 ohne vorherige Infektion erreicht wurden, zeigte, dass die primäre Sucht neue Reaktionen um das 3,8-fache unterdrückte (Extended Data Abb. 4a), viel weniger als die 55-fache Unterdrückung, die bei der homologen mRNA-Impfung erreicht wurde (Abb. 2g). Somit umgeht heterologes Boosting teilweise die primäre Abhängigkeit und ermöglicht eine verbesserte Expansion und einen verbesserten Serumbeitrag von variantenspezifischen B-Zell-Klonen, die nicht an der primären Reaktion beteiligt sind.

a, Schematische Darstellung der Influenza-Infektion und der HA-Boosting-Strategie. S1pr2-IgkTag/Tag-Mäuse wurden intranasal mit PR8-Influenza infiziert und zu den angegebenen Zeitpunkten subkutan (sc) mit HAPR8 oder HAFM1 in Alhydrogel geboostet. b, Darstellung der HAPR8-Trimerstruktur (Proteindatenbank (PDB): 1RU7), wobei ein Monomer in Blaugrün hervorgehoben ist und die Aminosäuren, die zwischen HAPR8 und HAFM1 abweichen, in Rot hervorgehoben sind. Die prozentuale Aminosäureidentität ist in Klammern angegeben. c, Anti-HAPR8-Flag+- und Strep+-Titer in S1pr2-IgkTag/Tag-Mäusen, die homolog mit HAPR8 geboostet wurden (links) und Quantifizierung des primären Suchtindex-Scores (rechts). d, Anti-HAPR8- (oben) und Anti-HAFM1-ELISA-Reaktivität (unten) in Mäusen, die heterolog mit HAFM1 geboostet wurden. Gezeigt werden Tag-spezifische Titer (links) und Quantifizierung des primären Suchtindex (rechts). e, Die Divergenz zwischen HANC95 und HANC99 oder HACA09, gefärbt wie in b. Nach dem Vorbild der Struktur von HACA09 (PDB: 3LZG). f, Anti-HA-Tag-spezifische Titer in Mäusen, die mit HANY95-Protein geprimt wurden, gezeigt nach dem ersten Boost mit HANY95 (homolog) oder mit den Varianten HANC99 oder HACA09 (heterolog), wie in Extended Data Abb. 4b dargestellt. Es wird eine Antikörperreaktivität gegenüber dem Boosting-Antigen gezeigt. Der vollständige Zeitverlauf und die Reaktivitäten gegen alle drei HAs, gemessen durch ELISA für die höchste Serumverdünnung, sind in der erweiterten Datenabbildung 4c dargestellt. g, Primärer Suchtindex für die auffrischende HA, 6 Tage (links) und 1 Monat (rechts) nach der zweiten Auffrischung (dritte Dosis). Die P-Werte wurden mithilfe zweiseitiger Student-t-Tests berechnet, wobei der primäre Suchtindex des homologen mit jedem heterologen Boost verglichen wurde. Die dünnen Linien stellen einzelne Mäuse dar und die dicken Linien verbinden die Mediane der logarithmisch transformierten Titerwerte zu jedem Zeitpunkt. Alle Ergebnisse stammen aus zwei unabhängigen Experimenten, wobei die Anzahl der Mäuse in jeder Gruppe in den Diagrammen angegeben ist.

Um diese Annahme über einen größeren Bereich antigenischer Abstände zu verifizieren, haben wir Mäuse ip mit rekombinantem H1 vom Stamm A/New York/614/1995 (HANY95) in Alhydrogel-Adjuvans immunisiert und diese Mäuse dann zweimal geboostert, entweder homolog mit HANY95 oder heterolog mit H1s aus den Stämmen A/New Caledonia/20/1999 (HANC99; ein leicht verschobener Stamm mit 96 % Aminosäureidentität zu HANY95) oder pandemischer A/California/07/2009 (HACA09; ein „Antigen-Shift“-Stamm mit 80 % Aminosäure). Identität; Abb. 3e und erweiterte Daten Abb. 4b). Im Allgemeinen war die primäre Sucht in dieser Situation schwächer und variabler, selbst bei homologer Verstärkung, möglicherweise aufgrund der insgesamt schwachen primären Reaktion, die durch das rekombinante HAPR8-Protein hervorgerufen wurde (Extended Data, Abb. 4c). Dennoch beobachteten wir einen fortschreitenden Rückgang der primären Sucht, da der Antigenabstand zwischen dem primären und dem Boost-Antigen zunahm, sodass bis zu 80 % der gesamten Serumreaktionen auf HACA09 nach der Verstärkung mit diesem Flag markiert waren (entsprechend 20 % der primären Sucht). Variante (Abb. 3f,g). Die Zusammenführung der Daten für die Infektions- und Immunisierungsexperimente entsprechend der Ähnlichkeit zwischen vorbereitenden und verstärkenden HAs zeigte einen hochsignifikanten linearen Rückgang der Primärsucht mit zunehmender Antigendistanz (Erweiterte Daten, Abb. 4d). Wir kommen zu dem Schluss, dass ein erhöhter Antigenabstand zwischen Priming- und Boosting-Antigenen der primären Sucht entgegenwirkt und somit die Erzeugung neuer, variantenspezifischer Antikörperreaktionen ermöglicht.

Ein Umfeld, in dem die Subversion der primären Sucht durch Antigendistanz klinisch wichtig ist, ist die Reaktion auf Omicron-Stämme von SARS-CoV-2 bei Personen, die zuvor Antigenen des WH1-Stamms ausgesetzt waren. Wir verwendeten das K-Tag-System, um abzuschätzen, inwieweit die Verstärkung mit mRNA-LNP, die für das S-Protein des Omicron BA.1-Stamms kodiert, in der Lage war, die primäre Sucht zu überwinden, die durch das Priming mit WH1-S-kodierender mRNA-LNP (dem WH1) erzeugt wurde und BA.1-Stämme weisen eine Aminosäureidentität von 98 % bzw. 92 % in den vollständigen S-Protein- bzw. RBD-Domänen auf. Wir haben S1pr2-IgkTag-Mäuse mit WH1-mRNA-LNP im rechten Bein vorbereitet und diese Mäuse dann 1 und 2 Monate später entweder mit BA.1 oder WH1-mRNA-LNP distal im linken Bein geboostert (Abb. 4a). Die Steigerung induzierte in beiden Gruppen ähnliche Gesamt-IgG-Reaktionen auf WH1- und BA.1-RBDs (Abb. 4b). Im Gegensatz dazu neutralisierten die Seren beider Gruppen ein WH1-Pseudovirus29 gleichermaßen, während das mit BA.1 verstärkte Serum im Durchschnitt 15-fach wirksamer gegen das BA.1-Pseudovirus war, was auf einen starken qualitativen Unterschied zwischen den heterologen und homologen Auffrischungsschemata hinweist. Die Entfaltung dieser Effekte durch Tag-spezifische ELISA ergab Reaktionen auf den WH1-RBD, die zwischen homolog und heterolog geboosterten Tieren nicht zu unterscheiden waren, da primäre (Strep+)-Antikörper in beiden Situationen stark dominant waren und nach der anfänglichen extrafollikulären Reaktion keine wesentliche Flag+-Reaktion auftrat ( Abb. 4c,d). Während nach der Primärimmunisierung kaum bis gar keine Strep+-Antikörper gegen den BA.1-RBD beobachtet wurden, war die Recall-Strep+-Reaktivität gegen den BA.1-RBD gleich stark, unabhängig davon, welche Variante zur Auffrischung verwendet wurde (Abb. 4c,d). Diese Beobachtung stimmt mit früheren Berichten überein, die die Entwicklung der Kreuzreaktivität mit anderen Stämmen als Folge der Affinitätsreifung zur WH1-Impfung beim Menschen dokumentieren30. Wichtig ist jedoch, dass die heterologe Verstärkung zu einem deutlichen Anstieg der BA.1-RBD-Titer führte, die von neu rekrutierten (Flag+)-Klonen erzeugt wurden, die nicht mit dem WH1-Stamm kreuzreaktiv waren, eine Reaktivität, die sonst bei Mäusen fehlte, die homolog verstärkt wurden (Abb. 4c, d). ). Auf ihrem Höhepunkt (2 Wochen nach der zweiten Auffrischimpfung) machten Strep+-Antikörper durchschnittlich 73 % (±19 % Standardabweichung) der gesamten Anti-BA.1-Reaktivität bei heterolog aufgefrischten Mäusen aus (Abb. 4d). Die Induktion neuer (Flag+)-Antikörper nach doppeltem BA.1-Boost war noch deutlicher, als die Reaktivität gegen die Volllängenproteine ​​WH1 und BA.1 S untersucht wurde (Abb. 4e). Zwei Dosen BA.1 ohne vorherige WH1-Immunisierung (ØBB) führten zu Reaktionen, die nur 3,6-fach höher waren als in der WBB-Gruppe (WH1-BA.1-BA.1) (ein Unterschied, der keine statistische Signifikanz erreichte; Abb. 4f) zeigt erneut, dass die Wirkung der primären Sucht in dieser Situation im Vergleich zu der bei homologem Boosting beobachteten Wirkung stark reduziert ist (Abb. 2g). Wir kommen zu dem Schluss, dass BA.1 ausreichend von WH1 abweicht, um erhebliche De-novo-Antikörperreaktionen auszulösen, auch wenn es nicht in der Lage ist, die primäre Sucht vollständig zu überwinden. Darüber hinaus besteht der Hauptunterschied zwischen homologem und heterologem Boosten darin, dass nur letzteres eine robuste De-novo-Reaktion auf den driftenden Stamm hervorrufen kann.

a, Schematische Darstellung der Immunisierungsstrategien. b, Anti-WH1- (links) und BA.1-RBD-IgG-Titer (Mitte) und NT50 des BA.1-Pseudovirus (rechts) 2 Wochen nach der angegebenen Dosis in homolog (WWW) oder heterolog (WBB) immunisiertem S1pr2-IgkTag/Tag Mäuse. P-Werte wurden mithilfe zweiseitiger t-Tests berechnet. FC, Faltwechsel. c, Entwicklung der Anti-WH1- und BA.1-RBD-Tag-spezifischen Titer. Die dünnen Linien stellen einzelne Mäuse dar und die dicken Linien verbinden die Mediane der logarithmisch transformierten Titerwerte. d, Vergleich der in c gezeigten Flag- und Strep-Anti-RBD-Titer 2 Wochen nach der dritten Impfung (links) zusammen mit dem primären Suchtindex (rechts). P-Werte wurden mithilfe zweiseitiger t-Tests berechnet. e, Anti-Full-S-Tag-spezifische Titer und der primäre Suchtindex für dieselben Proben wie in d, 2 Wochen nach der dritten Dosis. Die Ergebnisse in b–d stammen aus zwei unabhängigen Experimenten; Die Anzahl der Mäuse in jeder Gruppe ist angegeben. f, Vergleich der De-novo-Flag+-Antikörperreaktionen bei WBB-Mäusen mit Mäusen, bei denen die erste Dosis und die Schicksalskartierung weggelassen wurden (ØBB). Die ØBB-Daten beziehen sich auf zehn Mäuse aus zwei unabhängigen Experimenten. Die WBB-Daten stammen von c und wurden im gleichen Assay wie ØBB erneut gemessen. g, Schematische Darstellung der Antikörperfraktionierung für den Neutralisationstest. h, BA.1 NT50-Titer für WBB-Mäuse zum gleichen Zeitpunkt wie in d. Die NT50-Werte nach der Erschöpfung wurden wie in den Methoden beschrieben normalisiert. P-Werte wurden mithilfe einseitiger gepaarter t-Tests berechnet. i, Die Wirksamkeit der Anti-RBD BA.1 Strep+ (Flag-depleted) und Flag+ (Strep-depleted) Fraktionen. Rohe NT50-Werte für jede Fraktion wurden durch ihre jeweiligen RBD-ELISA-Titer dividiert. P-Werte wurden mithilfe zweiseitiger gepaarter t-Tests berechnet. j, WH1-RBD-Struktur (PDB: 6M0J) mit rot hervorgehobenen Aminosäureänderungen in BA.1. k, Tiefenmutations-Scanning-Analyse von Serumproben, die zwei Wochen nach der dritten Immunisierung von drei WBB-Mäusen erhalten wurden, wie in d. Antikörperbindungsstellen auf RBD sind entsprechend der Escape-Fraktion schattiert. Die Positionen, die von jeder Serumfraktion am stärksten angegriffen werden, sind angegeben (BA.1-spezifische Reste sind in Klammern angegeben).

Um festzustellen, ob die nach heterologer Auffrischung beobachtete verstärkte Neutralisierung von BA.1 (Abb. 4b) auf die Induktion neuer BA.1-spezifischer Antikörper in dieser Situation zurückzuführen ist, fraktionierten wir WBB-Serumproben, die zwei Wochen nach der dritten Immunisierung in Flag entnommen wurden -abgereicherte (Strep+, primär) und Strep-abgereicherte (Flag+, neue) Präparate (Abb. 4g und erweiterte Daten Abb. 5a) und ihre neutralisierende Wirksamkeit gegen WH1- und BA.1-Pseudoviren gemessen. Wie erwartet hatte der Abbau von Flag+-Antikörpern nur minimale Auswirkungen auf die WH1-Neutralisierung, wohingegen der Abbau von Strep+ zu einem viel größeren Rückgang führte (1,7-fach gegenüber 8,5-fach; erweiterte Daten, Abb. 5b, c). Im Gegensatz dazu führte die Entfernung neuer (Flag+)-Antikörper aus WBB-Seren zu einer stärkeren Verringerung der BA.1-Neutralisierung im Vergleich zur Entfernung primärer (Strep+)-Antikörper (4,9-fache gegenüber 1,9-fache Abnahme; Abb. 4h), obwohl Strep+-Antikörper banden eifriger gegenüber dem BA.1 RBD durch ELISA (Abb. 4d). Um die neutralisierende Wirksamkeit pro Einheit spezifischen Antikörpers abzuschätzen, haben wir den 50 %-Neutralisationstiter (NT50), der aus dem BA.1-Pseudovirus-Assay abgeleitet wurde, durch den Endpunktbindungstiter dividiert, der durch BA.1-RBD-spezifischen ELISA erhalten wurde. Bei einer Normalisierung der Reaktivität auf diese Weise war der neue (Flag+)-Antikörper im Durchschnitt 7,0-fach wirksamer bei der Neutralisierung von BA.1 als der Strep+-Antikörper, der von B-Zellklonen der Primärkohorte als Reaktion auf WH1 produziert wurde (Abb. 4i). Wie in Extended Data Abb. 5d berechnet, könnten etwa 80 % der überschüssigen BA.1-Neutralisierung durch WBB im Vergleich zu WWW-Proben auf die De-novo-Erzeugung von BA.1-spezifischen Antikörpern aus naiven Zellen und nicht auf sekundäre Affinitätsreifung oder Präferenz zurückzuführen sein Auswahl von Gedächtnis-B-Zellen der Primärkohorte. Somit werden die Antikörper, die nach der BA.1-Boostung der primären Sucht entgehen, optimiert, um den Variantenstamm zu neutralisieren.

Um schließlich mechanistische Erkenntnisse darüber zu gewinnen, wie Antigendrift zur Abschwächung der primären Sucht führt, führten wir ein tiefes Mutationsscannen durch, um die WH1- und BA.1-RBD-Epitope zu definieren, auf die Flag+- und Strep+-Antikörper in heterolog geboosterten Mäusen abzielen (Abb. 4j und erweitert). Daten Abb. 6). Dieser Ansatz ermöglichte es uns, die Epitope, auf die der primäre und der neue Antikörper in derselben Maus abzielen, getrennt zu bestimmen. Wir haben die Antikörper-Escape-Muster von vier Mäusen gegen BA.1 (sowohl Strep+- als auch Flag+-Antikörper) und WH1 RBD (nur Strep+-Antikörper) gemessen, von denen drei interpretierbare Dominanzspitzen zeigten (Extended Data Abb. 7). Bei diesen drei Mäusen gab es eine klare Trennung der Epitope, auf die primäre Strep+- und neue Flag+-Antikörper abzielen (Abb. 4k und Extended Data Abb. 7). Bei zwei Mäusen zielten Strep+-Antikörper auf Reste des „Klasse-3“-Epitops auf der Außenseite des RBD (Arg346, Arg357, Ile468), die erwartungsgemäß zwischen WH1 und BA.1 konserviert waren (Abb. 4j,k). ). Im Gegensatz dazu konzentrierten sich Flag+-Antikörper bei beiden Mäusen auf den BA.1-spezifischen Rest Arg493 (Gln493 in WH1), der sich oben auf dem RBD in der „Klasse 2“-Region der ACE2-Bindungsoberfläche befindet. Die dritte Maus zeigte eine analoge Trennung zwischen primären und neuen Antikörpern, die jedoch auf unterschiedliche Epitope abzielten. Während sich Strep+-Antikörper stark auf das konservierte Epitop der Klasse 1/2 konzentrierten, das Gly485/Phe486 enthält (oben auf dem RBD an der ACE2-Schnittstelle), banden Flag+-Antikörper hauptsächlich an ein Epitop, das den BA.1-spezifischen Lys440-Rest enthält ( Asn440 in WH1) auf der Seitenfläche des RBD distal zu Gly485/Phe486 (Klasse 3). Insbesondere wurde berichtet, dass sowohl N440K als auch Q493R dazu führen, dass sie der Neutralisierung durch verschiedene monoklonale Antikörper entgehen33,34,35. Somit folgten alle drei Mäuse einer Logik, bei der neue Antikörper, die durch heterologe Immunisierung hervorgerufen wurden, bevorzugt auf Epitope abzielten, die BA.1-spezifische Escape-Mutationen enthielten und die nicht mit Epitopen überlappten, die durch kreuzreaktive Primärantikörper gebunden waren. Wir kommen zu dem Schluss, dass die primäre Sucht durch ihre epitopspezifische Wirkung die De-novo-Erzeugung von Antikörpern gegen konservierte Epitope unterdrückt und gleichzeitig die Induktion neuer Antikörper ermöglicht, die speziell auf verschobene Epitope abzielen.

Zusammenfassend kommen wir auf der Grundlage unserer Erkenntnisse mithilfe des Κ-Tag-Systems zu zwei Hauptpunkten. Erstens ist die Unterdrückung von De-novo-Antikörperreaktionen durch bestehende Immunität, ein notwendiges Merkmal von OAS, wie wir es definieren, äußerst wirksam, wenn es bei einem Antigenabstand von Null gemessen wird. Diese Ergebnisse stützen das primäre Sucht-/OAS2-Modell (Abb. 2a), bei dem bestehende Reaktionen die Entstehung neuer Serumantikörper gegen dasselbe Antigen verhindern, im Vergleich zu einem sequentiellen Beitrags-/Dienstaltersmodell20, bei dem die Reaktionen der ersten Kohorte einfach aufgrund ihrer Etablierung größer sind zuerst und wurde daher häufiger geboostet. Zweitens schwächt sich die primäre Sucht deutlich ab, wenn der Antigenabstand zwischen den Priming- und Boosting-Stämmen zunimmt. Diese Beobachtung legt eine Erklärung dafür nahe, warum es so schwierig war, OAS experimentell auf konsistente Weise zu dokumentieren5 – traditionelle Messungen, die auf Unterschieden zwischen driftenden Antigenen beruhen, um Antikörper primären oder De-novo-Kohorten zuzuordnen, können diese Kohorten möglicherweise nur dann zuverlässig unterscheiden, wenn Der Antigenabstand ist zu groß, um eine eindeutige Erkennung einer primären Sucht zu ermöglichen. Ein typisches Beispiel dafür ist, dass unser Modell davon ausgeht, dass die primäre Abhängigkeit zwischen PR8 und FM1, den Influenzavirusstämmen, für die OAS ursprünglich beschrieben wurde1,19, relativ schwach ist (entspricht einer 3,8-fachen Unterdrückung der De-novo-Reaktion) und möglicherweise Ohne die Präzision, die das K-Tag-Modell bietet, ist es daher schwierig, sie zu ermitteln.

Unsere Daten stimmen mit Beobachtungen bei Menschen überein, die zeigen, dass nach einer saisonalen Grippeimpfung ein großer Teil der Serum-Antikörper-Klonotypen aus bereits bestehenden Pools zurückgerufen wird, obwohl diese Studien unabhängig davon blieben, ob impfstoffinduzierte Antikörper-Klonotypen aus De-novo-Reaktionen oder aus anderen resultierten Rückruf unerkannter Gedächtnis-B-Zellen17,36. Menschen sind trotz ihrer reichen Vorgeschichte mit Influenza-Antigen-Exposition in der Lage, erhebliche De-novo-Reaktionen in Recall-GCs auszulösen, während sie sich für die unmittelbare Plasmazellreaktion auf Gedächtnis-B-Zellen verlassen37. Wir gehen daher davon aus, dass die hier beschriebenen allgemeinen Mechanismen der primären Sucht zumindest im Allgemeinen auch für den Menschen gelten. Im SARS-CoV-2-Umfeld könnte die Unterdrückung vom OAS-Typ die kleinen und variablen Unterschiede in der bevorzugten Induktion der Omicron-Neutralisierung durch variantenspezifische oder bivalente Impfung im Vergleich zur homologen Impfung erklären38,39,40,41,42. Unsere Daten deuten darauf hin, dass möglicherweise eine zweite Dosis eines Omicron-haltigen Impfstoffs erforderlich ist, um das volle Ausmaß der De-novo-Antikörperinduktion durch Omicron-Boosting aufzudecken. In der Praxis kann jedoch die wiederholte Exposition der meisten Personen gegenüber WH1-Antigenen vor der Omicron-Boostung sowie die potenziell größere Neigung menschlicher GCs, den Eintritt reaktivierter Gedächtnis-B-Zellen zu ermöglichen37, zu einer stärkeren OAS-Typ-Unterdrückung von Omicron-spezifischen Antikörpern führen in realen Szenarien.

Mechanistisch gesehen deuten unsere Messungen bei einem Antigenabstand von Null auf eine funktionelle Kluft zwischen Recall-GCs und Serumreaktionen bei Mäusen hin – während erstere fast ausschließlich aus naiv abgeleiteten B-Zell-Klonen bestehen21,22,23, werden letztere von den Auswirkungen der primären Sucht dominiert. Eine mögliche Erklärung für diese Divergenz ist, dass die naiven B-Zellen, die zu sekundären GCs beitragen, nicht über eine ausreichende Affinität verfügen, um die GC als Plasmazellen zu verlassen oder Antikörper abzusondern, die durch direkten ELISA nachweisbar sind. Eine geringe Antigenbindung zwischen naiv abgeleiteten sekundären GC-B-Zellen wurde bereits von anderen berichtet22, was mit der letztgenannten Hypothese übereinstimmt. Da die Antigendrift sowohl beim Influenzavirus als auch bei SARS-CoV-2 in erster Linie durch Immunflucht vorangetrieben wird, sollte die Lockerung der OAS in heterologen Umgebungen neu rekrutierte B-Zell-Klone grundsätzlich auf driftende neutralisierende Epitope konzentrieren. Diese Ansicht wird durch die Ergebnisse unserer Neutralisierungs- und Epitopkartierungsexperimente gestützt. Darüber hinaus konzentrierten sich RBD-bindende Antikörper, die der primären Sucht entgangen waren, tendenziell auf neue Reste, die sich innerhalb von Epitopen befanden, die keine dominanten Ziele der kreuzreaktiven Reaktion der ersten Kohorte waren. Dieses Muster deutet auf eine durch Antikörper vermittelte Epitopmaskierung hin – wobei Serumantikörper, die entweder vor der Auffrischung vorhanden sind oder akut von aufgefrischten Gedächtnis-B-Zellen produziert werden, mit naiven B-Zellen um die Bindung an ein bestimmtes Epitop konkurrieren – als potenziellen Mechanismus für die primäre Sucht. Ähnliche Effekte wurden zuvor bei der Infusion monoklonaler Antikörper vor der Auslösung einer Immunantwort bei Mäusen und Menschen beobachtet und wirken sich voraussichtlich auf die Feinspezifität der Erinnerungsreaktionen aus43,44,45,46. Diese Ergebnisse deuten nicht nur darauf hin, dass die Unterdrückung von De-novo-Antikörperreaktionen durch primäre Sucht eher epitopspezifisch als antigenspezifisch ist (Epitopmaskierung statt Antigeneinfang47), sondern legen auch eine teleologische Erklärung dafür nahe, warum sie für Gedächtnis-B-Zellen von Vorteil sein könnte um den erneuten Eintritt sekundärer GCs zu vermeiden21,48, da die Konkurrenz durch Gedächtnis-B-Zellen die Fähigkeit naiver Zellen hemmen könnte, Antikörper zu erzeugen, die auf neue Epitope in Virus-Escape-Varianten zugeschnitten sind. In einem solchen Rahmen bestünde die Hauptaufgabe sekundärer GCs darin, die schlimmsten Auswirkungen von OAS zu umgehen.

WT C57BL/6J- und B6.C(Cg)-Cd79atm1(cre)Reth/EhobJ-Mäuse (Cd79aCre/+, auch bekannt als Mb1-Cre49) wurden vom Jackson Laboratory erhalten. S1pr2-creERT2 BAC-transgene Mäuse25 waren ein Geschenk von T. Kurosaki und T. Okada. IgkTag-Mäuse wurden an der Rockefeller University erzeugt. Wir haben das Allel wie in Abb. 1a und den erweiterten Daten in Abb. 1 angegeben entworfen, mit einem Flag-Tag (DYKDDDDK) und einem Strep-II-Tag (WSHPQFEK), getrennt durch Stoppcodons und dem SV40-Poly-A-Transkriptionsterminator. Die einzelsträngige DNA-Matrize mit 522 Nukleotiden (einschließlich 5′- und 3′-Homologiearme, jeweils 100 Nukleotide lang) und die CRISPR-Guide-RNA (GGAGCTGGTGGTGGCGTCTC) wurden von IDT gekauft und gemäß der Easi-CRISPR-Gen-Targeting-Methode50 von IDT hergestellt Das Gene Targeting Resource Center der Rockefeller University wurde injiziert und in Zygoten injiziert, die von der Kerneinrichtung der Rockefeller University Transgenic Services aus C57BL/6-Mäusen gewonnen wurden. Wir haben durch Sanger-Sequenzierung über den gesamten Locus unter Verwendung genomischer Primer außerhalb der Homologiearme überprüft, ob das Allel korrekt eingefügt wurde. Um das Risiko potenzieller CRISPR-Off-Target-Effekte zu verringern, wurde eine Gründermaus vor der Verwendung in Experimenten für mindestens fünf Generationen auf C57BL/6J-Mäuse rückgekreuzt. Um IgkFlag/Strep-Mäuse zu erzeugen, wurden keimbahnexzidierte (Cre-negative Mäuse mit Strep+-B-Zelloberflächenfärbung) Mäuse, die durch gelegentliche spontane Keimbahnrekombination in Cd79aCre/+IgkTag-Züchtungen gewonnen wurden, mit dem IgkTag-Elternstamm gekreuzt. Alle Mäuse wurden in der Immunocore-Reinigungsanlage der Rockefeller-Universität unter spezifisch pathogenfreien Bedingungen gehalten. Alle Mausverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Rockefeller University genehmigt.

Immunantworten wurden bei Mäusen (männlich und weiblich im Alter von 7–12 Wochen) entweder durch subkutane Pfotenimmunisierung mit 10 µg TNP17-KLH (Biosearch, T-5060), ergänzt mit 1/3 Volumen Imject Alaun (Thermo Fisher Scientific), induziert ip-Immunisierung mit 50 µg TNP-KLH, hergestellt mit 1/3 Volumen Alaun oder Aluminiumhydroxidgel (Alhydrogel, Invivogen); 20 µg rekombinant hergestelltes trimerstabilisiertes HA (siehe unten) in Alhydrogel; intramuskuläre Immunisierung von Quadrizepsmuskeln mit 3 µg WH1 (Lit. 51) oder BA.1-Spike-mRNA, eingekapselt in Lipid-Nanopartikeln (mRNA-LNP), erzeugt wie unten beschrieben; oder durch intranasale Infektion mit dem mausadaptierten PR8-Influenzavirus, das in embryonierten Hühnereiern produziert wird (~33 Plaque-bildende Einheiten, bereitgestellt von M. Carroll). Bei S1pr2-IgkTag-Mäusen wurde die primäre Immunantwort durch orale Sondenernährung von 200 µl Tamoxifen (Sigma-Aldrich), gelöst in Maisöl zu 50 mg ml−1, an den Tagen 4 und 8 für das Durchflusszytometrie-Experiment am Tag 12 bestimmt ( Abb. 1), an den Tagen 4, 8 und 12 für alle anderen Immunisierungsexperimente und an den Tagen 4, 8, 12 und 16 für das Influenza-Infektionsexperiment (Abb. 3). In TNP-Recall-Experimenten (Abb. 2c) wurde die Auffrischimpfung zu den angegebenen Zeitpunkten identisch mit der Primärimmunisierung durchgeführt. Bei homologen mRNA-LNP-Experimenten (Abb. 2e) wurde das Boosten auf die gleiche Weise wie das Priming durchgeführt, mit der Ausnahme, dass bei einigen Mäusen der linke Quadrizepsmuskel geboostet wurde (kontralateral, geschichtet in Extended Data Abb. 3e). Bei heterologen mRNA-LNP-Recall-Experimenten (Abb. 4) erfolgte die Verstärkung in allen Fällen kontralateral. Für HA-Immunisierungsexperimente (Abb. 3) wurde eine homologe oder heterologe HA-Proteinverstärkung ipsilateral durchgeführt, genau wie bei der Primärimmunisierung. Für Infektionsexperimente wurden Mäuse nach 3 Monaten durch subkutane Immunisierung der Fußballen mit 5 µg HAPR8 oder HAFM1, zubereitet mit 1/3 Volumen Alhydrogel, geboostet, wie zuvor beschrieben21. In allen Fällen wurden weitere Auffrischimpfungen identisch mit der ersten Auffrischimpfung durchgeführt. Blutproben wurden durch Wangenpunktion in Mikroröhrchen gesammelt, die mit Gerinnungsaktivator-Serumgel (Sarstedt, 41.1378.005) vorbereitet waren.

Rekombinante HAs, die für Immunisierungen und ELISAs verwendet werden, wurden intern unter Verwendung des CHO-Zellproteinexpressionssystems hergestellt, wie zuvor beschrieben21. Cysteinreste wurden in die HA-Sequenz eingeführt, um trimerstabilisierende Disulfidbindungen zu erzeugen, wie ursprünglich für H1/A/California/07/2009 (Lit. 52) beschrieben. Wir haben die Produktion von HAPR8 und HACA09 bereits beschrieben21. Für HAFM1 und HANC99 wurde das gleiche Verfahren befolgt, einschließlich der Einführung trimerstabilisierender Mutationen. Für Immunisierungen wurden C-terminale Domänen, die nicht in HA vorkommen (Foldon, Avi-Tag, His-Tag), durch Thrombinspaltung entfernt und die HAs anschließend durch schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC) gereinigt, bevor sie in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gelagert wurden. . Für den ELISA wurden nicht mit Thrombin behandelte FPLC-gereinigte Proteine ​​verwendet. Ein hochaffiner IgY-spezifischer monoklonaler Antikörper, der aus CGG-immunisierten Mäusen (Klon 2.1 (Ref. 53)) gewonnen wurde, wurde für die Verwendung als Standard für den Flag/Strep-ELISA-Nachweis modifiziert. Die konstanten Regionen der schweren und leichten Kette in den ursprünglichen humanen monoklonalen Antikörperplasmiden54 wurden durch die konstanten Regionen IgG1 und Igκ der Maus ersetzt und der C-Terminus von Cκ wurde modifiziert, um eine LoxP-Stelle und einen Ser-Gly-Gly-Linker zu kodieren, gefolgt von entweder einem Flag oder Strep-Tag, was Cκ-Ketten ergab, die mit denen identisch waren, die von IgkTag-Mäusen vor bzw. nach der Rekombination produziert wurden. Die mAb-Flag- oder mAb-Strep-Leichtkettenplasmide wurden zusammen mit dem Schwerkettenplasmid in HEK293F-Zellen (Thermo Fisher Scientific, R79007) transfiziert und mithilfe der Protein-G-Affinitätschromatographie wie zuvor beschrieben53 gereinigt. Zelllinien wurden negativ auf Mykoplasmen getestet und konnten außer der Prüfung des von ihnen produzierten Proteins nicht authentifiziert werden. Um die Affinitätsreifung zwischen Flag+- und Strep+-Anti-TNP-Antikörpertitern zu vergleichen (Abb. 1h), wurden intern kundenspezifische Konjugationen mit Rinderserumalbumin (BSA) mit niedrigem und hohem Haptengehalt hergestellt. BSA (in PBS; Thermo Fisher Scientific, 77110) mit 2,5 mg ml−1 wurde mit TNP-ε-Aminocaproyl-OSu (Biosearch Technologies, T-1030) in PBS mit 20 % Dimethylsulfoxid in einem Molverhältnis von entweder 1: inkubiert. 2 oder 1:20 für 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Rotieren. Unkonjugiertes TNP-ε-Aminocaproyl-OSu wurde durch Dialyse in PBS entfernt. Die endgültigen TNP:BSA-Konjugationsverhältnisse wurden durch Messung der Absorption bei 280 und 348 nm auf ~1:1 und ~1:13 geschätzt. Diese Reagenzien werden als TNP1-BSA und TNP13-BSA bezeichnet. Die BSA-Konzentration wurde durch Bestimmung des Extinktionskoeffizienten für TNP-ε-Aminocaproyl-OSu bei 280 nm korrigiert. Mit Ausnahme von Abb. 1h wurde für alle anderen TNP-ELISAs (unten beschrieben) kommerzielles TNP4-BSA (Biosearch Technologies, T-5050) verwendet.

Der WH1-S-mRNA-Impfstoff wurde auf der Grundlage der SARS-CoV-2-S-Proteinsequenz (Wuhan-Hu-1, GenBank: MN908947.3) entwickelt, wobei die Lysin- und Valin-Aminosäuren in den Positionen 986–987 zu Prolinresten modifiziert wurden um ein präfusionsstabilisiertes mRNA-kodiertes Immunogen zu erhalten. Die Aminosäuresequenz von BA.1 S wurde aus dem WH1 S durch Einführung BA.1-spezifischer Modifikationen erhalten. Kodierungssequenzen von WH1 und BA.1 S wurden wie zuvor beschrieben codonoptimiert, synthetisiert und in ein mRNA-Produktionsplasmid (GenScript) kloniert55. Die mRNA-Produktion und die LNP-Einkapselung wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt55. Kurz gesagt, mRNAs wurden so transkribiert, dass sie 101 Nukleotide lange Poly(A)-Schwänze enthielten. m1Ψ-5′-triphosphat (TriLink) anstelle von UTP wurde verwendet, um modifizierte nukleosidhaltige mRNAs zu erzeugen. Das Capping der in vitro transkribierten mRNAs wurde co-transkriptionell unter Verwendung des Trinukleotid-Cap1-Analogs CleanCap (TriLink) durchgeführt. mRNA wurde durch Zellulosereinigung (Sigma-Aldrich) gereinigt, wie zuvor beschrieben56. Alle mRNAs wurden durch Agarosegelelektrophorese analysiert und gefroren bei –20 ° C gelagert. Cellulosegereinigte m1Ψ-haltige RNAs wurden in LNPs unter Verwendung eines Selbstorganisationsprozesses wie zuvor beschrieben eingekapselt, wobei eine ethanolische Lipidmischung aus ionisierbarem kationischem Lipid, Phosphatidylcholin, Cholesterin und Polyethylenglykol-Lipid schnell mit einer wässrigen Lösung gemischt wurde, die mRNA im sauren Bereich enthielt pH57. Das ionisierbare kationische Lipid und die LNP-Zusammensetzung sind in der Patentanmeldung WO 2017/004143 beschrieben. Die RNA-beladenen Partikel wurden charakterisiert und anschließend bei −80 °C in einer Konzentration von 1 μg μl−1 gelagert. Der mittlere hydrodynamische Durchmesser dieser mRNA-LNPs betrug etwa 80 nm mit einem Polydispersitätsindex von 0,02–0,06 und einer Verkapselungseffizienz von etwa 95 %.

Für die durchflusszytometrische Analyse peripherer B-Zellen wurde Blut in Mikroröhrchen mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) gesammelt, um eine Koagulation zu verhindern, und mit Ammonium-Chlorid-Kalium-Puffer (ACK) (Lonza) behandelt, um rote Blutkörperchen zu lysieren. Für Lymphknotenproben wurden Zellsuspensionen durch mechanische Dissoziation mit Einweg-Mikrostößeln (Axygen) erhalten. Die Milzen wurden durch Filtrieren durch ein 70-μm-Zellsieb homogenisiert und mit ACK-Puffer behandelt. Knochenmarkszellen wurden durch 10-sekündige Zentrifugation punktierter Schien- und Oberschenkelknochen bei bis zu 10.000 g extrahiert und anschließend mit ACK-Puffer behandelt. Zellen aus jedem Gewebe wurden in PBS, ergänzt mit 0,5 % BSA und 1 mM EDTA, resuspendiert und zunächst mit FC-Block (Ratten-Anti-Maus-CD16/32, 2,4G2, Bio X Cell) 30 Minuten lang auf Eis und anschließend mit verschiedenen Fluoreszenzmitteln inkubiert markierte Antikörper (Ergänzungstabelle 1) für 30 Minuten. Die Zellen wurden filtriert und mit demselben Puffer gewaschen, bevor sie auf einem BD FACS Symphony-Zytometer analysiert wurden. Die Daten wurden mit FlowJo (v.10) analysiert.

Um das Vorhandensein von Epitop-markierten Antikörpern in IgkTag-Mäusen zu bestimmen, wurden Serumproben von erwachsenen Steady-State-Mäusen und Präzisions-Plus-Zweifarben-Proteinstandards (Bio-Rad) in dreifacher Ausfertigung auf SDS-PAGE-Mini-Protean-TGX-Proteingelen (Bio-Rad) laufen gelassen. Rad) unter denaturierenden Bedingungen, um schwere und leichte Antikörperketten zu trennen. Die Proben wurden mit dem Iblot-Geltransfersystem (Invitrogen) auf eine Polyvinylidendifluoridmembran übertragen. Die Membranen wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln mit 5 % fettfreier Trockenmilch in PBS-Tween-20 (0,05 %) blockiert, bevor sie über Nacht im gleichen Puffer mit 1:2.000 Anti-Flag-HRP (D6W5B, Cell Signaling Technology, 86861S) oder Anti-Strep (Strep-tag II StrepMAB-Classic, Bio-Rad, MCA2489P) oder Ziegen-Anti-Maus-Igκ-HRP (Southern Biotech, 1050-05). Die Membranen wurden ausgiebig mit PBS-Tween-20 gewaschen und anschließend mit Western-Blot-ECL-Substrat (Amersham) vor der Chemilumineszenzdetektion mit dem Azure c300-Gel-Imager (Azure Biosystems) inkubiert.

ELISAs wurden wie zuvor beschrieben21 durchgeführt, mit spezifischen Modifikationen, um einen direkten Flag/Strep-Vergleich zu ermöglichen. Flag/Strep-ELISAs wurden nebeneinander und mit internen Standards auf jeder 96-Well-Platte durchgeführt. Um antigenspezifische Serumantikörpertiter nachzuweisen, wurden die Platten über Nacht bei 4 °C mit Antigen in PBS beschichtet (10 µg ml−1 für TNP4-BSA, 2 µg ml−1 für hauskonjugiertes TNP1/13-BSA ( siehe oben) und 1 µg ml−1 für HAs und SARS-CoV-2-Spike- oder RBD-Proteine ​​(Sinobiological, 40592-V08H, 40592-V08H121, 40589-V08H26; WH1 S- und RBD-Proteine ​​waren ein Geschenk von P. Wilson) ). Für Flag/Strep-Standardkurven wurden die Vertiefungen mit 10 µg ml−1 gereinigtem IgY (Gallus Immunotech) beschichtet. Nach dem Waschen mit PBS-Tween (PBS + 0,05 % Tween-20, Sigma-Aldrich) wurden die Platten 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit 2,5 % BSA in PBS blockiert. Serumproben wurden 1:100 in PBS verdünnt und seriell in dreifachen Verdünnungen titriert. Maus-Anti-IgY-mAb-Flag oder mAb-Strep wurden ebenfalls seriell in dreifachen Verdünnungen titriert (Erweiterte Daten, Abb. 2d). Die Proben wurden 2 Stunden lang inkubiert und dann mit PBS-Tween gewaschen, bevor einer der folgenden HRP-Nachweisantikörper hinzugefügt wurde: Ziegen-Anti-Maus-IgG (Jackson Immunoresearch, 15-035-071), Ratten-Anti-Maus-Igκ (Abcam, ab99632), Ziege-Anti-Maus-IgM (Southern Biotech, 1020-05), Kaninchen-Anti-Flag-HRP (D6W5B) oder Maus-Anti-Strep (Strep-tag II StrepMAB-Classic) für 30–45 Minuten. Verdünnungen von Anti-Flag- und Anti-Strep-Antikörpern wurden so definiert, dass die durch Titration von Flag- und Strep-markierten monoklonalen Antikörpern erzeugten Kurven äquivalent waren (Erweiterte Daten, Abb. 2d). Nach dem Waschen mit PBS-Tween wurden die Proben mit 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin-Substrat (langsame kinetische Form, Sigma-Aldrich) inkubiert und die Reaktion mit 1 N HCl gestoppt. Die Absorption der optischen Dichte (OD) wurde bei 450 nm mit dem Plattenlesegerät accuSkan FC von Fisher Scientific gemessen. Um die Flag- und Strep-Endpunkttiter zu normalisieren, wurde die Serumtiterverdünnung berechnet, bei der jede Probe den OD-Schwellenwert ihres jeweiligen monoklonalen Antikörpers bei einer festen Konzentration von entweder 20 oder 6,67 ng µl−1 überschreitet. Die Titer wurden durch logarithmische Interpolation der Verdünnungen mit Messwerten unmittelbar über und unmittelbar unter der verwendeten monoklonalen Antikörper-OD58 berechnet.

Für Gesamtserum-IgG-ELISAs wurden die Platten mit Anti-Maus-IgG beschichtet. Standardkurven wurden mit unmarkiertem Maus-IgG (Southern Biotech, 0107-01) erstellt und der Nachweis erfolgte mit Anti-Maus-IgG-HRP (Southern Biotech). Um IgM aus den Serumproben zu entfernen, wurden Anti-Maus-IgM-Agarosekügelchen (Sigma-Aldrich, A4540) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Die Perlen wurden mit PBS gewaschen und die Proben wurden im Verhältnis 1:20 Probe zu Perlen über Nacht bei 4 °C unter Rotation inkubiert. Die an Kügelchen gebundene IgM-Fraktion wurde durch 3-minütige Zentrifugation bei 10.000 g entfernt und die ungebundene Überstandsfraktion wurde für nachfolgende ELISAs verwendet. Um die Effizienz der IgM-Depletion zu bestätigen, wurden die Gesamt-IgM-Spiegel wie oben für Gesamt-IgG beschrieben gemessen, mit Ziegen-Anti-Maus-IgM, unmarkiertem IgM und Anti-Maus-IgM-HRP (Southern Biotech).

Die Virusneutralisierungstiter wurden in den Flag+- und Strep+-Serumfraktionen von Proben ermittelt, die von S-mRNA-LNP-immunisierten S1pr2-IgkTag-Mäusen entnommen wurden. Zur Trennung der Fraktionen wurde eine Immunpräzipitation mit Anti-Flag M2-Magnetkügelchen (Sigma-Aldrich, M8823-5ML) und MagStrep Typ 3 XT-Kügelchen (IBA, 2-4090-010) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt: Magnetkügelchen wurden mit Probenpuffer (Tris-gepufferte Salzlösung für Flag-Kügelchen und 1x Puffer W (IBA, 2-1003-100) für MagStrep-Kügelchen) gewaschen und die Proben im Verhältnis 20:1 Probe inkubiert um Harz über Nacht bei 4 °C unter Rotation zu perlen. Perlengebundene Fraktionen wurden mit einem Magnetabscheider abgetrennt und verworfen, während die ungebundene Fraktion gesammelt wurde. Fraktionierte Proben wurden durch Zentrifugation auf die Hälfte der Eingangskonzentration konzentriert und hitzeinaktiviert. Der Grad, in dem die gesamten und fraktionierten Serumproben WH1 und BA.1 SARS-CoV-2 neutralisierten, wurde mithilfe des zuvor beschriebenen NanoLuc-Luciferase-Reporter-Assays mit SARS-CoV-2-Spike-Pseudotypisierung auf HIV-1 angenähert29. Kurz gesagt, Serumproben wurden fünffach seriell mit einer Endverdünnung von 1:00 Serum verdünnt und 1 Stunde lang bei 37 °C mit dem pseudotypisierten HIV-1-Reportervirus SARS-CoV-2 WH1 oder BA.1 Spike inkubiert auf HT1080/ACE2.cl14-Zellen übertragen59. Nach 48 Stunden wurden die Zellen gewaschen und lysiert und die Luciferase-Aktivität wurde mit dem Nano-Glo Luciferase Assay System (Promega) und dem Glomax Navigator Luminometer (Promega) gemessen. Die relativen Lumineszenzeinheiten wurden unter Verwendung von in Abwesenheit von Serum infizierten Zellen normalisiert und dann in GraphPad Prism aufgetragen. Die NT50-Werte wurden mithilfe einer nichtlinearen Vier-Parameter-Regression (Regressionsmethode der kleinsten Quadrate ohne Gewichtung) der in den erweiterten Daten in Abb. 5b gezeigten Kurven berechnet. Dargestellt ist der Mittelwert zweier technischer Duplikate, Ausreißerpunkte wurden ausgeschlossen. Für NT50-Vergleiche zwischen der Eingabe und den Fraktionen (Abb. 4g und erweiterte Daten, Abb. 5c) wurde die NT50 der fraktionierten Proben angepasst, um den BA.1 RBD ELISA-Titer des nicht abgereicherten Tags im Vergleich zu seinem entsprechenden ELISA-Titer in der Eingabe auszugleichen Fraktion.

Im Hintergrund des SARS-CoV-2 Omicron BA.1 Spike RBD wurden doppelte Einzelmutanten-Site-Saturation-Variantenbibliotheken entworfen und von Twist Bioscience produziert, im Wesentlichen das Gleiche, was zuvor für andere SARS-CoV-2-Varianten gemacht wurde60, 61. Die GenBank-Karte des Plasmids, das das nicht mutierte Omicron BA.1 RBD im Hefe-Display-Vektor kodiert, ist auf GitHub verfügbar (https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_DMS_Omicron/blob/main/data/3294_pETcon -SARS2-RBD_Omicron-BA1.gb). Die Site-Saturation-Variantenbibliotheken wurden von Twist Bioscience als doppelsträngige DNA-Fragmente geliefert, mit einem Barcode versehen und in großen Mengen in das Rückgrat des Hefe-Display-Vektors kloniert. Die barcodierte Plasmid-DNA der Mutantenbibliothek wurde in Escherichia coli (NEB 10-beta elektrokompetente Zellen, New England BioLabs, C3020K) elektroporiert und auf etwa 1 × 105 KBE beschränkt (durchschnittlich >25 Barcodes pro einzelne Mutante). Plasmid-DNA wurde gereinigt und in den Hefestamm AWY101 transformiert. Sechzehn-Nukleotid-Barcodes wurden durch PacBio-Sequenzierung mit ihren BA.1-Varianten verknüpft und die Auswirkungen von Mutationen der RBD-Expression und der ACE2-Bindung wurden gemessen, im Wesentlichen wie beschrieben61. Diese Experimente werden auf GitHub (https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_DMS_Omicron) beschrieben und analysiert.

Experimente zur Kartierung von Mutationen, die die RBD-Bindung von Seren immunisierter Mäuse reduzieren, wurden in biologischen Duplikaten mit unabhängigen mutierten WH1- oder BA.1-RBD-Bibliotheken durchgeführt, ähnlich wie zuvor für monoklonale Antikörper62 und menschliche polyklonale Plasmaproben63 beschrieben. Zunächst wurden 75 µl jedes Serums durch Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C mit 37,5 OD-Einheiten AWY101-Hefe, die einen leeren Vektor enthielten, wie zuvor beschrieben, zweimal von unspezifischen hefebindenden Antikörpern befreit63 . WH1- und BA.1-mutierte RBD-Hefebibliotheken61 wurden mit galactosehaltigem, synthetischem, definiertem Medium mit niedrigem Dextrosegehalt und Casaminosäuren (SD-CAA, 6,7 g l-1 Hefestickstoffbase, 5,0 g l-1 Casaminosäuren, 1,065 g l-1 MES) induziert Säure und 2 % (Gew./Vol.) Galaktose + 0,1 % (Gew./Vol.) Dextrose), um RBD auszudrücken, dann gewaschen und mit verdünntem Serum 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubiert. Jede getestete Kombination von Mausserum gegen jede WH1- oder BA.1-RBD-Mutantenbibliothek auf Verlust der Bindung von Strep- oder Flag-Tag-Antikörpern wurde unabhängig durchgeführt. Für jedes Serum wurde eine untersättigende Verdünnung verwendet, so dass die Menge des Fluoreszenzsignals aufgrund der Bindung von Serumantikörpern an RBD in allen Proben ungefähr gleich war (1:1.000 für die Kartierung von Strep-Antikörpern gegen die WH1-Bibliotheken; 1:200 für die Kartierung von Strep-Antikörpern). gegen die BA.1-Bibliotheken und 1:50 für die Kartierung der Flag-Antikörper gegen die BA.1-Bibliotheken). Die Hefebibliotheken wurden dann 1 Stunde lang sekundär mit 1:100 FITC-konjugierten Anti-MYC-Antikörpern (Immunology Consultants Lab, CYMC-45F) markiert, um die RBD-Expression zu markieren, und entweder 1:200 APC-konjugiertem Streptavidin (Invitrogen S-868). zur Markierung gebundener Strep-Antikörper oder APC-konjugierter Ratten-Anti-Flag (BioLegend, 637308) zur Markierung gebundener Flag-markierter Antikörper. Ein Durchflusszytometrie-Selektionstor wurde erstellt, um RBD-Mutanten mit reduzierter Antikörperbindung für ihren Grad der RBD-Expression zu erfassen. Für jede Probe wurden etwa 4 × 106 Zellen auf dem Zellsortierer BD FACSAria II verarbeitet. Aus dem Serum entwichene Zellen wurden über Nacht in SD-CAA wie oben definiert mit 2 % (Gew./Vol.) Dextrose, ohne Galaktose und 100 U ml-1 Penicillin + 100 µg ml-1 Streptomycin gezüchtet, um die Zellen vor der Plasmidextraktion zu vermehren.

Plasmid-DNA wurde aus 30 OD-Einheiten (1,6 × 108 koloniebildende Einheiten (KBE)) von Vorselektionshefepopulationen und etwa 5 OD-Einheiten (ca. 3,2 × 107 KBE) von Übernachtkulturen von aus dem Serum entwichenen Zellen (Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep II) extrahiert ) wie zuvor beschrieben60,62. Die 16-Nukleotid-Barcodes, die jede WH1- oder BA.1-RBD-Variante identifizieren, wurden durch Polymerasekettenreaktion amplifiziert und wie zuvor beschrieben für die Illumina-Sequenzierung vorbereitet60,62. Barcodes wurden auf dem Illumina NextSeq 2000-System mit 50-bp-Single-End-Lesevorgängen sequenziert.

Escape-Fraktionen wurden im Wesentlichen wie zuvor beschrieben62 berechnet. Wir haben das dms_variants-Paket (https://jbloomlab.github.io/dms_variants/, v.1.4.0) verwendet, um jede barcodierte RBD-Variante in jeder Vorauswahl- und Serum-Escape-Population zu zählen. Für jede Auswahl haben wir den Escape-Anteil für jede Barcode-Variante anhand der in Ref. angegebenen Formel berechnet. 62. Diese Escape-Fraktionen stellen den geschätzten Anteil der Zellen dar, die diese spezifische Variante exprimieren, die in den Escape-Behälter fällt, sodass ein Wert von 0 bedeutet, dass die Variante immer durch Serum gebunden wird und ein Wert von 1 bedeutet, dass sie immer der Serumbindung entgeht. Anschließend haben wir einen rechnerischen Filter angewendet, um Varianten mit >1 Aminosäuremutation, niedrigen Sequenzierungszahlen (<50 in der Vorselektionsbedingung) oder äußerst schädlichen Mutationen zu entfernen, die allein dadurch, dass sie zu einer schlechten Expression von ordnungsgemäß gefaltetem RBD auf der Hefe führen, zum Entweichen von Antikörpern führen könnten Zelloberfläche (ein ACE2-Bindungsscore von <–2 oder ein RBD-Expressionsscore von <–1,25 bzw. <–0,83361 für die WH1- und BA.1-Mutantenbibliotheken, was die unterschiedlichen Ausgangsexpressionsniveaus der beiden Wildtyp-RBDs widerspiegelt) . Die im gesamten Artikel gemeldeten Antikörper-Escape-Scores sind der Durchschnitt aller Duplikatbibliotheken; Diese Werte sind auch in der Ergänzungstabelle 1 enthalten. Die Korrelationen der endgültigen Einzelmutanten-Fluchtwerte sind in den erweiterten Daten in Abb. 6c dargestellt. Die vollständige Dokumentation der rechnerischen Analyse ist auf GitHub verfügbar (https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_OAS).

Das Serum-Escape-Kartenlogo und die Liniendiagramme wurden mit dem dmslogo-Paket (https://jbloomlab.github.io/dmslogo, v.0.6.2) erstellt. Die Höhe jedes Buchstabens gibt die Escape-Fraktion für diese Aminosäuremutation an. Für jedes Serum zeigen die Logo-Diagramme jede Stelle, an der für ≥1 Bibliotheks-/Antikörper-Tag-Bedingung die Gesamtantikörperaustrittsrate an der Stelle >10-mal so hoch war wie der Median aller Standorte und mindestens 10 % des Maximums aller Standorte. Für jede Probe wurde die y-Achse so skaliert, dass sie dem größten von (1) der maximalen ortsbezogenen Escape-Metrik entspricht, die für diese Probe beobachtet wurde, oder (2) dem 20-fachen des mittleren ortsbezogenen Escape-Anteils, der an allen Standorten für dieses Plasma beobachtet wurde. Der Code, der diese Logo-Plot-Visualisierungen generiert, ist auf GitHub verfügbar (https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_OAS/blob/main/results/summary/escape_profiles.md). Um das Entweichen von Serum auf der RBD-Struktur zu visualisieren, wurde die WH1-RBD-Oberfläche (PDB: 6M0J) an jeder Stelle anhand der ortsbezogenen Entweichungsmetrik eingefärbt, wobei Weiß kein Entweichen anzeigt und Rot die Stelle mit dem meisten Entweichen anzeigt.

Statistische Tests, die zum Vergleich der Bedingungen verwendet werden, sind in den Legenden der Abbildungen angegeben. Zur Bestimmung der Stichprobengröße wurden keine statistischen Methoden verwendet. Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism v.9 durchgeführt. Die Durchflusszytometrieanalyse wurde mit FlowJo (v.10) durchgeführt. Die Diagramme wurden mit Prism (v.9) gezeichnet und mit Adobe Illustrator CS optisch bearbeitet. Für Daten, die auf logarithmischen Skalen aufgetragen wurden (z. B. Serumantikörpertiter), wurde eine statistische Analyse der logarithmisch transformierten Daten durchgeführt. Proben mit Reaktivitäten unterhalb der Nachweisgrenze erhielten den Wert 100, da die oberste Verdünnung 1:100 betrug.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die rohen Illumina-Lesewerte der 16-Nukleotid-Varianten-Barcodes aus den Deep-Mutational-Scanning-Experimenten sind beim NCBI SRA unter BioProject PRJNA770094, BioSample SAMN30086726 verfügbar. Alle Escape-Scores sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt und auf GitHub verfügbar (https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_OAS/blob/main/results/supp_data/all_raw_data.csv). Darstellungen der Spike-RBD- und HA-Strukturen wurden vom PDB unter den Zugangscodes 6M0J, 1RU7 und 3LZG erhalten.

Der vollständige Code zur Analyse der Deep-Mutational-Scanning-Experimente ist auf GitHub verfügbar (https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_OAS). Der Code zum Generieren der Logo-Plot-Visualisierungen ist auf GitHub verfügbar (https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_OAS/blob/main/results/summary/escape_profiles.md).

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Wir danken den Mitarbeitern der Transgenics and Gene Targeting-Einrichtungen der Rockefeller University für die Erzeugung des K-Tag-Mausstamms und des Comparative Biosciences Center für die Unterbringung von Mäusen. P. Wilson für rekombinantes SARS-CoV-2 WH1-Spike- und RBD-Protein; JT Jacobsen für technische Unterstützung; und allen Mitarbeitern der Rockefeller University für ihre kontinuierliche Unterstützung. Diese Studie wurde durch die NIH/NIAID-Zuschüsse R01AI119006 und R01AI139117 an GDV, P01AI165075 an PDB, R01AI146101 und R01AI153064 an NP und R01AI141707 an JDB finanziert. Die Arbeit im Victora-Labor wird zusätzlich durch den NIH-Zuschuss DP1AI144248 (Pioneer Award) und den Robert unterstützt Sohn Stiftung. AS wurde durch ein Doktorandenstipendium des Boehringer-Ingelheim Fonds unterstützt. PDB und JDB sind HHMI-Ermittler. GDV ist ein Burroughs-Wellcome-Forscher für die Pathogenese von Infektionskrankheiten, ein Pew-Stewart-Stipendiat und ein MacArthur Fellow.

Labor für Lymphozytendynamik, Rockefeller University, New York, NY, USA

Ariën Schiepers, Marije FL van 't Wout, Luka Mesin und Gabriel D. Victora

Abteilung für Grundlagenwissenschaften und Computational Biology Program, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA, USA

Allison J. Greaney, Tyler N. Starr und Jesse D. Bloom

Labor für Retrovirologie, Rockefeller University, New York, NY, USA

Trinity Zang & Paul D. Bieniasz

Abteilung für Mikrobiologie, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA

Hiromi Muramatsu und Norbert Pardi

Acuitas Therapeutics, Vancouver, British Columbia, Kanada

Paulo JC Lin & Ying K. Tam

Howard Hughes Medical Institute, Chevy Chase, MD, USA

Paul D. Bieniasz & Jesse D. Bloom

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AS und MFLv'tW führten alle experimentellen Arbeiten durch, mit wesentlichem Input von LMAJG, der die Deep-Mutational-Scanning-Experimente unter der Aufsicht von TNS und JDBNP durchführte und interpretierte, und HM entwarf und produzierte WH1- und BA.1-S-kodierende mRNAs. PJCL und YKT formulierten mRNAs zu LNP. TZ führte Pseudovirus-Neutralisationstests unter der Aufsicht von PDBAS durch und GDV entwarf das K-Tag-Allel und alle Experimente in der Studie und verfasste das Manuskript unter Mitwirkung aller Autoren.

Korrespondenz mit Gabriel D. Victora.

NP wird in einem Patent (62/153,143 – Nukleosid-modifizierte RNA, die eine adaptive Immunantwort induziert) genannt, das die Verwendung von Nukleosid-modifizierter mRNA in LNPs als Impfstoffplattform beschreibt. Er hat diese Interessen der University of Pennsylvania vollständig offengelegt und verfügt über einen genehmigten Plan zur Bewältigung potenzieller Konflikte, die sich aus der Lizenzierung dieses Patents ergeben. PJCL und YKT sind Mitarbeiter von Acuitas Therapeutics, einem Unternehmen, das sich mit der Entwicklung von mRNA-LNP-Therapeutika beschäftigt. YKT ist auf ein Patent (WO 2017/004143 – Lipide und Lipid-Nanopartikelformulierungen zur Abgabe von Nukleinsäuren) zurückzuführen, das LNPs für die Abgabe von Nukleinsäuretherapeutika, einschließlich mRNA, und die Verwendung modifizierter mRNA in Lipid-Nanopartikeln als Impfstoffplattform beschreibt . PDB hat für Pfizer Beratungstätigkeiten im Bereich COVID-Impfstoffe durchgeführt. JDB berät oder hat kürzlich Apriori Bio, Oncorus, Merck und Moderna zu Themen im Zusammenhang mit Viren, Impfstoffen und viraler Evolution beraten. JDB, TNS und AJG sind als Erfinder der von Fred Hutch lizenzierten Patente (62/935.954 und 62/692.398) im Zusammenhang mit dem viralen Deep-Mutational-Scanning aufgeführt. GDV und JDB sind Berater der Vaccine Company.

Nature dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Nukleotidsequenz der 522-bp-DNA-Matrize, die zur Erzeugung des IgkTag-Allels verwendet wurde, mit Aminosäureübersetzungen für alle kodierenden Sequenzen (Fettschrift). Für jede Zeile sind Nukleotidzahlen angegeben. Die Aminosäuretranslation befindet sich unterhalb des mittleren Nukleotids jedes Codons.

(a) Repräsentative Durchflusszytometriediagramme peripherer B-Zellen (gesteuert: B220+CD4–CD8–CD138–), die aus dem Blut von WT- und IgkTag/Tag-Mäusen gewonnen und auf Oberflächenexpression von Igλ- und FLAG-markierten Immunglobulinen gefärbt wurden. (b) Gesamt-IgG-Konzentration im Serum von WT, IgkTag/Tag und Cd79aCre/+. IgkTag/Tag-Mäuse, bestimmt durch ELISA. Die Unterschiede waren bei der einfaktoriellen ANOVA nicht signifikant (p < 0,05). (c) Durchflusszytometrie von Knochenmarksplasmazellen (PCs) im Steady-State, die aus erwachsenen (6 Wochen alten) IgkFLAG/Strep-Mäusen gewonnen wurden. Die Gating-Strategie für PCs ist im linken Feld dargestellt (vorab auf Nicht-CD4/CD8-T-Zellen aktiviert), für Oberflächen-IgA+- und Igλ–-PCs im mittleren Feld und für FLAG/Strep im rechten Feld. Die Quantifizierung an 9 Mäusen aus 3 unabhängigen Experimenten ist im Feld ganz rechts dargestellt (jeder Punkt stellt eine einzelne IgkFLAG/Strep-Maus dar, die Linie stellt den Median dar). (d) ELISA-Standardkurven mit monoklonalem Antikörper (mAb)-FLAG und mAb-Strep, nachgewiesen bei Verdünnungen der jeweiligen HRP-Antikörper, bei denen sich die Kurven überlappen. Die mAb-Konzentration, bei der die Kurven den Absorptionshintergrundschwellenwert kreuzten (angezeigt durch die gestrichelten Linien), wurde zur Berechnung des Endpunkttiters verwendet, wie im Abschnitt „Methoden“ beschrieben. (e) Tag-spezifische Anti-TNP-Titer in IgkFLAG/Strep-Mäusen, die zu den durch schwarze Pfeile angegebenen Zeitpunkten ip mit TNP-KLH/Alaun immunisiert und verstärkt wurden. Die Ergebnisse stammen von 14 Mäusen aus 2 unabhängigen Experimenten. Der Zeitpunkt von Tag 7 wurde für die erste Kohorte nicht erfasst. Dünne Linien stellen einzelne Mäuse dar, dicke Linien verbinden die Mediane der logarithmisch transformierten Titerwerte zu jedem Zeitpunkt. (f) Durchflusszytometrie von S1pr2-IgkWT/Tag-Mäusen wie in Abb. 1d, e. Bei der Quantifizierung in (g) sind Cre- und keine Tamoxifen-Kontrollgruppen enthalten. Die Datenpunkte stammen von 6–13 Kniekehlenlymphknoten pro Gruppe aus mindestens 2 unabhängigen Experimenten. (h) Anti-TNP-ELISA-Reaktivität für S1pr2-IgkTag/Tag-Mäuse, die wie in Abb. 1d immunisiert wurden. Serum wurde bei 47 dpi von 6 Mäusen erhalten, die Tamoxifen erhielten, und 4, die kein Tamoxifen erhielten. Dargestellt ist die ELISA-Absorption von IgG (links), FLAG (Mitte) und Streptokokken (rechts). Die Proben wurden 1:100 verdünnt.

(a) Durchflusszytometrie sekundärer GCs in der Milz von 3 TNP-KLH ip-primierten und geboosterten S1pr2-IgkTag/Tag-Mäusen mit Tamoxifen-Markierung bei 4, 8 und 12 dpi. Gated auf GC-B-Zellen (FAS+CD38–B220+CD4–CD8–CD138–), die FLAG oder Strep-Tag exprimieren, wie in Abb. 1e. (b) Gesamt-IgM-Konzentrationen von Serumproben vor und nach der IgM-Depletion mittels Immunpräzipitation, gemessen durch ELISA. Die Daten stammen von 8 Serumproben von denselben 4 Mäusen wie in Abb. 2c. (c) Tag-spezifische Anti-TNP-Titer vor und nach IgM-Depletion für Proben, die 6 Tage nach der ersten und zweiten Auffrischung mit TNP-KLH entnommen wurden (dieselben Proben wie in (b) und Abb. 2c). Die Balken stellen die Mittelwerte der logarithmisch transformierten Titer dar und die Fehlerbalken sind SEM. P-Werte gelten für zweiseitige, gepaarte T-Tests, es werden nur statistisch signifikante (p < 0,05) Werte angezeigt. (d) Hintergrund-Strep+-Anti-RBD-Titer in S1pr2-IgkTag/Tag-Kontrollmäusen, die wie in Abb. 2b, e immunisiert, aber nicht mit Tamoxifen behandelt wurden. Die Grafiken zeigen den mittleren Prozentsatz des Strep+-Anti-RBD-Titers ((S/(S + F)*100)) in Abwesenheit von Tamoxifen zum Zeitpunkt vor der Auffrischimpfung und zwei Wochen nach der zweiten und dritten Impfung. Dies stellt den mittleren Prozentsatz dar, um den FLAG+-Titer in Rückrufreaktionen wahrscheinlich durch spontane Rekombination durch den S1pr2-CreERT2-Treiber unterschätzt werden. Die Daten stammen von 8 Mäusen aus 2 unabhängigen Experimenten. (e) Vergleich der in Abb. 2e, f gezeigten primären Suchtdaten, geschichtet nach Kohorte und ipsilateralem versus kontralateralem Boost. Die 4. Kohorte von Mäusen ist die in Abb. 4b–e gezeigte homolog geboosterte Gruppe, hier dargestellt durch offene Kreise. Die Balken stellen den Mittelwert der logarithmisch transformierten Titer dar, die Fehlerbalken sind SEM. Die Daten stammen von 16 Mäusen aus 4 unabhängigen Kohorten. (f) Vergleich der primären Sucht zwischen der 3. und 4. Reaktion bei 9 Mäusen aus 2 Kohorten, basierend auf Daten aus Abb. 2e, f, h. Die Balken stellen den Mittelwert der logarithmisch transformierten Titer dar, die Fehlerbalken sind SEM.

(a) Vergleich der De-novo-FLAG+-Antikörperreaktionen auf HAFM1 in Gegenwart oder Abwesenheit einer Primärinfektion mit dem Influenzavirus PR8. PR8>FM1>FM1-Daten beziehen sich auf dieselben Proben wie in Abb. 3d, erneut gemessen im gleichen Assay wie Ø>FM1>FM1. (b) Schematische Darstellung der HA-Prime-Boost-Strategie. S1pr2-IgkTag/Tag-Mäuse wurden ip mit HANY95 in Alhydrogel geprimt und wie angegeben homolog oder heterolog mit HAN99 oder HACA09 in Alhydrogel geboostet. (c) Vollzeitverlauf der Anti-HA-Tag-spezifischen ELISA-Reaktivität (optische Dichte bei 1:100-Verdünnung) derselben Mäuse, dargestellt in Abb. 3f. Dargestellt sind Anti-HANY95- (oben), HANC99- (Mitte) und HACA09-ELISAs (unten) mit Strep- (links) und FLAG- (rechts) Erkennung. (d) Zusammenhang zwischen primärer Sucht und Antigendistanz für Infektions- und Immunisierungsexperimente. Die Grafik stellt die primären Suchtindizes aus Abb. 3d und 3g zusammen. Die Balken sind nach der Aminosäureidentität zwischen den vorbereitenden und verstärkenden HAs geordnet. P-Werte gelten für eine einfaktorielle ANOVA mit % Identität als kategoriale Variable oder für Pearson-Korrelation mit (100 – % Identität) als linearer Variable.

(a) Effizienz der Serumfraktionierung in FLAG- und Streptokokken-abgereicherte Fraktionen, gemessen durch Anti-RBD-ELISA von Input- und Post-Depletion-Proben. Zwei Wochen nach der 3. Immunisierung wurde Serum von heterolog immunisierten Mäusen gewonnen, Abb. 4d (8 Mäuse aus 2 unabhängigen Experimenten). (b) Neutralisierung des SARS-CoV-2 S-exprimierenden pseudotypisierten HIV-1-Virus WH1 (links) und BA.1 (rechts) durch die in (a) gezeigten Serumfraktionen. Es werden Mittelwerte technischer Duplikate angezeigt. (c) WH1-S-Pseudovirus-NT50-Titer für Proben in (b). Post-Depletion-NT50-Werte wurden auf Basis der BA.1-RBD-ELISA-Titer (a) auf das Eingangsserum normalisiert, indem eine Korrektur angewendet wurde, die den Anti-RBD-Streptokokken-Titer der FLAG-abgereicherten Fraktion an den Eingangsserum und den Anti-RBD-FLAG angleichte -Titer der Streptokokken-abgereicherten Fraktion zur Eingabe. P-Werte gelten für den einseitigen gepaarten T-Test. FC, Fold-Change. (d) Abschätzung des Beitrags von De-novo-Antikörpern im Vergleich zu aus dem Gedächtnis stammenden Antikörpern zur übermäßigen BA.1-Neutralisierung durch das WBB-Regime. Der Beitrag der sekundären Affinitätsreifung oder der bevorzugten Selektion kreuzreaktiver Gedächtnis-B-Zellen durch BA.1-Boosting, ΔS, wird als Differenz zwischen Strep+-WBB und den gesamten WWW-BA.1-Neutralisationstitern berechnet (bei letzteren wird davon ausgegangen, dass sie alle FLAG+ sind). Der Beitrag von BA.1-spezifischen Antikörpern, die de novo durch BA.1-Boosting induziert werden, F, wird als FLAG+ WBB-Titer angegeben. Der prozentuale Beitrag von F zur verbesserten BA.1-Neutralisierung im WBB wird als (F/(F + ΔS))*100 berechnet. Balken und gepunktete Linien stellen die Mediane für jede Bedingung dar, die zur Berechnung von F und ΔS verwendet wurden. Die obere gepunktete Linie (4.) stellt die mittlere Neutralisierung der gesamten WBB-Antikörper dar und dient nur zu Referenzzwecken. Die Daten der Gruppen 1 und 4 sind aus Abb. 4b wiedergegeben, die Daten der Gruppen 2 und 3 aus Abb. 4h.

(a) Oben: Repräsentative Diagramme der verschachtelten FACS-Gating-Strategie, die für alle Experimente zur Auswahl einzelner Hefezellen verwendet wurde. Unten: Gating-Strategie zur Auswahl RBD-exprimierender Einzelzellen (FITC-A vs. FSC-A). (b) FACS-Gating-Strategie für eine von zwei unabhängigen Bibliotheken zur Auswahl von Zellen, die BA.1- oder WH1-RBD-Mutanten mit reduzierter Strep- oder FLAG-Antikörperbindung (Zellen in Blau) exprimieren, gemessen durch Sekundärfärbung mit APC-konjugiertem Streptavidin oder APC-konjugiertem Anti-FLAG-Antikörper. Für jede Probe wurden manuell Gates festgelegt, um Zellen zu erfassen, die für ihren Grad der RBD-Expression eine verringerte Menge an markierter Antikörperbindung aufweisen. Die FACS-Streudiagramme der beiden Bibliotheken waren qualitativ ähnlich. Der Mausidentifikator (Nr. 1–4), die DMS-Zielbibliothek (WH1 oder BA.1) und der Antikörper-Tag (Strep oder FLAG) sind über jedem Diagramm angegeben. (c) Korrelationen der Escape-Scores auf Mutations- (links) und Standortebene (rechts) zwischen zwei unabhängigen biologischen Replikatbibliotheken.

Ergebnisse des Deep Mutational Scanning von Serum, das 2 Wochen nach der 3. Dosis von 4 heterolog immunisierten Mäusen gesammelt wurde (Abb. 4d). Für jede Mutation wurde der „Fluchtanteil“ gemessen, der von 0 (keine Auswirkung der Zellen auf die Antikörperbindung) bis 1 (alle Zellen mit der Mutation haben eine verringerte Antikörperbindung) reicht. Maus 4 wird im Haupttext nicht gezeigt, da es für keine der Antikörperfraktionen interpretierbare Peaks bei der Antikörperbindung an BA.1-Bibliotheken gab. Logo-Plots zeigen die Antikörper-Escape-Fraktionen für einzelne Aminosäuremutationen an wichtigen Stellen mit starkem Escape-Anteil. Standorte, bei denen BA.1 von der WH1-Sequenz abweicht, werden in violetter Schrift angezeigt. Alle Escape-Scores sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt und online verfügbar unter https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_OAS/blob/main/results/supp_data/all_raw_data.csv.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schiepers, A., van 't Wout, MFL, Greaney, AJ et al. Molekulare Schicksalskartierung von Serumantikörperreaktionen auf wiederholte Immunisierung. Natur 615, 482–489 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05715-3

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Eingegangen: 29. August 2022

Angenommen: 06. Januar 2023

Veröffentlicht: 16. Januar 2023

Ausgabedatum: 16. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05715-3

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